Generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico

Descriviamo il nostro protocollo per isolare le cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e un metodo robusto per differenziarle in lignaggio muscolare scheletrico. Questa tecnica ci consente di isolare le cellule staminali mesenchimali che possiedono un'elevata vitalità e calore, con poca o nessuna contaminazione delle cellule di origine endoteliale e di indurre efficacemente la differenziazione miogenica in queste malattie. La torsione del cavo e la consistenza del mucoide rendono difficile la gestione del cavo.

Mostriamo come elaborare il cordone, per non raschiare via la gelatina di Wharton ed escludere le cellule endoteliali dalla popolazione. Dopo aver raccolto il tessuto cordonale al momento della consegna, trasferire il pezzo di tessuto cordonale dal tubo di raccolta a un piatto trattato con coltura di tessuto di 10 centimetri quadrati e lavare accuratamente il tessuto con PBS fresco. Per prendersi cura della torsione del cordone o della superficie mucoide, fissare il tessuto con un paio di pinze tenute in una mano.

Usando un bisturi, affettare il tessuto del cordone verticale lungo il suo accesso longitudinale per ottenere due pezzi semicilindrici. A questo punto, osserva le arterie e le vene ombelicali. Usando un bisturi, rimuovere i vasi sanguigni raschiandoli in una direzione dalla superficie e risciacquare il tessuto del cordone ombelicale in PBS per rimuovere tutto il sangue residuo associato al tessuto.

Tritare ogni metà del tessuto del cordone ombelicale in frammenti di 0,5 centimetri cubici. Posizionare i frammenti con la superficie luminale rivolta verso il basso sul piatto e incubare brevemente il piatto per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 20 millilitri di mezzo contenente la modifica MEM Alpha delicatamente lungo i lati del piatto contenente il tessuto cordonale.

Assicurarsi che gli espianti non vengano rimossi dal loro orientamento e aggiungere il mezzo in eccesso per tenere conto di una frazione che gli espianti tissutali assorbiranno durante l'incubazione. Quindi posizionare il piatto nell'incubatrice per tre giorni. Dopo la fine dell'incubazione, aggiungere un mezzo fresco alla coltura e assicurarsi che le colture siano protette dagli urti e dal movimento degli espianti durante la manipolazione dei piatti.

Dopo una settimana, utilizzando una pinza sterile, rimuovere i frammenti di tessuto singolarmente e scartarli utilizzando appositi sacchetti a rischio biologico per lo smaltimento. Mantenere il mezzo esistente e aggiungere 10 millilitri di terreno di crescita fresco. Sostituire il mezzo di crescita ogni quattro giorni fino a quando le singole colonie raggiungono una confluenza del 70% Dopo aver macchiato le cellule come descritto nel manoscritto, analizzare le cellule marcate mediante citometria a flusso e determinare la percentuale di cellule CD105 CD90 positive e CD105 CD73 positive.

Analizzare separatamente le cellule CD105 positive e CD34 CD45 negative. Rivestire la piastra di coltura tissutale con lo 0,01% di collagene e 20 microgrammi per millilitro di laminina in PBS e posizionarla sul bilanciere per un minimo di quattro ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il collagene e lavare la piastra con PBS, quindi placcare uMSC a 10.000 cellule per centimetro quadrato di densità nel mezzo di crescita.

Una volta che le cellule raggiungono il 70% di confluenza, aspirare il mezzo di crescita e risciacquare la piastra di coltura due volte con PBS. Per determinare la cinetica della progressione miogenica, aggiungere il mezzo M1 a giorni alterni alle colture e analizzare le uMSC per l'espressione di pax7, MyoD, miogenina e catena pesante di miosina rispettivamente a due giorni, da quattro a cinque giorni, da sei a sette giorni e da dieci a quattordici giorni. Le uMSC mostrano l'espressione di CD105 e CD90 e non esprimono marcatori ematopoietici CD34 e CD45.

Gli uMSC erano anche positivi per l'espressione del marcatore uMSCs CD73, indicando che gli uMSC esprimevano più marcatori chiave. Gli uMSC hanno mostrato l'espressione di pax7 entro i primi due giorni dall'aggiunta di M1, seguita dall'espressione MyoD entro i primi quattro giorni dall'aggiunta di M1. Le cellule esprimono la proteina miogenina a sei giorni di differenziazione, seguita dall'espressione della catena pesante della miosina tra 10 giorni e 14 giorni dall'induzione della differenziazione.

970 geni sono stati sovraregolati in risposta all'induzione del differenziamento miogenico rispetto alle uMSC indifferenziate. Più geni miogenici sono stati sovraregolati nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale rispetto alle uMSC derivate dal sangue del cordone ombelicale. Sia il tessuto cordonale che il sangue cordonale hanno mostrato una sovraregolazione dei geni correlati alle proteine citoscheletriche, associati al legame con l'actina e all'assemblaggio del sarcomero, ai trasportatori associati alla funzione contrattile, al mantenimento della massa muscolare, alla segnalazione del calcio e alla funzione enzimatica.

Raccogliere il tessuto in condizioni asettiche e mantenere la coltura sterile. Il cavo deve essere spazzato esternamente con etanolo al 70% e lavorato il più velocemente possibile. Molte terapie rigenerative richiedono un gran numero di cellule dai primi passaggi.

Può anche essere usato come modello per imitare l'intero ambiente secco e riflettere il metabolismo postnatale.