Name: Generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Scopri come isolare cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e differenziarle nel lignaggio muscolare scheletrico. Questo protocollo garantisce alta vitalità cellulare e minima contaminazione endoteliare.

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Ringraziamo il signor Ojas Tikoo per il loro aiuto con le riprese e la produzione video. Riconosciamo anche l'aiuto ricevuto dal personale GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), infermieri e funzionari di ricerca senior presso il Gurugram Civil Hospital e il Dr. Pallavi Kshetrapal per l'aiuto con la logistica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni concesse a Suchitra Gopinath dal Dipartimento di Biotecnologie, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

L'uso del tessuto del cordone ombelicale in questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la ricerca sulle cellule staminali (IC-SCR), dal Comitato etico istituzionale, dall'Istituto di scienza e tecnologia della salute traslazionale (IEC-THSTI), dal Comitato etico istituzionale dell'ospedale civile, Gurugram, Haryana e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza, THSTI. Campioni di tessuto cordonale umano sono stati raccolti da parti a termine al momento della nascita. Il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti.
1. Isolamento delle MSC dal tessuto del cordone ombelicale
<ol><li>Al momento della consegna, tagliare almeno 5 cm di corda, preferibilmente più vicino alla placenta, e sterilizzare la corda tamponando la superficie esterna con il 70% di etanolo. Trasferire il pezzo di tessuto cordonale in sequenza da un tubo di raccolta da 50 ml contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a un altro contenente lo stesso. Trasportare il tubo di raccolta recante il nome del soggetto su ghiaccio al laboratorio entro 1 ora. NOTA: per uno studio più ampio, potrebbe essere utile codificare a barre i campioni per consentire il loro monitoraggio durante lo studio. È importante sottolineare che a tutto il personale che gestisce tessuti umani dovrebbe essere offerto il regime completo del vaccino contro l'epatite B.</li>
	<li>In laboratorio, accendere l'UV per 25 minuti nella cappa BSL-2 per sterilizzare strumenti e pipette autoclavati prima dell'uso.</li>
	<li>Trasferire il pezzo di tessuto cordonale dal tubo di raccolta a un piatto da 10 cm2 trattati con coltura tissutale contenente PBS arricchito con 5 g/L di glucosio, 50 μg/mL di gentamicina, 2,5 μg/mL di amfotericina B, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (schematico nella Figura 1).</li>
	<li>Usando un bisturi, affettare il tessuto del cordone verticalmente lungo il suo asse longitudinale per ottenere due pezzi semicilindrici. A causa della torsione del cavo e della superficie mucoide, fissare il tessuto con un paio di pinze tenute nell'altra mano.</li>
	<li>A questo punto, osservare le arterie ombelicali e la vena e rimuovere i vasi sanguigni utilizzando un bisturi per raschiarli via in una direzione dalla superficie. Risciacquare nuovamente il tessuto cordonale in PBS per rimuovere tutto il sangue residuo associato al tessuto. Assicurarsi che la raschiatura sia delicata per preservare l'integrità delle cellule nel WJ che circonda i vasi.</li>
	<li>Tritare ogni metà del tessuto cordonale in frammenti di dimensioni 0,5 cm3 e posizionare i frammenti con la superficie luminale rivolta verso il basso sul piatto. Incubare brevemente il piatto per 10 minuti in una camera umidificata a 37 °C contenente il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, inondare il piatto contenente i pezzi di tessuto cordonale con 20 ml di mezzo contenente MEM Alpha Modification senza L-glutammina, ribo- e desossiribonucleosidi, siero bovino fetale al 15% (non inattivato dal calore) e 50 μg/mL di gentamicina. Aggiungere delicatamente il mezzo di crescita lungo i lati per evitare che gli espianti tissutali vengano spostati dal loro orientamento. Aggiungere il mezzo in eccesso per tenere conto di una frazione che verrà assorbita dagli espianti di tessuto durante l'incubazione.</li>
	<li>Dopo 3 giorni di incubazione, aggiungere terreno fresco alle colture. Assicurarsi che le colture siano protette dagli urti e dal movimento degli espianti durante la manipolazione dei piatti.</li>
	<li>Dopo 1 settimana, rimuovere i frammenti di tessuto singolarmente utilizzando una pinza sterile e scartare utilizzando appositi sacchetti a rischio biologico per lo smaltimento. Mantenere il mezzo esistente e aggiungere 10 ml di terreno di crescita fresco. Sostituire il mezzo di crescita ogni 4 giorni fino a quando le singole colonie raggiungono una confluenza del 70%. NOTA: È probabile che le cellule non saranno distribuite uniformemente in tutto il piatto, poiché ci saranno singole colonie proliferative che devono essere monitorate per la confluenza con il tempo. Generalmente, entro un mese, un piatto di 10 cm2 genera abbastanza cellule da dividere in un piatto separato.</li>
	<li>Raccogliere le cellule aderenti utilizzando la soluzione di tripsina / EDTA (1x 0,25% di tripsina e 0,02% di EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugare la sospensione cellulare a 470 × g per 5 minuti a 25 °C e risospesare il pellet cellulare nel mezzo di crescita.</li>
</ol>2. Immunofenotipizzazione e propagazione di uMSCS
<ol><li>Procedere all'immunofenotipizzazione una volta che le cellule aderenti hanno raggiunto il 50%-60% di confluenza e sono ben diffuse. Non eseguire l'analisi dei marcatori MSC su colture completamente confluenti, poiché ciò tende a causare una downregulation dei marcatori MSC chiave.</li>
	<li>Dopo la tripsinizzazione, distribuire una sospensione cellulare di 1 × 106 cellule/mL in tubi FACS (1 × 105 cellule/tubo) e colorare con opportuni anticorpi legati al fluoroforo (tutta la diluizione 1:50) in combinazione: non macchiato; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoroforo comune); controlli isotipici per ogni fluoroforo. Registrare un numero totale di eventi di almeno 10.000 sul citometro a flusso per ulteriori analisi. NOTA: poiché le celle vengono analizzate separatamente per ciascun marcatore di superficie, non è necessario gating su sottoinsiemi di celle.</li>
	<li>Oltre ai marcatori di cui sopra, confermare la presenza di marcatori di superficie positivi e negativi nelle linee uMSC create da singoli campioni di tessuto cordonale (Tabella 1).</li>
	<li>Analizzare le cellule marcate mediante citometria a flusso e determinare la percentuale di cellule CD105+CD90+ e CD105+CD73+. Analizzare separatamente le celle CD105+ e CD34−CD45−.</li>
</ol>3. Differenziazione delle uMSC in muscolo scheletrico
<ol><li>Piastre di coltura del tessuto del rivestimento con 0,01% di collagene e 20 μg/mL di laminina in PBS. Rivestire queste piastre per un minimo di 4 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Piastra uMSCs ad una densità di 10.000 cellule/cm2 in terreno di crescita.</li>
	<li>Quando le cellule sono confluenti al 70%, aspirare il mezzo di crescita e risciacquare le colture 2 volte con PBS. Aggiungere il mezzo di differenziazione miogenico (M1) composto da DMEM + 5% siero equino + 0,1 μM desametasone + 50 μM idrocortisone alle uMSC. Per determinare la cinetica della progressione miogenica, aggiungere M1 medium a giorni alterni alle colture.</li>
	<li>Per determinare la cinetica della progressione miogenica, analizzare le uMSC per l'espressione di Pax7, MyoD, Myogenin e MyHC rispettivamente a 2 giorni, 4-5 giorni, 6-7 giorni e 10-14 giorni.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Passaggi critici Un passaggio critico in questo protocollo è la raccolta del tessuto in condizioni asettiche, dal momento della consegna al mantenimento di colture sterili, per l'intera durata della propagazione. Durante la raccolta del cavo, è essenziale che il cavo non tocchi alcuna superficie non sterilizzata e venga tamponato esternamente con etanolo al 70% prima della raccolta in tubi contenenti PBS integrati con antibiotici. È importante limitare il tempo tra la raccolta del cordone e l'elaboraz...

Il cordone ombelicale umano è stato accreditato per possedere un robusto serbatoio di cellule staminali mesenchimali, che sono attualmente in fase di esplorazione per terapie rigenerative a causa dei loro robusti tassi di proliferazione e differenziazione, proprietà immunomodulatorie e capacità di generare cellule da tutti e tre gli strati germinali1. Il tessuto del cordone ombelicale è costituito da più compartimenti come il sangue del cordone ombelicale, il subendotelio della vena ombelicale e la gelatina di Wharton (WJ), che di per sé comprende tre regioni indistinte: la zona perivascolare, la zona intervascolare e il sub-amnione o il rivestimento del cordone (CL)2. Mentre gli uMSC possono essere isolati da tutte queste diverse regioni ed esprimere ampiamente i marcatori MSC chiave, non c'è chiarezza sul fatto che questi compartimenti contengano la stessa popolazione di uMSC o mostrino differenze nelle loro potenze di differenziazione3. Pertanto, i protocolli per l'isolamento delle uMSC richiedono una maggiore precisione nella loro modalità e regione di isolamento, la robusta caratterizzazione dei potenziali di differenziazione e, infine, un'analisi comparativa da diversi compartimenti del cavo. 
In questo contesto, pochi studi hanno dimostrato differenze nei potenziali proliferativi e differenziativi uMSC tra le diverse parti del cavo. Di queste, le analisi comparative tra uMSC isolate dalle regioni CL e WJ hanno rivelato un maggiore potenziale proliferativo nelle UMSC derivate da CL 3,4. In uno studio separato, le uMSC derivate da WJ hanno ottenuto risultati migliori nei saggi di proliferazione rispetto alle cellule perivascolari (HUCPV)5. Nell'esaminare le differenze tra le uMSC derivate dal sangue cordonale e le uMSC derivate dal tessuto cordonale prive di contaminazione vascolare, è stata riportata un'espressione differenziale dei marcatori MSC chiave tra i due compartimenti, nonché un aumento dei tassi di proliferazione nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale6.
Dei numerosi studi che esaminano i potenziali di differenziazione delle uMSC principalmente nei tessuti del lignaggio mesodermico come i lignaggi osteogenici, adipogenici e condrogeni, pochissimi hanno fornito protocolli dettagliati per la differenziazione miogenica e la successiva caratterizzazione, nonché analisi comparative tra vari compartimenti del cordone ombelicale. In questo contesto, abbiamo sviluppato un robusto protocollo di differenziazione muscolare e osservato che le uMSC derivate dal tessuto cordonale mostrano capacità di differenziazione miogenica superiori rispetto al sangue del cordone ombelicale6. Qui, un protocollo graduale è dettagliato per l'isolamento delle uMSC dall'intero tessuto cordonale privo di cellule associate alla vascolarizzazione, alla loro caratterizzazione e alla loro differenziazione nel lignaggio miogenico.

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica 100x Liquido, testato per endotossine (10.000 U Penicillina e 10 mg di streptomicina/mL in soluzione fisiologica allo 0,9%)</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MyHC (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MyoD (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-miogenina (clone F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Pax7</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC Clone CD90 anti-umano di topo 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II o FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato Brasile</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td>non essere inattivato</td></tr><tr><td>termicamente FITC Topo anti-umano Clone CD106 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD14 clone M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD31 clone WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD34 clone 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD45 clone HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD49D clone 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano CD90 clone 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano HLA-A,B,C clone G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo anti-umano IgG clone G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha Modifica senza L-glutammina, ribo- e desossiribonucleosidi</td><td>Hyclone</td><td>SH30568. FS</td><td>Terreno basale per uMSCs</td></tr><tr><td>PE Topo anti-umano CD105 clone 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE Topo anti-umano CD44 clone 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE Topo anti-umano CD49E clone llA1</td><td>BD Bioscience</td><td>555617</td><td></td>s</tr><tr><td>PE PE Clone IgG anti-umano di topo G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 Topo anti-umano CD73 CLONE AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH=7,4</td><td>HiMedia</td><td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina/EDTA (1x 0,25% di tripsina e 0,02% di EDTA in soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>HiMedia</td><td>TCL049-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

L'esplorazione del potenziale terapeutico delle cellule staminali mesenchimali dipende dalla facilità di isolamento, dalla potenza verso la differenziazione e dall'affidabilità e dalla robustezza della fonte. Descriviamo qui un protocollo graduale per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano (uMSCs), la loro immunofenotipizzazione e la propagazione di tali colture su diversi passaggi. In questa procedura, la vitalità degli uMSC è elevata perché non vi è alcuna digestione enzimatica. Inoltre, la rimozione dei vasi sanguigni, comprese le arterie del cordone ombelicale e la vena, assicura che non vi sia contaminazione delle cellule di origine endoteliale. Utilizzando la citometria a flusso, le uMSC all'isolamento sono CD45−CD34−, indicando un'assenza di cellule dalla linea ematopoietica. È importante sottolineare che esprimono marcatori di superficie chiave, CD105, CD90 e CD73. Al momento della creazione di colture, questo documento descrive un metodo efficace per indurre la differenziazione in queste uMSC nel lignaggio del muscolo scheletrico. Un'analisi dettagliata della progressione miogenica nelle uMSC differenziate rivela che le uMSC esprimono Pax7, un marker per i progenitori miogeni nelle fasi iniziali della differenziazione, seguito dall'espressione di MyoD e Myf5 e, infine, un marcatore di differenziazione terminale, la catena pesante della miosina (MyHC).

Il successo dell'isolamento delle uMSC dal tessuto del cordone ombelicale è &gt;95%, a differenza degli scarsi tassi di successo del sangue del cordone ombelicale intero. Dopo aver isolato con successo le uMSC, l'analisi FACS rivela che tutte le cellule sono CD34−CD45−CD105+CD90+. Tuttavia, in analisi comparativa, le uMSC isolate dal sangue del cordone ombelicale mostrano popolazioni eterogenee, in cui una percentuale di cellule mostra CD34 + CD45 + CD105 ...

Descriviamo un protocollo per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e la loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico.

Generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Descriviamo il nostro protocollo per isolare le cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e un metodo robusto per differenziarle in lignaggio muscolare scheletrico. Questa tecnica ci consente di isolare le cellule staminali mesenchimali che possiedono un'elevata vitalità e calore, con poca o nessuna contaminazione delle cellule di origine endoteliale e di indurre efficacemente la differenziazione miogenica in queste malattie. La torsione del cavo e la consistenza del mucoide rendono difficile la gestione del cavo.Mostriamo come elaborare il cordone, per non raschiare via la gelatina di Wharton ed escludere le cellule endoteliali dalla popolazione. Dopo aver raccolto il tessuto cordonale al momento della consegna, trasferire il pezzo di tessuto cordonale dal tubo di raccolta a un piatto trattato con coltura di tessuto di 10 centimetri quadrati e lavare accuratamente il tessuto con PBS fresco. Per prendersi cura della torsione del cordone o della superficie mucoide, fissare il tessuto con un paio di pinze tenute in una mano.Usando un bisturi, affettare il tessuto del cordone verticale lungo il suo accesso longitudinale per ottenere due pezzi semicilindrici. A questo punto, osserva le arterie e le vene ombelicali. Usando un bisturi, rimuovere i vasi sanguigni raschiandoli in una direzione dalla superficie e risciacquare il tessuto del cordone ombelicale in PBS per rimuovere tutto il sangue residuo associato al tessuto.Tritare ogni metà del tessuto del cordone ombelicale in frammenti di 0,5 centimetri cubici. Posizionare i frammenti con la superficie luminale rivolta verso il basso sul piatto e incubare brevemente il piatto per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 20 millilitri di mezzo contenente la modifica MEM Alpha delicatamente lungo i lati del piatto contenente il tessuto cordonale.Assicurarsi che gli espianti non vengano rimossi dal loro orientamento e aggiungere il mezzo in eccesso per tenere conto di una frazione che gli espianti tissutali assorbiranno durante l'incubazione. Quindi posizionare il piatto nell'incubatrice per tre giorni. Dopo la fine dell'incubazione, aggiungere un mezzo fresco alla coltura e assicurarsi che le colture siano protette dagli urti e dal movimento degli espianti durante la manipolazione dei piatti.Dopo una settimana, utilizzando una pinza sterile, rimuovere i frammenti di tessuto singolarmente e scartarli utilizzando appositi sacchetti a rischio biologico per lo smaltimento. Mantenere il mezzo esistente e aggiungere 10 millilitri di terreno di crescita fresco. Sostituire il mezzo di crescita ogni quattro giorni fino a quando le singole colonie raggiungono una confluenza del 70% Dopo aver macchiato le cellule come descritto nel manoscritto, analizzare le cellule marcate mediante citometria a flusso e determinare la percentuale di cellule CD105 CD90 positive e CD105 CD73 positive.Analizzare separatamente le cellule CD105 positive e CD34 CD45 negative. Rivestire la piastra di coltura tissutale con lo 0,01% di collagene e 20 microgrammi per millilitro di laminina in PBS e posizionarla sul bilanciere per un minimo di quattro ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il collagene e lavare la piastra con PBS, quindi placcare uMSC a 10.000 cellule per centimetro quadrato di densità nel mezzo di crescita.Una volta che le cellule raggiungono il 70% di confluenza, aspirare il mezzo di crescita e risciacquare la piastra di coltura due volte con PBS. Per determinare la cinetica della progressione miogenica, aggiungere il mezzo M1 a giorni alterni alle colture e analizzare le uMSC per l'espressione di pax7, MyoD, miogenina e catena pesante di miosina rispettivamente a due giorni, da quattro a cinque giorni, da sei a sette giorni e da dieci a quattordici giorni. Le uMSC mostrano l'espressione di CD105 e CD90 e non esprimono marcatori ematopoietici CD34 e CD45.Gli uMSC erano anche positivi per l'espressione del marcatore uMSCs CD73, indicando che gli uMSC esprimevano più marcatori chiave. Gli uMSC hanno mostrato l'espressione di pax7 entro i primi due giorni dall'aggiunta di M1, seguita dall'espressione MyoD entro i primi quattro giorni dall'aggiunta di M1. Le cellule esprimono la proteina miogenina a sei giorni di differenziazione, seguita dall'espressione della catena pesante della miosina tra 10 giorni e 14 giorni dall'induzione della differenziazione.970 geni sono stati sovraregolati in risposta all'induzione del differenziamento miogenico rispetto alle uMSC indifferenziate. Più geni miogenici sono stati sovraregolati nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale rispetto alle uMSC derivate dal sangue del cordone ombelicale. Sia il tessuto cordonale che il sangue cordonale hanno mostrato una sovraregolazione dei geni correlati alle proteine citoscheletriche, associati al legame con l'actina e all'assemblaggio del sarcomero, ai trasportatori associati alla funzione contrattile, al mantenimento della massa muscolare, alla segnalazione del calcio e alla funzione enzimatica.Raccogliere il tessuto in condizioni asettiche e mantenere la coltura sterile. Il cavo deve essere spazzato esternamente con etanolo al 70% e lavorato il più velocemente possibile. Molte terapie rigenerative richiedono un gran numero di cellule dai primi passaggi.Può anche essere usato come modello per imitare l'intero ambiente secco e riflettere il metabolismo postnatale.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive l'isolamento e la successiva espansione delle cellule stromali mesenchimali e le cellule endoteliali che formano colonie senza l'uso di siero animale per generare le coppie a fini di trapianto autologo sperimentali.

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

Isolare le cellule staminali adulte da muscolo-scheletriche tessuti molli in base alla velocità rispetto della cellula di pallone.

Isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici

I vasi sanguigni all'interno del porto muscolo scheletrico diverse popolazioni precursori multi-lignaggio umane che sono ideali per applicazioni rigenerative. Questo metodo di isolamento permette la purificazione simultanea di tre popolazioni di cellule precursori multipotenti rispettivamente da tre strati strutturali dei vasi sanguigni: cellule endoteliali da miogenici intima, periciti dai media, e le cellule avventiziali da avventizia.

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

Qui, descriviamo un protocollo basato su riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) verso generare una popolazione omogenea di progenitori muscolari scheletriche che in condizioni di coltura permissive formano cluster tridimensionali delle miofibre contrattili (myospheres), che ricapitolano caratteristiche biologiche umana muscoli scheletrici.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Qui, presentiamo un protocollo per la dissezione di cordone umano ombelicale (UC) e il campione placenta fetale in cavo rivestimento (CL), gelatina di Wharton (WJ), cavo-placenta giunzione (CPJ), e placenta fetale (FP) per l'isolamento e caratterizzazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) utilizzando la tecnica di espianto.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

Qui, presentiamo un metodo per sfruttare in modo efficiente il potenziale di differenziazione cardiache di giovane fonti di cellule staminali mesenchimali umane al fine di generare cellule funzionali, contraenti, del cardiomyocyte-come in vitro.

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Qui proponiamo un protocollo di differenziazione condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte da cellule mononucleate del sangue cordonale.

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Cordone ombelicale umano (UC) possono essere ottenuti durante il periodo perinatale a seguito di termine prematuro e postterm consegna. In questo protocollo, descriviamo l'isolamento e la caratterizzazione di UC-derivati di cellule staminali mesenchimali (MSCs-UC) da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine

Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.

Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali

Scopri come isolare cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e differenziarle nel lignaggio muscolare scheletrico. Questo protocollo garantisce alta vitalità cellulare e minima contaminazione endoteliare.

Generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico (Video) | JoVE Journal

Generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico

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