Name: Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Impara a produrre virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico per studi in vivo. Questo metodo utilizza filtrazione a flusso tangenziale per ottenere titoli superiori a 6 × 10⁹ unità formanti placche/mL.

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J.G.E.Y è stato il destinatario di una borsa di studio di dottorato dell'Ontario Veterinary College e di una borsa di studio per laureati dell'Ontario. Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants a SKW (grant #304737) e LS (grant #401127).

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<li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li>
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<li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29%3A+brief+history+of+its+oncolytic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li>
<li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li>
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<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li>
<li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li>
<li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li>
<li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+therapy+resistance%3A+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li>
<li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li>
<li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus%3A+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li>
<li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li>
<li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+influenza+vaccines%3A+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li>
<li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335(2021).</li>
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<li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

I virus utilizzati come agenti terapeutici negli studi preclinici devono essere altamente purificati per evitare tossicità quando somministrati in vivo15. Se agenti avventizi o contaminanti non vengono rimossi, ciò può portare a gravi reazioni avverse che negano l'effetto terapeutico dell'agente virale28. Poiché l'NDV è prodotto in uova di gallina embrionate, ci sono diverse proteine dell'uovo contaminanti, come l'ovalbumina, che devono essere rimosse prima del suo...

Newcastle Disease Virus, noto anche come Avian Orthoavulavirus-1, è un paramixovirus aviario avvolto con il potenziale per essere utilizzato sia come virus oncolitico che come vaccino viralevettore 1,2,3,4,5,6,7. Più recentemente, NDV progettato per esprimere la proteina spike di SARS-CoV-2 è stato caratterizzato come un vaccino intranasale efficace nei modellidi sfida di topo e criceto 7,8,9. Se usato come immunoterapia del cancro, si traduce nel reclutamento di cellule immunitarie innate, in particolare cellule natural killer, produzione di interferone di tipo I e generazione di cellule T antitumorali specifiche 10,11,12,13. Oltre a queste potenti proprietà immunostimolanti, NDV ha un forte profilo di sicurezza e un sistema di genetica inversa ben consolidato 14,15. Queste caratteristiche desiderabili hanno spinto la valutazione di NDV in numerosi studi clinici preclinici e umani (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Per far progredire ulteriormente questo vettore virale immunostimolante molto promettente, sono necessari metodi dettagliati per produrre e purificare NDV ultra-puro ad alto titolo che può essere somministrato in modo sicuro in vivo.
Poiché NDV è un paramyxovirus aviario, è più frequentemente amplificato nelle uova di gallina embrionate. Mentre ci sono sistemi basati su cellule disponibili per la propagazione di NDV, la maggior parte non è stata in grado di produrre titoli simili a quelli ottenuti nelle uova di gallina embrionate18. Tuttavia, ci sono alcuni inconvenienti nella produzione di NDV nelle uova, incluso il fatto che la produzione a base di uova è lunga e non facilmente scalabile, l'approvvigionamento di grandi quantità di uova di gallina SPF può essere problematico ed esiste il potenziale di contaminazione con allergeni dell'uovo 13,18,19,20 . Recentemente, un gruppo ha dimostrato che le cellule Vero cresciute in sospensione in mezzo privo di siero possono supportare la replicazione di NDV in titoli paragonabili a quelli ottenuti nelle uova, prima della purificazione21. Tuttavia, ciò ha richiesto il passaggio seriale del virus per adattare il virus alle cellule Vero e l'ottimizzazione di un metodo per purificare NDV dalle cellule Vero in sospensione è ancora richiesta21.
Come evidenziato in precedenza, i metodi utilizzati per purificare il virus di alto titolo e di grado in vivo variano a seconda del virus in questione22. Esiste un sistema di genetica inversa ben consolidato disponibile per la generazione di NDV ricombinante. Questo processo, che prevede l'uso di un clone di cDNA, plasmidi helper e un virus helper che esprime T7 RNA polimerasi, è stato precedentemente descritto in dettaglio 15,23. Questo protocollo può essere applicato a NDV lentogeno o mesogenico. Il virus descritto in questo protocollo è un NDV mesogenico ricombinante che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) dalla medusa Aequorea victoria inserita tra i geni virali P e M come unità di trascrizione individuale, poiché questo è stato precedentemente descritto come il sito ottimale per l'inserimento di transgeni estranei24.
I metodi allegati delineano la purificazione di NDV in base alle sue dimensioni, che vanno da 100 a 500 nm, e alla sua densità15. Ciò ha permesso la generazione di stock NDV in vivo e ad alto titolo in circa 3 settimane, a partire da quando le uova vengono ricevute fino ad avere un titolo finale. Vengono descritte le tecniche frequentemente utilizzate nella produzione su larga scala di virus a base di uova come la filtrazione a flusso tangenziale, la filtrazione di profondità e l'ultracentrifugazione del gradiente di densità, consentendo la traduzione di questi metodi in una produzione su larga scala. Le tecniche precedentemente descritte per la purificazione dell'NDV sono state migliorate mediante l'incorporazione di un tampone stabilizzante del virus, l'uso di iodixanolo durante l'ultracentrifugazione del gradiente di densità e la descrizione di varie misure di controllo della qualità per garantire la qualità in vivo 15. Ciò ha permesso la purificazione di NDV di grado in vivo raggiungendo titoli fino a 3 × 1010 PFU/mL da 0,8 a 1,0 L di liquido allantoico.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>HyClone</td><td>SH30042.02</td><td></td></tr><tr><td>Siringa a punta scorrevole da 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-Lok da 10 mL</td><td>BD</td><td>302995 Soluzione di</td><td></td></tr><tr><td>iodio povidone al 10%</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14955240</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 in Ago di riempimento smussato</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>Ago di scorrimento di precisione da 18 G x 1 1/2 pollici</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 25 g x 5/8 pollici</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Thermo-Fisher</td><td>03446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide/Bis al 30% 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide-PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Siringa Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti - Fondo piatto</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico, Thermo-Fisher glaciale</td><td></td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Froggabio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Capra-Anti-Topo</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14 Centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina (5%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-102-0599</td><td></td></tr><tr><td>Pinza larga con punta non seghettata</td><td>Thermo-Fisher</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Blu bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-25G</td><td></td></tr><tr><td>Porta cassetta centramato</td><td>PALL</td><td>CM018V</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatrice</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP101-50</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Cellule</td><td>ATCC</td><td>CRL-12203</td><td></td></tr><tr><td>Diet Gel Recovery</td><td>ClearH2O, INC</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice per uova Sportsman digitale 1502</td><td>Berry Hill</td><td>1502W</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>Candelabro per uova</td><td>Berry Hill</td><td>A46</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (70%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 8,0, 0,5 M in H2O</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi a T filettati femmina, nylon, 1/8 in NPT(F)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-50</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Pinze ad alta precisione a punta fine</td><td>Thermo-Fisher</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>ZEISS AXIO</td><td></td><td>Non necessario se non si esegue l'IFA o se NDV non codifica una proteina fluorescente</td></tr><tr><td>Sistema di liofilizzazione Freezone 4.5</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GiBOX Gel Imager</td><td>Syngene</td><td></td><td>Imaging di gel di agarosio</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Thermo-Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrittasi inversa cDNA ad alta capacità</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Alto glucosio Dulbecco's Essential Medium Cytiva</td><td></td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Kit umidità</td><td>Berry Hill</td><td>3030</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>60% (p/v) soluzione di iodixanolo in acqua (sterile)</td></tr><tr><td>L-lisina monocloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62929-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>maschio e femmina Luer-Lok a 1/8 in filettatura nazionale per tubi, NPT</td><td>Cole-Parmer</td><td>41507-44</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital</td><td>Drive Cole-Parmer</td><td>RK-07522-20</td><td>Pompa peristaltica con display digitale</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy Load Testa della pompa per tubi di precisione</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone Masterflex (Platinum) L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td>BioPharm Silicone polimerizzato al platino</td></tr><tr><td>MC Pro 5 Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>EP950040025</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td>SDS-PAGE cast e running appartus</td></tr><tr><td>Mouse-Anti-NDV</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-11633</td><td>Clone 6H12</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo-Fisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Omega LV Centramate Cassette, 100K</td><td>PALL</td><td>OS100T02</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OWL Easycast B1A Mini Sistema di elettroforesi su gel</td><td>Thermo-Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X Soluzione</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico) Media Mn 20.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PowePac 300</td><td>BioRad</td><td></td><td>Modello 1655050 - per elettroforesi su gel di agarosio</td></tr><tr><td>Q5 Alta fedeltà 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>QIA Amp Mini kit di RNA virale</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>RedSafe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>50999562</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer Cassetta per dialisi (forza extra), 10.000 MWCO 0,5-3 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (pellet)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S318-10</td><td></td></tr><tr><td>Uova prive di agenti patogeni specifici</td><td>CFIA</td><td>NA</td><td>Il fornitore varierà a seconda della posizione</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Supracap 50 Filtro di profondità</td><td>PALL</td><td>SC050V100P</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td> <td>chirurgicheThermo-Fisher</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Sw41Ti Rotore</td><td>Coltro Beckman</td><td>331362</td><td>Utilizzato nelle fasi di protocollo 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td></tr><tr><td>SX4750 Rotore</td><td>Coltro Beckman</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore SxX4750 per provette a fondo conciale</td><td>Coltro Beckman</td><td>359472</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga ultratrasparenti a parete sottile ( 9/16 pollici x 3 1/2 pollici)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto a vite per tubi</td><td>PALL</td><td>88216</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Manometri di utilità</td><td>Cole-Parmer</td><td>68355-06</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di virus della malattia di newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Il virus della malattia di Newcastle (NDV), noto anche come sierotipo 1 dell'ortoavulavirus aviario, è un virus a RNA a singolo filamento a senso negativo che è stato sviluppato sia come virus oncolitico che come vaccino vettore virale. NDV è un attraente agente terapeutico e profilattico grazie al suo consolidato sistema di genetica inversa, potenti proprietà immunostimolanti e un eccellente profilo di sicurezza. Quando somministrato come virus oncolitico o vaccino vettore virale, NDV suscita una robusta risposta immunitaria antitumorale o antigene-specifica, attivando sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario. 
Date queste caratteristiche desiderabili, NDV è stato valutato in numerosi studi clinici ed è uno dei virus oncolitici più ben studiati. Attualmente, ci sono due studi clinici registrati che coinvolgono NDV: uno che valuta un vaccino ricombinante NDV-vectored per SARS-CoV-2 (NCT04871737), e un secondo che valuta un NDV ricombinante che codifica per Interleuchina-12 in combinazione con Durvalumab, un anticorpo antiPD-L1 (NCT04613492). Per facilitare l'ulteriore avanzamento di questo vettore virale altamente promettente, sono necessari metodi semplificati per generare NDV ricombinante (rNDV) ad alto titolo, di grado vivo. 
Questo documento descrive una procedura dettagliata per amplificare l'rNDV in uova di gallina embrionate prive di patogeni specifici (SPF) e purificare l'rNDV dal liquido allantoico, con miglioramenti per ridurre la perdita durante la purificazione. Sono incluse anche le descrizioni dei test di controllo di qualità raccomandati, che dovrebbero essere eseguiti per confermare la mancanza di contaminanti e l'integrità del virus. Nel complesso, questa procedura dettagliata consente la sintesi, la purificazione e la conservazione di NDV ad alto titolo, di grado vivo, ricombinante, lentogeno e mesogenico per l'uso in studi preclinici.

Raccolta del fluido allantoico Poiché il liquido allantoico viene raccolto da uova di gallina embrionate, dovrebbe apparire chiaro e trasparente. Se il fluido appare opaco e giallo, questo indica la presenza di contaminanti. L'inclusione di questo fluido allantoico durante la purificazione impedirà il processo di purificazione, poiché la pressione aumenterà rapidamente e supererà i 10 psi, con conseguente taglio del virus e perdita del virus infettivo. Il liquido allantoico che appare sanguinante sugg...

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione, la purificazione e la quantificazione del virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo. Questo protocollo produce costantemente > 6 × 109 unità di formazione della placca / mL, fornendo quantità di virus appropriate per studi su animali in vivo . Vengono descritti ulteriori saggi di controllo della qualità per garantire la sicurezza in vivo .

Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Questo protocollo delinea le tecniche utilizzate per produrre il virus della malattia di Newcastle in modo che possa essere somministrato in modo sicuro a topi e altri animali come criceti e pecore. L'uso della filtrazione a flusso tangenziale consente di elaborare grandi volumi di partenza in modo più efficiente rispetto alle procedure esistenti che utilizzano solo processi di centrifugazione. Questa è una procedura lunga che coinvolge diversi passaggi intricati, il che significa che la gestione del tempo può essere un problema.Consiglierei di identificare tutti i potenziali passaggi di pausa in modo che la tecnica possa essere suddivisa in modo appropriato, riducendo al minimo lo stress. A dimostrare questa procedura sarà Alex, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Per la purificazione del virus della malattia di Newcastle o NDV, in primo luogo, innescare il sistema sperimentale precedentemente impostato eseguendo 50 millilitri di PBS attraverso di esso.Arrestare la pompa quando nel tubo rimangono circa cinque millilitri di PBS. Quindi, collegare un filtro di profondità con un valore di ritenzione da uno a tre micromolari al tubo. Per sfiatare il filtro, rimuovere il secondo tappo sul lato epico del filtro di profondità, quindi iniziare a far funzionare altri 50 millilitri di PBS attraverso il sistema.Una volta che il PBS inizia a fluire attraverso lo sfiato nella parte superiore del filtro, chiudere la porta e continuare a far fluire PBS attraverso le linee. Successivamente, sostituire il contenitore dei rifiuti con un nuovo recipiente di raccolta sterile e iniziare a far scorrere il fluido allantoico attraverso il filtro di profondità. Quindi, impostare la filtrazione a flusso tangenziale o il sistema TFF in una conferma aperta ed eseguire come descritto nel manoscritto.Quando ci sono circa cinque millilitri di fluido rimasti nel serbatoio, mettere in pausa la pompa e aggiungere fluido allantoico filtrato in profondità al serbatoio. Quindi riprendere il flusso della pompa. Per prevenire la tosatura del virus, è importante assicurarsi che la pressione del sistema non superi la forza di 10 libbre per pollice quadrato.Per aumentare l'illusione, è necessario utilizzare una combinazione della velocità della pompa peristaltica e del morsetto a C. Da 150 a 100 millilitri di liquido allantoico vengono lasciati nel serbatoio, mettere in pausa la pompa e sostituire il buffer aggiungendo da 150 a 200 millilitri di tampone ML. Ancora una volta, mettere in pausa la pompa quando da cinque a 10 millilitri di fluido sono rimasti nel serbatoio, quindi utilizzando due morsetti a C chiudere la vita.Disaccoppia la linea retented che alimenta il serbatoio e inseriscila in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi riprendere il flusso e mettere in pausa quando ci sono poche gocce di liquido rimaste nel serbatoio del serbatoio. Quindi, rimuovere i morsetti a C dalle linee di scarico e ricollegare la linea di alimentazione ritentata al serbatoio del serbatoio.Nel frattempo, per prepararsi all'ultracentrifugazione del gradiente di densità dello iodixanolo, aggiungere prima un 0,5 millilitri di 40% iodixanolo a un tubo ultra centrifugo a parete sottile a parete sottile aperto da 13,2 millilitri. Quindi preparare la colonna con aggiunte successive di 2,5 millilitri di 20% iodixanolo e 2,5 millilitri di 10% iodixanolo. Prima dell'ultracentrifugazione, aggiungere con attenzione da sei a 6,5 millilitri della soluzione virale allusa dal sistema TFF alla colonna di iodixanolo senza disturbare il gradiente.Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere i tubi con un paio di pinze sterili. La banda target dovrebbe essere una banda larga tra i gradienti del 10 e del 20%. Quindi, sospendere il tubo sopra la parte superiore di un becher usando un supporto di storta.Successivamente, collegare un ago da 1,5 pollici di calibro 18 a una siringa da cinque millilitri, quindi perforare il lato del tubo ultracentrifuga con l'ago e rimuovere la fascia target estendendo lentamente lo stantuffo. Dopo aver rimosso lo iodixanolo dalla soluzione del virus come descritto nel manoscritto, utilizzare una siringa per iniettare con cura il virus in una cassetta di dialisi. Per concentrare la soluzione virale, rimuovere la cassetta di dialisi dal tampone di dialisi e metterla in un piccolo sacchetto di plastica sigillabile.Quindi aggiungere un 15-25 millilitri di polietilenglicole al 40% al sacchetto in modo che la cassetta di dialisi sia completamente sommersa. Dopo la dialisi, sciacquare brevemente la cassetta di dialisi con PBS. Quindi, riempire una siringa dotata di aria con un ago da 1,5 pollici di calibro 18, inserire la siringa nella cassetta di dialisi e spingere lo stantuffo.Ruotare l'apparecchio per rimuovere il virus senza rimuovere l'aria introdotta. Per rimuovere il virus residuo aderente alla membrana, massaggiare accuratamente la membrana con le dita guantate senza danneggiarla. Per facilitare il processo di spostamento, rimuovere parte dell'aria in eccesso nella cassetta di dialisi.Per i test di controllo qualità, in primo luogo, diluire la soluzione virale 100 volte aggiungendo 10 microlitri di essa a 990 microlitri di PBS in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi continuare la diluizione seriale aggiungendo 100 microlitri della diluizione precedente a 900 microlitri di PBS. Per i test di infezione, aggiungere 20 microlitri di ogni delirio a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.Prima di esaminare l'effetto citopatico della proteina di fluorescenza verde o di eseguire un test di immunofluorescenza indiretta, incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno 48 ore. Utilizzando questo protocollo, è stato ottenuto un NDV altamente purificato, come dimostrato dall'elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio e solfato delle proteine virali. L'infettività del virus purificato con questo metodo è stata verificata anche dalla dose di infezione da coltura tissutale del 50% o dal test TCID50 eseguito in 96 piastre di pozzo.Il TCID50 è stato determinato dal numero di pozzi positivi per ogni diluizione utilizzando il calcolatore Spearman-Karber. Il test di infezione ha rivelato la differenza tra gli effetti citopatici dell'NDV lentogeno e mesogenico sulle cellule DF one in condizioni diverse dopo 10 e 24 ore di incubazione. Il test immuno florence è stato efficace anche nello studio dell'infezione delle cellule Vero da NDV lentogeno.Quando si innesca il sistema sperimentale, assicurarsi che le linee siano innescate in modo efficace poiché qualsiasi idrossido di sodio residuo inattiverà il virus. Inoltre è importante mantenere l'integrità della membrana in quanto compromettere questo comprometterà significativamente la purificazione e la resa del virus.

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Salvataggio di virus dell'influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell'influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

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Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

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