Induzione dell'infiammazione della superficie oculare e raccolta dei tessuti coinvolti

Questo protocollo descrive sequenzialmente i passaggi coinvolti nell'induzione dell'infiammazione della superficie oculare e nella raccolta degli organi colpiti associati coinvolti nella disfunzione della ghiandola di Meibomio. Questo nuovo modello di MGD consente lo studio dell'aspetto immunitario innato della malattia, in particolare la formazione di trappole extracellulari neutrofile che occludono la ghiandola di Meibomio. La tecnica esposta nel protocollo può essere estesa per introdurre interventi terapeutici topici in una fase pre-clinica.

Inoltre, la raccolta di essudati e organi oculari riflette l'efficacia del trattamento. Per eseguire l'iniezione intraperitoneale della soluzione immunogena, tenere delicatamente per la coda il topo femmina C57 nero sei non anestetizzato di sette-nove settimane mentre si afferra la griglia della gabbia. Quindi tenere saldamente la pelle della schiena e la regione del collo tra il pollice e l'indice e fissare la coda e gli arti inferiori tra l'anello e il mignolo contro il palmo.

Mantenendo il topo fisso con la testa verso il basso, iniettare 100 microlitri della soluzione immunogena preparata nel quadrante destro o sinistro della cavità addominale inferiore. Per eseguire una sfida della superficie oculare dopo l'immunizzazione, applicare cinque microlitri di ovoalbumina o ovuli o soluzione salina per occhio di un topo anestetizzato e attendere cinque minuti per ottenere la goccia assorbita dall'occhio. Successivamente, raccogliere gli essudati oculari applicando 50 microlitri di soluzione salina sterile all'occhio immediatamente dopo la sfida.

Per l'escissione dei tessuti superficiali oculari, posizionare il topo su una superficie piana e disinfettare l'area orbitale intorno all'occhio con un tampone etanolo al 70%. Per formare un'incisione intorno all'occhio, fare un'incisione tra l'orecchio e il seno retroorbitale e lungo la superficie sopra l'osso squamoso verticalmente, estendendo l'incisione orizzontalmente sotto la palpebra inferiore lungo l'osso mascellare e sopra la palpebra superiore lungo l'osso frontale. Tenere con cura il tessuto sezionato intorno all'occhio usando una pinza curva e tirare fuori il tessuto e il bulbo oculare.

Posizionare gli organi asportati in PBS sterile. Quindi, utilizzando un bisturi sotto il microscopio stereo, tagliare il tessuto muscolare facciale in eccesso intorno alle palpebre superiori asportate. Per raccogliere la congiuntiva posizionare la palpebra superiore su una capsula di Petri asciutta.

Quindi, usando una pinzetta fine e un bisturi, sbucciare delicatamente lo strato di muco biancastro dalla superficie interna della palpebra. Accanto a sezionare la cornea, posizionare il globo oculare su una nuova capsula di Petri secca sopra il ghiaccio secco. Dopo tre minuti, posizionare il piatto sulla superficie del banco in una posizione stabile.

Usa forbici sottili e affilate per fare una piccola incisione sul bordo della cornea vicino al limbus. Continuare l'incisione con il bisturi intorno al globo oculare, separando la sclera dalla cornea. Quindi rimuovere i resti dell'iride e della lente dal retro della cornea lavando generosamente con soluzione salina.

Per valutare la ghiandola di Meibomio e i suoi orifizi, posizionare le palpebre asportate in posizione verticale sotto il microscopio stereoscopico. Quindi, in base al tempo di esposizione della fotocamera e alle impostazioni ISO, cattura le immagini sotto l'epi-illuminazione della luce bianca. Per valutare l'area della ghiandola di Meibomio, posizionare le palpebre asportate in posizione orizzontale e accendere la retroilluminazione del microscopio stereo dotato di una telecamera a infrarossi.

Cattura le immagini regolando il tempo di esposizione in base all'ISO della fotocamera. I topi somministrati con soluzione salina hanno mostrato superfici oculari sane con gli occhi ben aperti. In confronto, l'applicazione di ovuli induce una grave infiammazione della superficie oculare, la stretta apertura degli occhi e segni di chemosi.

Le palpebre asportate mostravano grandi occlusioni che ostruivano gli orifizi della ghiandola di Meibomio ed edema, in contrasto con le palpebre sane che mostravano piccoli tappi della ghiandola che rivestivano la palpebra. Un ulteriore esame della transilluminazione infrarossa della ghiandola rivela l'aspetto racemico degli acini della ghiandola di Meibomio. Le palpebre dei topi salini sfidati mostravano gli acini rotondi.

In confronto, le applicazioni di ovuli hanno indotto la distruzione e la perdita di alcune ghiandole con la malattia allergica degli occhi o DAE. L'analisi istologica delle palpebre ha mostrato ghiandole di Meibomio dilatate rispetto ai topi somministrati con solo soluzione salina. L'incubazione del bulbo oculare su ghiaccio secco ha permesso l'incisione sulla cornea vicino al limbus e la separazione della cornea dalla sclera.

Questo studio ha facilitato la raccolta della cornea. Inoltre, la somministrazione di ovuli ha inflitto una grave infiammazione alla congiuntiva con un aspetto iperemico. Livelli elevati della chemochina CXCL-1 facilitano lo stravaso dei neutrofili, la fagocitosi e la degranulazione e l'interleuchina-6 che media la risposta di fase acuta e l'infiltrazione dei neutrofili sono stati osservati nei supernatanti dei topi DAE.

D'altra parte, la concentrazione di interleuchina-10 non ha mostrato cambiamenti significativi sia nei topi naïve che in quelli DAE. Questo nuovo modello consente lo sviluppo e la valutazione dell'efficacia di farmaci che colpiscono le vie immunitarie innate ed è di grande aiuto nel data mining delle modalità di somministrazione degli agenti antinfiammatori. Dopo un'appropriata raccolta di organi, i metodi altamente multiplex come il sequenziamento a singola cellula e la citometria di massa di imaging sono compatibili con questo protocollo.