Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Ciao, mi chiamo Matt Lui. Sono un borsista post-dottorato nel laboratorio di Leslie Sal alla Rockefeller University. E oggi vorrei parlarvi degli esperimenti che stiamo facendo per studiare la chemiotassi larvale.

Il problema che ci interessa è abbastanza semplice. In realtà è rappresentato qui in questa configurazione. Ho appena trasferito un gruppo di larve di Giuseppe su questa superficie di agros.

Questo ambiente è abbastanza ostile e sono vicini alla fame. In qualche modo questi animali dovranno trovare la strada per la fonte di cibo più vicina e qui ci sono alcuni odori di banana che emettono che attireranno le larve. Questo ambiente non è l'ideale per studiare il comportamento della chemiotassi, quindi il primo miglioramento sarà quello di sostituire la banana con una sostanza chimica.

Questa sostanza chimica è l'acetato iso ed è uno dei sapori predominanti nella banana. Quindi questo è il nostro aroma artificiale e utilizzando questo abbiamo un controllo molto migliore dello stimolo olfattivo. Il prossimo miglioramento consiste nell'utilizzare un ambiente chiuso e cercare di prevenire in questo modo la fluttuazione nell'altra distribuzione.

Ecco quindi il test che utilizziamo in laboratorio da molto tempo. Si tratta di una capsula di Petri con una superficie di agarro sul fondo. Agarro è ideale per le larve e gli attacchi di chemio perché le mantiene idratate.

Sui due lati della piastra, si trova un altro tappo che è fatto di teflon e quello che faremo ora è introdurre o isam acetato su un lato e nessun ordine sull'altro lato. Fatto ciò, l'idea è quella di chiudere la capsula di Petro, attendere un po' di tempo che l'odore si diffonda e poi aprire la capsula. Introduci un animale qui e lasciamo che l'animale si muova per un certo periodo di tempo.

Questo test si basa sul presupposto che introducendo l'odore su un lato del piatto, abbiamo un gradiente che si stabilisce abbastanza rapidamente e rimarrà stabile per il periodo del test. Ora il problema principale è che nessuno ha mai dimostrato che il gradiente esiste nella lastra. Potrebbe benissimo essere che molto rapidamente dopo l'aggiunta di theodor, si abbia una distribuzione omogenea di theodor nella lastra in modo tale che il gradiente sia molto superficiale o potrebbe essere che siano necessari diversi minuti per stabilire il gradiente.

Questo dipenderà ovviamente principalmente dalla pressione di vapore dell'odore che viene utilizzato. La seconda questione è legata a ciò che viene quantificato durante l'esperimento. Immaginate che un animale parta da qui, la X e dopo tre minuti si trovi a questa piastra terminale, la X rossa. Ora ci sono due possibili approcci.

Una cosa che puoi fare è registrare la posizione finale dell'animale solo dopo un certo periodo di tempo, tre o cinque minuti. Quindi l'unica informazione che si potrebbe catturare è la posizione della partenza e, e crediamo che sia importante avere una buona risoluzione circa il comportamento dell'animale nel tempo. Ad esempio, un animale potrebbe essersi spostato a malapena dalla posizione iniziale a quella finale, come in questo caso, o potrebbe benissimo aver visitato la regione circostante Theodor per un periodo di tempo significativo e riportarla prima della fine del processo.

La conclusione che trarremmo da queste due situazioni è molto diversa. In un caso, l'animale potrebbe non aver risposto allo stimolo, mentre nell'altro caso lo ha certamente fatto. I due miglioramenti che cerchiamo di ottenere sono: in primo luogo, controllare la forma e la stabilità dell'altro gradiente nell'arena.

In secondo luogo, traccia il comportamento dell'animale in tempo reale e conserva tutte queste informazioni. Nella prossima sequenza, Sylvia vi presenterà come prepariamo la diluizione dell'ordine. Mi chiamo S ti.

Sono un assistente di ricerca nel laboratorio VAs che lavora per material lui. Oggi vi mostrerò come preparare i materiali per il sistema a camera che utilizziamo per rintracciare gli animali. Il problema principale con il nostro sistema a camera è che stiamo usando l'odore disperso nell'aria.

Ciò significa che, ad esempio, se le piastre agros che utilizziamo non sono piatte, si potrebbero ottenere fluttuazioni e concentrazioni tra gli esperimenti, che introdurranno rumore nel sistema. Quindi te lo mostrerò e ti darò piccoli consigli per cercare di ridurre il rumore nel sistema. Quindi i materiali per preparare la diluizione degli odori sono un barattolo di vetro, preferibilmente vetro oscurato nel caso in cui si utilizzino odori reattivi alla luce con un'aliquota dell'odore che ti interessa.

Pipette di vetro per preparare questa aliquota e un adeguato ausilio meccanico per pipette. Quindi i puntali delle pipette con olio di paraffina, il pipettatore standard e piccole fiale per la diluizione. Ancora una volta, questi devono essere di vetro e preferibilmente oscurati e quindi una bilancia per effettuare misurazioni accurate e ridurre il rumore tra gli esperimenti.

Poiché gli odori sono altamente volatili e alcuni di essi sono tossici, vengono fatti all'interno di una cappa. Il primo passo per riparare una diluizione dell'odore è aliquotare l'odore che stai per diluire. Per preparare diluizioni accurate e ridurre al minimo la variazione tra gli esperimenti, è necessario pesare tutto.

Quindi inizia con l'etichettatura, andando a fare una concentrazione di un molare di butirrato di etile. Per prima cosa, prepara l'olio di paraffina. L'olio di paraffina è molto viscoso, quindi è importante cercare di immergere il puntale della pipetta il meno possibile nell'olio di paraffina, quanto basta per poter aspirare l'olio di paraffina senza generare bolle.

Quindi è bene rimuovere l'olio di paren in eccesso sul lato della bottiglia. Ancora una volta, poiché l'olio di paren è viscoso, è molto importante farlo uscire lentamente nella fiala. Una volta che hai pipettato l'olio di para nel tuo nella bottiglia, non buttare via immediatamente la punta perché se ne raccoglierà altra sul fondo della punta.

È bene preparare un foglio di calcoli prima di iniziare a diluire dove hai già misurato il volume di olio di paren che andrai ad aggiungere e anche il peso, e poi fare lo stesso anche per il tuo odore con anche il peso. In questo modo puoi controllare sulla bilancia che hai, tutto l'olio di paraffina di cui hai bisogno e anche tutto l'odore. Se necessario, si versa altro olio di paren e si rimisura fino ad ottenere il peso giusto.

Una volta ottenuto il peso corretto dell'olio di paren, tutto ciò che devi fare è aggiungere l'odorante utilizzando gli stessi principi. Va bene. Qui mostrerò come preparare le larve per il tracciamento.

Di solito usiamo larve che hanno sei giorni. Lo facciamo perché sono abbastanza grandi da essere facilmente rilevati dal nostro software e sono anche molto attivi per capire se le tue larve sono troppo vecchie per essere utilizzate nel tracciamento, devi solo controllare se ci sono larve che si arrampicano sulle pareti. Se ci sono larve che si arrampicano sul muro, allora sono troppo vecchie e non saranno particolarmente attive.

Il primo passo per preparare le larve è immergerle nel 15% di saccarosio. Il motivo per cui usiamo il 15% di saccarosio è che le larve saranno Boyd in questa soluzione e il cibo invece si dissolverà parzialmente in essa o cadrà sul fondo. Versa abbastanza saccarosio in modo che sia, lo so, a poco meno di un pollice dalla parte superiore della tua, della tua bottiglia o fiala.

Poi prendi una spatola. Puoi già vedere le larve galleggiare e scavi delicatamente nel cibo per rimuovere tutti gli animali che stanno scavando nel cibo, lo fai roteare un po' per separarli dal cibo e poi lo fai sedere per un paio di minuti. Una volta che il cibo e le larve si sono separati adeguatamente, prendi una capsula di Petri pre-etichettata e versale nella parte del beeper.

Conserva la parte superiore della capsula di Petri poiché la riempirai d'acqua e la userai come ricettacolo per le larve tracciate in modo da poter separare quelle che hai tracciato e quelle che non hai. Ora che hai versato le larve nella capsula di Petri, devi aspettare 30 minuti affinché si adattino al saccarosio e raggiungano uno stato di fame. Ciò significa che si comporteranno meglio nella configurazione di tracciamento durante i 30 minuti a cui la larva si sta adattando.

Il saccarosio è un buon momento per preparare le piastre per il tracciamento. Quindi queste sono le parti superiori delle piastre a 96 pozzetti. Puoi acquistarli separatamente e questa è una soluzione al 3% di aros che è già stata riscaldata.

Usiamo il 3% perché impedisce alle larve di scavare, ma è anche abbastanza denso da poter camminare su di esso e rimanere umidificato su ogni piano del piatto. Vuoi pipettare 25 mil di agros. È importante cercare di evitare la formazione di grandi bolle nel gel.

È anche importante posizionare le piastre su una superficie piana, altrimenti si potrebbero accumulare gel che si trovano su un pendio e potrebbero influenzare il comportamento delle larve. Dopo che l'aros si è solidificato, impiliamo le cime e le avvolgiamo in un involucro di soran in modo da evitare che si secchino. Questo dovrebbe mantenerli in un buono stato per il monitoraggio per diversi giorni.

In questa sequenza, vi presenterò il nostro test comportamentale, che differisce leggermente dal test della parabola di benzina, di cui vi ho parlato prima. Ciò di cui avrai bisogno sono i piombi delle piastre a 96 pozzetti e quelli contenenti lo strato agro. I test sono composti da tre coperchi, che sono impilati.

Il primo labbro non contiene nulla, è vuoto e serve solo a isolare il sistema dalla superficie su cui si trova. Il secondo strato contiene la superficie di Diego agro. Qui gli animali verranno posizionati sulla superficie e ora come vi mostrerò in seguito, introduciamo l'odore nel piatto.

È importante utilizzare un coperchio fresco e nuovo ogni volta che si carica l'odore. Questo per evitare qualsiasi contaminazione da un esperimento all'altro. Avrai anche bisogno di un'altra diluizione.

Normalmente non usiamo un colorante per caricare l'odore, ma qui lo userò per motivi di illustrazione. Questa è un'alta concentrazione di theodor. Anche se questo è molto diluito, il mio obiettivo sarà quello di creare un gradiente lungo una linea.

Diciamo questa frase e vogliamo che la concentrazione aumenti da sinistra a destra. Per ottenere ciò, utilizzerò diverse goccioline di ordine poste nell'anello di condensazione con concentrazione crescente. Comincio con la concentrazione più alta, che verrà posta all'estremità.

È importante disperderlo nell'anello. Ora procedo con la concentrazione successiva, che viene diluita due volte rispetto alla prima, e la pongo su questo anello. Quindi c'è No, ho sei goccioline.

Il primo contiene una concentrazione di, diciamo, uno. La seconda concentrazione di 0,5, il doppio rispetto alla prima. Il terzo è la concentrazione, 0,25 e così via.

Quindi abbiamo una serie geometrica lungo la linea. Il passaggio successivo consiste nell'invertire questo coperchio sulla superficie AAL e ora per tensione superficiale, tutte le goccioline rimangono sospese dalla parte superiore del coperchio. Elaboriamo una tecnica basata sulla spettroscopia infrarossa per misurare tutta la concentrazione nella piastra.

Applicando questa tecnica, siamo stati in grado di dimostrare che se si ha una serie geometrica lungo la linea del deodorante qui, si finisce con una concentrazione di theodor lungo la lunghezza che aumenta esponenzialmente come mostrato qui e lungo la larghezza della piastra. Abbiamo un profilo che ha raggiunto il picco proprio sotto la linea dell'odore. Ecco come appare la geometria effettiva del gradiente.

Se si considera la concentrazione di theodor nell'aria, la cosa buona è che siamo riusciti a dimostrare che il gradiente la sua geometria è stabile per almeno 15 minuti. Dopo l'introduzione del coperchio superiore, attendiamo 30 secondi per consentire l'instaurazione della sfumatura. Poi introduciamo l'animale nell'arena.

L'animale viene introdotto sotto l'altra linea di fondo tra la posizione tre e quattro, usiamo un piccolo spillo per trasferire le larve dalla soluzione di saccarosio alla superficie dell'agro. Il trasferimento viene effettuato pescando una larva intorno alla testa dell'unghia. Apriamo rapidamente il coperchio, la larva si deposita sulla superficie dell'agarro.

Quindi chiudiamo il coperchio. È importante ridurre al minimo il tempo in cui il coperchio rimane aperto. Successivamente, registri il movimento dell'animale per tre o cinque minuti.

Viene effettuata la registrazione vera e propria. Con questa configurazione di tracciamento, abbiamo una fotocamera collegata a un computer. Il software di tracciamento delle immagini che utilizziamo è Aton vision di Nordis per raccogliere le informazioni sul movimento dell'animale e memorizzarle come file digitale.

Ora stiamo per iniziare l'esperimento comportamentale. Abbiamo il coperchio con lo strato di aro. Abbiamo le diluizioni.

Diego è bloccato sul primo coperchio. Prima di caricare Theodor, è importante far vorticare ogni fiala. Usiamo la nostra diluizione con il più piccolo a sinistra e il più alto qui a destra.

Tutte e sei le goccioline verranno caricate contemporaneamente sulla piastra. Per evitare la perdita di odore, stiamo utilizzando qui un pipeter multicanale a sei immersioni, 10 microlitri di odore vengono prelevati da ciascun campione di diluizione e l'odore viene caricato allo stesso tempo. Al momento del caricamento, il coperchio è ora capovolto sulla superficie dell'agros.

Il gradiente è stato creato nella lastra negli ultimi 30 secondi, come vi ho mostrato prima. Ora introdurrò un animale sulla superficie di Diego. Non appena l'animale è stato introdotto, inizio la registrazione.

L'animale è qui e il suo movimento viene ora tracciato. Come puoi vedere, l'animale sta seguendo la linea dell'odore e si sta dirigendo verso il punto di concentrazione più alto del gradiente. Ricorda che la concentrazione aumenta da sinistra a destra con una forma esponenziale.

Come puoi vedere, la direzione del movimento viene costantemente corretta. Per quanto riguarda lo stimolo, l'animale ha ora raggiunto il punto di concentrazione più alto del gradiente, e lo rimuoviamo dalla piastra. L'animale viene scartato su un altro piatto per assicurarsi che non si rintraccia lo stesso individuo due volte direttamente.

Dopo aver introdotto una nuova larva e iniziato una nuova registrazione, ecco le regole che seguiamo per il tracciamento. Interrompiamo il tracciamento non appena l'animale ha raggiunto la fila di concentrazione più alta del piatto, che corrisponde a questo, questo qui. Inoltre, se un animale colpisce il muro, l'inseguimento viene interrotto perché vogliamo evitare qualsiasi interferenza.

La prima domanda che abbiamo affrontato è stata abbastanza potrebbe. Quello che volevamo sapere era se un animale potesse o meno sentire l'odore dell'odore a una certa concentrazione. Per fare un test del genere, quello che facciamo in genere è avere un'unica fonte di odore invece di averne diverse.

Ciò consente di avere un grado di libertà nel modificare la concentrazione nell'odore della gocciolina finale. Quindi, qui, per esempio, si ha una gocciolina ad alta concentrazione, e qui si ha una gocciolina a bassa concentrazione. Quello che facciamo in genere è introdurre l'animale sulla superficie di Diego proprio sotto la gocciolina di Theodor e vedere se l'animale è in grado di rilevare la sua presenza e rimanere nelle sue vicinanze.

Ora vorrei fare un uso più avanzato del nostro test. Immaginate di avere una goccia di ordine e di registrare diverse traiettorie che qui sono sovrapposte, e di averne tre. Hai un individuo che genera questa traccia verde.

C'è questa traccia arancione che è meno centrata, e poi c'è questa traiettoria rosa che rappresenta un animale che sembra girare intorno alla fonte. Crediamo che ci siano molte informazioni per iniziare sui dettagli delle traiettorie. Per questo motivo, importiamo la traiettoria come serie di possesso in matlab, ed eseguiamo l'analisi dopo l'analisi con matlab.

Ecco la distanza dalla fonte, probabilmente in funzione del tempo. Per le tre traiettorie visualizzate in precedenza, si ha la traiettoria verde, che rimane molto vicina alla sorgente. Hai la traiettoria arancione, che mostra molto più rumore.

E poi c'è questa traiettoria viola, che mostrava in modo interessante che l'animale lasciava la fonte per rimanere a distanza, che probabilmente corrispondeva a una concentrazione ottimale. Qui vedete l'illustrazione di 10 traiettorie, animali che non sono in grado di annusare. Questi sono mutanti o tre mutanti B, che sono non-eller.

E come puoi vedere, tutte queste traiettorie illustrano che gli animali non sono riusciti a rilevare la fonte dell'odore e l'hanno semplicemente abbandonata. Ora, in contrasto stellare, abbiamo registrato qui 10 traiettorie consecutive per gli animali maschi bianchi. Questi animali sono ovviamente in grado di annusare e, come puoi vedere, tutti si accumulano proprio sotto la fonte del deodorante.

Le 20 traiettorie, che vengono appena presentate, sono state infatti acquisite senza conoscere l'identità degli animali. Questo dimostra l'efficienza e l'affidabilità del nostro test. Nel determinare se alcuni mutanti sono in grado di annusare qui usando un gradiente esponenziale, generiamo diverse tracce e vogliamo avere un'idea di quanto bene gli animali siano in grado di seguire lo stimolo dall'altra parte.

Quindi ora vi mostrerò 15 traiettorie registrate separatamente e, come potete vedere, gli animali fanno un ottimo lavoro nel seguire lo stimolo sotto l'altra linea di fondo. Ora vorremmo procedere con un semplice controllo. Può benissimo essere che gli animali nel gradiente esponenziale abbiano seguito la linea perché c'era uno stimolo indipendentemente dalla sua concentrazione, solo che gli animali sono andati dritti.

Quindi, per dimostrare che stanno effettivamente calcolando la concentrazione o qualcosa di correlato alla concentrazione e ne stanno facendo uso per dirigere il loro movimento, abbiamo ora questa geometria, che è vicina a un tetto. La larva viene introdotta qui come al solito, e quello che ci aspettiamo è che si spostino lungo la linea e poi rilevino che la concentrazione sta diminuendo dopo questo punto e vi ritornino. Così abbiamo eseguito il test con cinque animali.

Abbiamo raccolto le traiettorie e ora le stiamo rappresentando sovrapposte a questa diapositiva. E come potete vedere, gli animali sono partiti da qui, si sono spostati lungo la linea, poi hanno esplorato la regione corrispondente alla più alta concentrazione e vi sono rimasti per lo più. Ciò suggerisce fortemente che sono in grado di calcolare altre concentrazioni in tempo reale utilizzando il saggio a sorgente singola.

Siamo stati in grado di porre principalmente una grande domanda. L'odore di un animale può rilevare un odore a una certa concentrazione utilizzando un dispositivo multi-fonte? Siamo, abbiamo più flessibilità nel cambiare la forma del gradiente e determinare se un animale è in grado o meno di utilizzare queste informazioni.

Mi piacerebbe illustrare questa idea eseguendo un semplice esperimento. Nei gradienti che abbiamo impostato finora, avevamo una forma esponenziale lungo l'obiettivo. Ora la domanda è: se sfidiamo di più l'al facendo aumentare linearmente la concentrazione lungo la lente, sono ancora in grado di trovare la loro strada sotto l'altra linea di fondo?

Questo grafico rappresenta i due tipi di gradiente. Abbiamo testato quello esponenziale in viola e il gradiente lineare in verde. Questo è il gradiente lineare, e scriverò le diverse concentrazioni di acetato di isam che diluisce l'olio di paren.

Questa è una serie aritmetica. Abbiamo un gradiente lineare che si stabilirà e come potete vedere, la pendenza è abbastanza bassa rispetto al gradiente esponenziale qui dove la concentrazione delle estremità è anche 0,5, ma sale fino a 0,03. La domanda è: le navi sono in grado di affrontare gli attacchi chemioterapici quando si trovano di fronte a un gradiente così basso?

Qui, la concentrazione effettiva di acetato utilizzata nelle sei goccioline per il gradiente esponenziale e per il gradiente lineare. Come si può notare, anche se le concentrazioni più alte sono le stesse in entrambi i casi per il gradiente lineare, la concentrazione più bassa qui è abbastanza alta. Eseguiamo l'esperimento con il gradiente lineare, e qui sono rappresentate 15 traiettorie di animali di tipo selvatico, e crediamo che sia abbastanza chiaro che questi animali sono stati in grado di rilevare il gradiente lineare e seguire questo segnale lungo la linea del deodorante.

Quindi penso che il nostro punto di vista sia chiaro. Prima di concludere qui, vorrei parlare brevemente delle direzioni future per questa configurazione di tracciamento. Sebbene questa configurazione di tracciamento ti consenta di fare molte cose interessanti, ad esempio, vedere un comportamento complesso nelle larve per un periodo di tempo più ampio e più lungo, ha alcune limitazioni.

Ad esempio, si è limitati alle dimensioni della targa, in modo da limitare il tempo di tracciamento e i comportamenti complessi che si possono osservare. Quindi sarebbe bello se potessimo sviluppare un sistema in cui la lastra è più grande o non si è limitati dai confini di una piastra. Un altro problema è che con il software che abbiamo in questo momento, è difficile tracciare più di un animale contemporaneamente, quindi non è possibile osservare i comportamenti della popolazione in tempo reale.

Un altro aspetto interessante del comportamento che non possiamo testare attraverso questa configurazione è l'effettivo movimento tridimensionale delle larve nello spazio. Mentre segui gli animali, vedrai che, ad esempio, quando raggiungono una gocciolina di odore, potrebbero sollevare la testa o potrebbero spazzare la testa cercando di rilevare cambiamenti nella concentrazione. Forse questo non è possibile con la nostra particolare configurazione in questo momento, quindi sarebbe bello sviluppare qualcosa che ci permetta di farlo.