Preparazione del nervo sciatico di ratto per la neurofisiologia Ex Vivo

Questo protocollo consente l'osservazione di molti fenomeni neurofisiologici che non sono ben compresi, come il riporto del blocco nervoso dopo l'iniezione di corrente ad alta frequenza / alta ampiezza, prevenendo al contempo l'interferenza di altri processi in un corpo vivente. Questa tecnica produce risultati altamente ripetibili e robusti ed è più pratica dell'elettrofisiologia in vivo, perché variabili complesse come la profondità dell'anestesia non devono essere controllate e quindi non possono influenzare le misurazioni. Dopo una procedura di eutanasia sotto anestesia, posizionare un topo femmina sul tavolo di dissezione, tenere saldamente la caviglia tra il pollice, l'indice e il dito medio e tagliare il tendine calcaneare usando forbici smussate dritte di 12 centimetri.

Usando pinze e forbici fini, fare incisioni accurate attraverso gli strati muscolari vicino al centro della parte posteriore della gamba fino a quando il nervo sciatico è esposto. Una volta che il nervo è visibile, idratare la cavità usando il tampone Krebs-Henseleit modificato ghiacciato, o MKHB, per evitare che il nervo si secchi. Usando gli emostati, tirare i lembi di pelle su ciascun lato e mantenere l'incisione aperta per una dissezione più fine.

Partendo dalla posizione dell'incisione del tendine calcaneare, utilizzando forbici sottili, interrompere il muscolo sul lato mediale della gamba per liberare il nervo. Continuare a mantenere i livelli di umidità nell'area con MKHB ghiacciato. Mentre il nervo è esposto mentre si muove verso l'alto della gamba, sezionare il tessuto muscolare sovrastante.

Liberare il nervo più vicino alla colonna vertebrale dai tessuti connettivi fino a raggiungere la fessura spinale, a quel punto c'è un nodo nel nervo. Non pulire ancora il nervo, poiché la velocità è essenziale in questa fase. Per facilitare la dissezione, usando una pinza, tirare delicatamente l'estremità del nervo vicino alla caviglia.

Quindi, usando forbici fini, severo il nervo vicino alla colonna vertebrale. Posizionare il nervo sezionato in un tubo centrifugo da 15 millilitri riempito con MKHB e riposizionare il tubo sul ghiaccio fino all'inizio della procedura di pulizia. Riempire la capsula di Petri rivestita a metà strada con MKHB ossigenato refrigerato, quindi posizionare un nervo sciatico sezionato nel piatto e appuntare entrambe le estremità del nervo al piatto in modo tale che il nervo sia dritto senza attorcigliamenti, torsioni o torsioni.

Usando suture di seta 6-0 o filo sottile, legare un doppio nodo attorno a ciascuna estremità del nervo per evitare la fuoriuscita di citosol nel tampone. Posizionare i nodi proprio accanto ai perni degli insetti sul lato più vicino al centro del nervo per evitare perdite dal tessuto nervoso nel tampone. Al microscopio, usando forbici a molla angolate da due millimetri e pinze fini, rimuovere grasso, vasi sanguigni e tessuto muscolare dal nervo.

Potare eventuali rami nervosi che non verranno utilizzati nella stimolazione e nella registrazione. Dopo ogni cinque minuti di pulizia, sostituire il tampone con MKHB fresco, refrigerato e ossigenato. Dopo la pulizia, riposizionare il nervo nel tubo di trasporto riempito di tampone e appoggiare il tubo sul ghiaccio.

Preparare un bagno nervoso pulito a doppia camera. Utilizzando teste e pinze standard da laboratorio, posizionare il bagno nervoso sotto il livello della bottiglia da due litri posizionata sull'agitatore riscaldante. Collegare lo scarico del bagno all'ingresso della pompa peristaltica.

Collegare l'uscita della pompa peristaltica a un tubo che riporta alla bottiglia tampone. Collegare l'ingresso del bagno a un tubo con una valvola di flusso regolabile e inserire il tubo all'interno della bottiglia. Utilizzare una valvola a tre vie con una siringa collegata all'uscita centrale per aiutare con l'adescamento del tubo come sifone per l'afflusso tampone assistito dalla gravità.

Innescare il sifone disegnando la siringa fino a quando il buffer non scorre in esso. Configurare la valvola in modo che la portata tampone nel bagno sia compresa tra cinque e sei millimetri al minuto. La portata può essere aumentata inizialmente per riempire il bagno.

Una volta che il livello del tampone del bagno ha raggiunto lo scarico, posizionare i nervi nella vasca da bagno. Usando una spilla per insetti, fissare l'estremità del nervo all'angolo della camera da bagno piena di buffer. Usando una pinza fine angolata di 45 gradi e pizzicando il nervo solo alle estremità, infilare attentamente il nervo da stimolare attraverso il foro nella partizione tra le due camere da bagno.

Usando un perno di insetto, fissare l'altra estremità del nervo nella camera dell'olio del bagno, assicurandosi che il nervo sia dritto senza essere allungato e privo di attorcigliamenti e torsioni. Utilizzando grasso siliconico, creare un sigillo per evitare perdite tampone dalla camera tampone nella camera dell'olio Riempire la camera dell'olio con silicone o olio minerale. Posizionare i ganci degli elettrodi di registrazione argento/cloruro d'argento nella camera del bagno d'olio e fissarli utilizzando teste e pinze.

Quindi, drappeggiare la parte del nervo nel bagno d'olio sopra i ganci senza tirare il nervo teso. Regolare o riparare il sigillo di grasso siliconico se si osservano perdite dopo aver spostato il nervo. Collegare l'elettrodo di riferimento argento/cloruro d'argento alla messa a terra dell'amplificatore e posizionare l'elettrodo nella camera da bagno riempita di tampone fissandolo utilizzando una pinza da laboratorio.

Dopo aver preparato un elettrodo per polsino nervoso pulito per la stimolazione, posizionare l'elettrodo nella camera da bagno riempita di tampone. Usando pinze o pinzette sottili con punte smussate o angolate, aprire l'elettrodo nella vasca da bagno per bagnare l'interno del bracciale. Se le bolle rimangono, utilizzare una siringa fine per estrarre il tampone dal bagno e forzare le bolle fuori dal bracciale.

Usando una pinzetta, aprire delicatamente il bracciale e farlo scivolare sotto il nervo. Chiudere il bracciale intorno al nervo, evitando qualsiasi attorcigliamento o torsione del nervo. Collegare l'elettrodo di stimolazione e l'elettrodo di ritorno della corrente allo stimolatore.

Se si utilizza un foglio di platino quadrato come elettrodo di ritorno della corrente, posizionare il foglio lontano dal nervo nella vasca da bagno. Fissare il piombo di entrambi gli elettrodi con del nastro adesivo. Collegare l'uscita del segnale TTL dello stimolatore al canale quattro dell'oscilloscopio.

Nella schermata dell'oscilloscopio, premere la scheda Trigger channel e specificare il canale quattro come canale di attivazione. Impostare il livello di trigger su un volt utilizzando la manopola del livello. Sull'oscilloscopio, impostare la risoluzione temporale su un millisecondo per divisione e la risoluzione della tensione su 10 millivolt per divisione.

Centrare il riferimento del trigger nel tempo e impostare il livello di trigger su un volt. Dopo aver collegato lo stimolatore al computer, accendere lo stimolatore collegando l'alimentatore a batteria all'ingresso di alimentazione. Quindi, avvia il software MATLAB sul computer.

Esegui lo script MATLAB personalizzato. Quindi, apri lo script MATLAB indicato. Modificare lo script e impostare i parametri ampiezza dell'impulso dello stimolatore a meno 300 microampere, larghezza dell'impulso dello stimolatore a 300 microsecondi, numero di impulsi dello stimolatore a 10 e tempo dello stimolatore tra gli impulsi a un secondo.

Avviare il protocollo di stimolazione facendo clic su Esegui nel software. Il potenziale d'azione composto, o CAP, aveva un'ampiezza da picco a picco di un millivolt all'elettrodo e di 100 millivot quando amplificato. L'eccitabilità nervosa tipica per i polsini nervosi in platino standard e le polsini nervose in elastomero conduttivo su misura sono mostrate qui.

La CAP ottenuta ex vivo in una giornata di esperimenti utilizzando entrambi i nervi sciatici è mostrata qui. È stata osservata una riduzione minima dell'ampiezza della CAP con il nervo sciatico destro. Al contrario, l'ampiezza CAP del nervo sciatico sinistro a circa tre millivolt era simile a quella del nervo sciatico destro all'inizio dell'esperimento più di sei ore dopo l'estrazione del nervo.

Enfatizza la precisione e la ripetibilità nella dissezione, nella pulizia e nella tecnica di implementazione. Presta attenzione a ciò che sta accadendo nella vasca da bagno. Se il segnale nervoso viene perso, può semplicemente essere che gli elettrodi non sono nel buon contatto o che c'è soluzione salina nella partizione dell'olio del bagno, e non che il nervo è morto.

Gli utenti per la prima volta potrebbero essere tentati di affrettarsi, specialmente durante la fase di dissezione. Questo probabilmente porterà a errori e danneggerà il nervo. Precisione e coerenza sono fondamentali qui e porteranno a risultati di qualità superiore.

Particolare attenzione dovrebbe essere prestata anche alla coerenza nella preparazione del tampone.