Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Le placche amiloidi sono necessarie per la diagnosi della malattia di Alzheimer. Tuttavia, non sono sufficienti. Nonostante questo fatto, rimangono enigmatici in parte a causa delle sfide nel caratterizzare i loro contenuti.

Il nostro protocollo è altamente efficiente nell'isolare le fibrille amiloidi ad alta purezza ed è adatto per comprendere i dettagli fini della struttura e della composizione. Conoscere il contenuto proteico delle placche amiloidi può aiutare a identificare gli obiettivi dell'intervento terapeutico che possono ritardare, interferire o prevenire il loro accumulo. Pertanto, ritardando l'insorgenza della malattia.

Questo metodo è adatto per estrarre depositi proteici da tessuti cerebrali degenerati e aggregati proteici in diversi altri percorsi proteici. Inizia posizionando una regione di tessuto cerebrale appena sezionata o congelata a scatto in un tubo da due millilitri contenente da sei a otto perline di ceramica in un tampone di omogeneizzazione ghiacciato appena preparato. Quindi macinare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore per mulino a 4.000 giri / min con due cicli di 30 secondi di impulso on e off.

Ora aggiungi nove millilitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciata a un millilitro di omogeneizzato del tessuto cerebrale e un tubo da 15 millilitri e sigilla con strisce di film di cera da laboratorio. Per garantire una robusta solubilizzazione, mantenere il tubo in rotazione durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, aggiungere saccarosio solido alla sospensione di estratto di tessuto ad una concentrazione finale di 1,2 moli.

Mescolare bene e la centrifuga ha avuto 250.000 x g per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospesere il pellet in due millilitri di tampone di omogeneizzazione contenente 1,9 saccarosio molare triturando e centrifugando a 125.000 x g per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione trasferire lo strato solido bianco superiore in un tubo fresco e solubilizzare un millilitro di tampone di lavaggio ghiacciato accarezzando su e giù più volte.

Poiché il pellet è anche arricchito con fibrille amiloidi, scartare lo strato intermedio acquoso e combinare il pellet con lo strato superiore per una resa maggiore. Centrifugare le frazioni combinate a 8.000 x g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospesere il pellet in un millilitro di tampone di digestione ghiacciata e incubare a temperatura ambiente per tre ore su un vortice.

Centrifugare nuovamente il campione, quindi lavare il pellet due volte in un millilitro di tampone Tris ghiacciato e centrifugare di nuovo. Dopo il secondo lavaggio, risospesere il pellet in un millilitro di tampone di solubilizzazione tubando su e giù e centrifugare rapidamente il tubo a 200.000 x g per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Salvare il pellet, quindi ridurre la concentrazione di saccarosio da 1,3 a un molare aggiungendo 50 millimolari tampone Tris al surnatante.

Centrifugare nuovamente il surnatante, quindi sciogliere entrambi i pellet e 100 microlitri di tampone Tris contenenti lo 0,5% di SDS. Per la purificazione dell'amiloide, solubilizzare i pellet ricchi di amiloide utilizzando onde ultrasoniche in un dispositivo di sonicazione da bagno per 20 cicli, quindi centrifugare immediatamente il materiale a 20.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Risospesciare il pellet in 500 microlitri da tampone SDS Tris allo 0,5% e ripetere il lavaggio altre quattro volte, dopo la fase finale di centrifugazione, lavare il pellet in 200 microlitri di acqua ultrapura e centrifugare 20.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere l'eventuale detersivo rimanente.

Sciogliere il pellet finale contenente fibrille amiloidi purificate in 100 microlitri di acqua ultrapura. Sciogliere i 100 microlitri purificati di fibrille amiloidi in 400 microlitri di metanolo e vortice bene. Quindi mescolare di nuovo 100 microlitri di cloroformio e vortice.

Quindi, aggiungere 300 microlitri di acqua ultrapura e vortice accuratamente. Dopo la centrifugazione a 12.000 x g per due minuti a temperatura ambiente, rimuovere con attenzione lo strato acquoso superiore senza disturbare lo strato di interfaccia contenente il fiocco proteico e aggiungere nuovamente lo stesso volume di metanolo. Ripetere la centrifugazione, scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet.

Per la digestione, sciogliere il pellet in 50 microlitri di tampone di guanidina cloridrato e sonicare in un bagno di acqua ghiacciata. Quindi vortice accuratamente per 45 minuti a un'ora a temperatura ambiente, aggiungere 50 microlitri di soluzione tensioattiva allo 0,2% e vortice di nuovo per altri 60 minuti. Quindi, aggiungere un microlitro di TCEP da 500 millimolari e incubare per 60 minuti.

Quindi aggiungere due microlitri di iodoacetammide millimolare e incubare al buio per 20 minuti. Dopo l'incubazione, spegnere la iodoacetammide con cinque microlitri di soluzione TCEP per 15 minuti. Quindi, aggiungere il volume richiesto di soluzione di bicarbonato di ammonio 50 millimolare al tubo per ridurre la concentrazione di guanidina a 1,5 moli.

Inoltre, aggiungere la soluzione di tensioattivo all'1% al tubo. Quindi aggiungere la tripsina e lasciare il tubo mescolando a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere acido formico alla soluzione peptidica digerita per abbassare il pH a 2,0, quindi attivare la colonna di spin C18 aggiungendo 200 microlitri di soluzione di metanolo al 50% e ruotando a 1500 x g per due minuti a temperatura ambiente.

Quindi, equilibrare i letti in resina della colonna C18 aggiungendo 200 microlitri di tampone di equilibrio e ruotando di nuovo per due minuti. Dopo l'equilibrio, caricare la soluzione peptidica acidificata sulla colonna C18 e centrifugare a 1500 x g per due minuti a temperatura ambiente. Ricaricare il flusso, ruotare la colonna ed eliminare il secondo flusso.

Quindi lavare i peptidi legati alla resina C18 due volte con il tampone di lavaggio. Eluire il peptide tre volte aggiungendo 40 microlitri di tampone di eluizione e centrifugando la colonna. Asciugare i peptidi in un concentratore di vuoto a velocità facendo evaporare la soluzione acquosa.

I pellet secchi possono essere salvati a 20 gradi Celsius per alcune settimane prima dell'analisi MS. La colorazione rosso Congo degli amiloidi purificati documenta l'arricchimento delle fibrille amiloidi rispetto alla frazione solubile SDS. La frazione solubile SDS non ha mostrato la presenza di amiloidi.

La struttura delle fibrille purificate ha confermato la presenza di fibrille amiloidi quasi pure. Inoltre, l'etichettatura immunogold ha confermato la presenza di peptidi amiloide-beta-42. La colorazione con anticorpi anti-amiloide-beta-42 e antifibrilla ha mostrato una relativa abbondanza di peptidi amiloide-beta-42 nelle fibrille.

Le frazioni amiloidi purificate hanno mostrato la presenza di circa 250 proteine, mentre la frazione raccolta prima dell'ultrasonicazione e del lavaggio SDS conteneva più di 2.500 proteine. I nuclei di fibrille hanno mostrato un arricchimento delle proteine associate a organelli non legati alla sirena e complessi supramolecolari. Gli amiloidi sono specie a bassa abbondanza, forse da pochi picogrammi a pochi microgrammi per milligrammi di tessuti cerebrali.

Quindi devi stare molto attento mentre raccogli gli strati, i pallet o scarta il surnatante. Con lo sviluppo di questa tecnica, è ora possibile identificare con maggiore sicurezza le proteine associate ai semi amiloidi iniziali, caratterizzare la loro struttura e indirizzarle per l'intervento terapeutico. Pertanto, prevenire l'insorgenza di questa malattia mortale.