Name: Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri l'arricchimento delle vescicole extracellulari di Mycobacterium tuberculosis mediante cromatografia di esclusione dimensionale. Questo metodo semplice e riproducibile offre un'alternativa delicata alle tecniche tradizionali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo riconoscere il sostegno del College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award e del College Research Council Shared Research Program a NKG e il finanziamento da parte di ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. Vorremmo anche ringraziare Anne Simpson per il supporto tecnico e BEI Resources, NIAID, NIH per i seguenti reagenti: Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (prodotto in vitro), NR-13792, Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (prodotto in vitro), NR-49223 e Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (prodotto in vitro), NR-13811.

Il Comitato istituzionale per la biosicurezza della Colorado State University ha approvato il presente studio (19-046B). La coltivazione del Mycobacterium tuberculosis e la raccolta di supernatanti di coltura ricchi di EV sono state eseguite da personale addestrato in un laboratorio ad alto contenimento. I materiali sono stati spostati fuori dall'area ad alto contenimento dopo che è stato eseguito, confermato e approvato dalle politiche di biosicurezza istituzionali un valido metodo di inattivazione. Durante la replica del protocollo, se l'inattivazione convalidata o il metodo di filtrazione sterile non sono fattibili, le seguenti procedure devono essere eseguite in un laboratorio ad alto contenimento.
1. Preparazione del concentrato grezzo di Mtb EV
NOTA: Per le procedure dettagliate sulla coltivazione di Mtb e la preparazione di proteine filtrate di coltura (CFP), vedere Riferimenti11,12. Si raccomanda che i terreni di coltura batterica siano esenti da integratori di crescita con componenti contenenti EV o proteinacei, come l'albumina oleica destrosi catalasi (OADC) e detergenti come Tween. Si raccomanda inoltre che la qualità della coltura batterica e la CFP raccolta siano sottoposte a screening per garantire una morte cellulare limitata e la lisi13,14.
<ol><li>Preparare un filtro centrifugo da 100 kDa a peso molecolare (MWCO) (vedere Tabella dei materiali) aggiungendo l'intera capacità volumetrica della soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS). Centrifugare per 5 min a 2.800 x g a 4 °C. NOTA: se si utilizza un filtro senza volume dead stop, è necessario prestare attenzione per garantire che il volume del campione non si riduca al di sotto del livello del filtro, con conseguente completa asciugatura del filtro durante la centrifugazione.</li>
	<li>Scartare il flusso passante e l'eventuale PBS rimanente prima di riempire la camera del campione con Mtb CFP alla sua massima capacità. Centrifugare a 2.800 x g a 4 °C fino a quando il volume non si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione. Ripetere se necessario, aggiungendo più CFP all'unità fino a quando l'intero campione non è stato sufficientemente ridotto. NOTA: Conservare una parte del materiale a flusso continuo (100F) da 100 kDa per la qualificazione a valle, se lo si desidera. Conservare a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere 1x PBS all'unità filtrante contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto al punto 1.2. Ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e lo scambio del tampone.</li>
	<li>Recuperare il retentato CFP concentrato da 100 kDa (100R) secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione (vedi Tabella dei materiali). Una volta recuperato il 100R, lavare il filtro con un volume minimo di 1x PBS almeno tre volte e raggruppare il lavaggio con il 100R per massimizzare il recupero.</li>
	<li>Quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninico (BCA) seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Per eseguire il test, utilizzare diverse diluizioni di campioni 1:2, 1:5 e 1:10 in PBS. Testare il campione in triplice copia. NOTA: conservare una parte del materiale 100R per la qualificazione a valle, se lo si desidera. Conservare a 4 °C.</li>
</ol>2. Cromatografia di esclusione dimensionale per l'arricchimento di MTB EV da CFP
NOTA: La seguente procedura è specifica per l'utilizzo di 3 mg di 100R Mtb CFP con colonna SEC e collettore automatico di frazioni (AFC, vedi Tabella dei materiali). Può essere adattato per altre concentrazioni di partenza e tipi di colonne seguendo le specifiche del produttore. Inoltre, si consiglia agli utenti di leggere e comprendere il manuale utente del raccoglitore automatico di frazioni.
<ol><li>Consentire alla colonna SEC di equilibrarsi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità tower e regolare le impostazioni per la cella di carico, se necessario, premendo SETUP sul touchscreen del menu principale. La cella di carico deve essere calibrata solo al primo utilizzo, dopo ogni aggiornamento del software e se si nota un'incoerenza nei volumi di raccolta delle frazioni.</li>
	<li>Dalla schermata SETUP , allineare il carosello selezionando CAROSELLO > CALIBRA. Inserire la giostra con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare la giostra in modo che l'ugello del fluido sia direttamente sopra la posizione di scarico premendo i pulsanti - e/ o + .</li>
	<li>Rimuovere i tappi dalla colonna SEC bilanciata. Far scorrere la colonna SEC nel supporto a colonna appropriato e installarla con attenzione sulla torre AFC. Assicurarsi che il tag di identificazione a radiofrequenza (RFID) sulla colonna sia rivolto verso l'AFC e verificare che la connessione tra la colonna e la valvola sia sicura. Posizionare il tubo di uscita dei rifiuti in un contenitore di raccolta.</li>
	<li>Dalla schermata SETUP , selezionare Collection Schedule e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0,5 mL premendo i pulsanti - e/o + . Lasciare l'impostazione "Volume buffer" come valore predefinito di 2,7 ml, quindi chiudere la finestra "Pianificazione raccolta" premendo X.</li>
	<li>Selezionare START COLLECTION dalla schermata iniziale e confermare i parametri di raccolta selezionando YES. Caricare 13 tubi microcentrifuga etichettati da 1,7 mL con i coperchi aperti e rivolti verso il centro della giostra.</li>
	<li>Avanzate l'AFC selezionando OK, quindi montate il serbatoio della colonna e avanzate di nuovo premendo OK. Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo YES e aggiungere un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 μm per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il lavaggio, far avanzare l'AFC premendo OK.</li>
	<li>Posizionare il coperchio della giostra sull'AFC e premere OK. Preparare un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 μm. Utilizzare una pipetta per rimuovere il buffer in eccesso dalla colonna.</li>
	<li>Portare 3 mg di campione 100R come quantificato nei passaggi da 1,5 a 500 μL con 1x PBS. Aggiungere il campione da 3 mg nella parte superiore della colonna. Fate avanzare l'AFC e lasciate che il campione si imbatta nella fritta. Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato nel passaggio 2.6 al serbatoio.</li>
	<li>Monitorare l'esecuzione dell'AFC mentre raccoglie prima il volume del vuoto e poi le frazioni specificate. Dopo che la corsa è stata completata e la giostra ritorna in posizione di scarico, rimuovere il coperchio e rimuovere i tubi di frazione dalla giostra. Conservare le frazioni a 4 °C prima della quantificazione (fase 3) e della qualifica (fase 4).</li>
	<li>Se la colonna deve essere riutilizzata, selezionare l'opzione per pulire la colonna premendo SÌ; in caso contrario, premere NO. Seguire le istruzioni sull'AFC. NOTA: una volta che la colonna è stata lavata e il buffer di stoccaggio è stato attraversato, può essere rimosso, tappato e conservato a 4 °C.</li>
</ol>3. Quantificazione dei veicoli elettrici Mtb
<ol><li>Misurare la concentrazione proteica per ogni frazione utilizzando BCA e micro BCA12.<ol>
<li>Per frazioni da 0,5 mL raccolte da 3 mg di 100R Mtb CFP, utilizzare il micro BCA con diluizione 1:3 per frazioni numerate 1-7 di ciascun campione in triplice copia.</li>
		<li>Per frazioni di 0,5 ml numerate 5-13, utilizzare il BCA senza diluizione per ciascun campione in triplice copia. NOTA: la sovrapposizione dei saggi per le frazioni 5-7 contribuirà a garantire che tutte le frazioni abbiano un output leggibile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantitare la concentrazione di particelle per ogni frazione utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA).<ol>
<li>Diluire i campioni in 1 mL di 1x PBS utilizzando i seguenti rapporti di partenza suggeriti; per le frazioni 1-3, utilizzare 1:100, quindi per le frazioni rimanenti, utilizzare una diluizione 1:10.</li>
		<li>Vorticolare le soluzioni diluite e quindi prelevare il campione in una siringa monouso da 1 mL. Impostare la siringa in una pompa automatica a siringa, se disponibile.</li>
		<li>Impostare la pompa della siringa su 30 μL/min e utilizzare le impostazioni di acquisizione video con un guadagno dello schermo di 10-12 e un livello della fotocamera di 10-12. Regolare la messa a fuoco per ogni campione.</li>
		<li>Raccogli un minimo di tre video a 30 s ciascuno utilizzando un flusso costante.</li>
		<li>Eseguire l'analisi con la soglia di rilevamento del software impostata su cinque. NOTA: potrebbe non essere possibile ottenere dati NTA per le frazioni più recenti (>7) senza sacrificare un volume significativo del campione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Qualificazione dei veicoli elettrici Mtb
<ol><li>Visualizza il profilo proteico generale di ogni frazione utilizzando un gel proteico macchiato d'argento. NOTA: Le procedure dettagliate per SDS-PAGE e la macchia d'argento sono disponibili nel riferimento15.<ol>
<li>Aggiungere il buffer del campione SDS a 10 μL di ciascuna frazione e 5 μg di CFP, 100R e 100F. Far bollire per 5 minuti a 100 °C, quindi caricare su un gel Bis-Tris al 4%-12% con una scala a peso molecolare per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Eseguire il gel utilizzando 1x 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid (MES) running buffer (vedi Tabella dei materiali) e una corrente di 200 V per 35 min.</li>
		<li>Rimuovere il gel dalla cassetta e procedere con la colorazione dell'argento15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valutare la presenza o l'assenza di marcatori EV in ogni frazione per Western blot. NOTA: le procedure dettagliate per il Western blotting sono disponibili nel riferimento15.<ol>
<li>Eseguire un gel SDS-PAGE come descritto nei passaggi 4.1.1-4.1.2.</li>
		<li>Rimuovere il gel dalla cassetta e trasferire le proteine risolte su una membrana di nitrocellulosa da 0,2 μm (vedere Tabella dei materiali) applicando una corrente di 50 V per un minimo di 1 ora.</li>
		<li>Eseguire analisi Western blot per valutare le proteine di interesse. Si raccomandano anticorpi primari contro LpqH, lipoarabinomannan (LAM) e GroES (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Frazioni del pool basate sulla presenza o l'assenza di marcatori come applicabile per l'applicazione a valle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confermare la presenza di vescicole intatte mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).<ol>
<li>Fissare 15 μL del campione di vescicola aggiungendo 15 μL di paraformaldeide di grado EM al 4% e conservare a 4 °C durante la notte.</li>
		<li>Preparare una griglia TEM in rame rivestito in carbonio a 200 maglie pulendo la superficie e creando un substrato idrofilo. NOTA: si consiglia la pulizia al plasma con il 95% di argon, il 5% di ossigeno e il 30% di potenza al plasma per 1 minuto.</li>
		<li>Rilasciare 10 μL del campione fisso sulla griglia e lasciare che il campione aderisca per 10 minuti, quindi asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro.</li>
		<li>Far galleggiare la griglia su una goccia di acqua ultrapura per 30 s, quindi eliminare il liquido in eccesso.</li>
		<li>Far galleggiare la griglia su una goccia di acetato di uranile di grado EM d% per 2 minuti, quindi eliminare il liquido in eccesso.</li>
		<li>Lasciare asciugare completamente la griglia all'aria.</li>
		<li>Immagine utilizzando un TEM (vedi Tabella dei materiali) a 100 kV o simile. NOTA: altri metodi di quantificazione e caratterizzazione dei veicoli elettrici devono essere utilizzati in base alle applicazioni a valle. Le informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari18 devono essere consultate per le linee guida per garantire il rigore e la riproducibilità di tutti gli studi EV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921(2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111(2014).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li>
<li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li>
<li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li>
<li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208(1996).</li>
<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022).</li>
<li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li>
<li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans%3A+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li>
<li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le vescicole extracellulari di Mycobacterium tuberculosis sono serbatoi altamente antigenici, che li presentano come una strada attraente per lo sviluppo di strumenti diagnostici e futuri vaccini 4,19,20. Storicamente, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata utilizzata per separare i veicoli elettrici Mtb da altri materiali solubili e secreti8. Sebbene questo processo sia efficace...

Il rilascio di vescicole extracellulari (EV) da parte di agenti patogeni può essere la chiave per sbloccare nuove tecnologie per controllare le malattie infettive1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è un agente patogeno di alta conseguenza, che infetta circa un terzo della popolazione mondiale e reclama la vita di milioni di persone ogni anno2. La produzione di VEICOLI ELETTRICI da parte di Mtb è ben documentata ma sfuggente nella biogenesi e nei vari ruoli (cioè immunostimolante, immunosoppressiva, ferro e acquisizione di nutrienti) di questi veicoli elettrici nel contesto dell'infezione 3,4,5. Gli sforzi per comprendere la composizione dei veicoli elettrici Mtb hanno rivelato sfere chiuse con membrana lipidica a 50-150 nm derivate dalla membrana plasmatica contenenti lipidi e proteine di significato immunologico 3,6. Lo studio del ruolo dei veicoli elettrici Mtb nella fisiologia batterica ha rivelato l'importanza della modulazione batterica ev in risposta allo stress ambientale per la sopravvivenza5. Gli studi di interazione ospite-patogeno sono stati più complicati da interpretare, ma le prove indicano che i veicoli elettrici Mtb possono influenzare la risposta immunitaria dell'ospite e possono potenzialmente servire come componente di vaccinazione efficace 3,4,7.
La maggior parte degli studi sui veicoli elettrici Mtb finora si sono basati sull'ultracentrifugazione del gradiente di densità per l'arricchimento dellevescicole 8. Questo è stato efficace per studi su piccola scala; tuttavia, questa tecnica presenta diverse sfide tecniche e logistiche. Flussi di lavoro alternativi accoppiano la centrifugazione multistep, per la rimozione di intere celle e detriti di grandi dimensioni, con una fase finale di ultracentrifugazione ai veicoli elettrici a pellet. Questa metodologia può variare in termini di efficienza e spesso si traduce in una bassa resa e co-purificazione di biomolecole solubili non associate alle vescicole, influenzando anche l'integrità dellevescicole 9. Inoltre, questo processo richiede molto tempo, richiede un uso manuale e un throughput molto limitato a causa dei vincoli delle apparecchiature.
Il presente protocollo descrive una tecnica alternativa all'ultracentrifugazione a gradiente di densità: la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Questo metodo è stato dimostrato per i micobatteri ambientali e nel lavoro attuale è stato estrapolato a Mtb10. Una colonna disponibile in commercio e un collettore automatico di frazioni possono migliorare la coerenza nella preparazione vescicale e ridurre la necessità di attrezzature specifiche e costose. È anche possibile completare questo protocollo in una frazione del tempo rispetto all'ultracentrifugazione del gradiente di densità, aumentando la produttività. Questa tecnica è meno impegnativa dal punto di vista tecnico, rendendola più facile da padroneggiare e può aumentare la riproducibilità inter/intra-laboratorio. Infine, SEC ha un'elevata efficienza di separazione ed è delicato, preservando l'integrità delle vescicole.

<table><tbody><tr><td>20x MES SDS Running Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Collettore automatico di frazioni</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Centrifuga</td> da banco <td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td>Ladder per proteine precolorate</tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - 70 Filtro centrifugo, cutoff 100 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>Dispositivo di ultrafiltrazione utilizzato nella fase 1.1</td></tr><tr><td>Sistema di elettroblotting</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica con paraformaldeide di grado EM</td><td>Scienze</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Griglie</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>FCF200H-Cu-TA</td><td></td></tr><tr><td>Capra Anti-Topo IgG H& L (fosfatasi alcalina), molecola intera, 1 mL</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>JEM-1400 Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>JOEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (gene Rv3814c)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-49223</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13792</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario Monocolonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13811</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Fischione Instruments</td><td></td><td>Per la pulizia al plasma della griglia TEM</td></tr><tr><td>Nanosight dotato di pompa a siringa e computer con software NanoSight NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa, Roll, 0.2 &mu; m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, 1X senza calcio e magnesio</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr> Kit per il <tr><td>dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Alimentatore di base</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV Originale 35 nm 5/pk</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>Colonna SEC</td></tr><tr><td>Tampone campione SDS</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>Ricetta interna utilizzata in questa procedura, tuttavia questo prodotto è equivalente</td></tr><tr><td>Camera gel SDS-PAGE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>Protocollo interno utilizzato in questa procedura, tuttavia questo kit è equivalente</td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>all'acetato di uranile</td><td>Scienze 22400</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nel contesto dell'infezione batterica è emerso come una nuova strada per comprendere la fisiologia microbica. In particolare, i veicoli elettrici Mycobacterium tuberculosis (Mtb) svolgono un ruolo nell'interazione ospite-patogeno e nella risposta allo stress ambientale. I veicoli elettrici Mtb sono anche altamente antigenici e mostrano un potenziale come componenti del vaccino. Il metodo più comune per purificare i veicoli elettrici Mtb è l'ultracentrifugazione del gradiente di densità. Questo processo presenta diverse limitazioni, tra cui bassa produttività, bassa resa, dipendenza da attrezzature costose, sfide tecniche e può avere un impatto negativo sulla preparazione risultante. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è un metodo alternativo più delicato che combatte molte delle limitazioni dell'ultracentrifugazione. Questo protocollo dimostra che SEC è efficace per l'arricchimento Mtb EV e produce preparazioni Mtb EV di alta qualità di maggiore resa in modo rapido e scalabile. Inoltre, un confronto con l'ultracentrifugazione del gradiente di densità mediante procedure di quantificazione e qualificazione dimostra i vantaggi della SEC. Mentre la valutazione della quantità ev (analisi del tracciamento delle nanoparticelle), del fenotipo (microscopia elettronica a trasmissione) e del contenuto (Western blotting) è adattata ai veicoli elettrici Mtb, il flusso di lavoro fornito può essere applicato ad altri micobatteri.

La proteina filtrata di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata concentrata, quantificata e quindi 3 mg di materiale sono stati applicati a una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Le concentrazioni di proteine e particelle sono state enumerate rispettivamente da BCA e NTA. Gli intervalli previsti per il recupero di proteine e particelle più i valori esatti ottenuti per questi risultati sono riportati nella Tabella 1. Valori molto più alti di questi interv...

Questo protocollo descrive la cromatografia di esclusione dimensionale, una tecnica facile e riproducibile per arricchire le vescicole extracellulari del Mycobacterium tuberculosis dai supernatanti di coltura.

Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Questo protocollo riduce la complessità tecnica e il tempo necessario per l'arricchimento di vescicole extracellulari da Mycobacterium tuberculosis, EV Mtb. Fornisce un'alternativa delicata alle tradizionali tecniche di ultracentrifugazione e basate sulla densità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da eseguire, rendendola più riproducibile.Fornisce un'alta resa di EV Mtb con un minimo co-arricchimento proteico non-EV. A dimostrare la procedura sarà Joanie Ryan, ex studentessa laureata del nostro laboratorio. Per iniziare, preparare un filtro centrifugo di taglio del peso molecolare da 100 kilodalton aggiungendo l'intera capacità volumetrica di PBS.Centrifugare per cinque minuti a 2.800 volte G a 4 gradi Celsius. Scartare il flowthrough e qualsiasi PBS rimanente e riempire la camera di campionamento con Mtb CFP alla sua capacità massima. Centrifugare a 2.800 volte G a 4 gradi Celsius fino a quando il volume si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione.Se necessario, ripetere fino a quando l'intero campione non sia stato sufficientemente ridotto. Aggiungere 1X PBS all'unità filtrante contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto in precedenza e ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e lo scambio di tampone.Quindi, recuperare il retentato CFP concentrato da 100 kilodalton o 100R, secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione. Lavare il filtro con un volume minimo di 1X PBS almeno tre volte e tirare il lavaggio con 100R per massimizzare il recupero. Utilizzare diverse diluizioni di campioni in PBS e quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninic.Testare il campione in triplice copia. Consentire la cromatografia di esclusione dimensionale, o colonna SEC, per equilibrare a temperatura ambiente. Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità tower e, se necessario, premere Setup sul touch screen del menu principale per regolare le impostazioni della cella di carico.Dalla schermata di configurazione, allineare il carosello selezionando Carousel seguito da Calibrate. Inserire il carosello con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare il carosello premendo i pulsanti meno o più in modo che l'ugello del fluido sia direttamente sopra la posizione di lavaggio. Rimuovere i tappi dalla colonna SEC equilibrata e far scorrere la colonna SEC nel supporto della colonna appropriato.Installarlo con cura sulla torre AFC. Assicurarsi che l'etichetta di identificazione a radiofrequenza sulla colonna sia rivolta verso l'AFC e verificare che il collegamento tra la colonna e la valvola sia sicuro. Posizionare il tubo di scarico dei rifiuti in un contenitore di raccolta.Dalla schermata di configurazione, selezionare Programma di raccolta e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0,5 millilitri premendo i pulsanti meno o più. Lasciare l'impostazione del volume del buffer come predefinita di 2,7 millilitri, quindi chiudere la finestra di pianificazione della raccolta. Selezionare Avvia raccolta dalla schermata iniziale e confermare i parametri di raccolta selezionando Sì.Carico 13 tubi di microcentrifuga etichettati da 1,7 millilitri con i coperchi aperti e rivolti verso il centro della giostra. Avanzare l'AFC selezionando OK, quindi montare il serbatoio della colonna e avanzare di nuovo premendo OK. Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo Sì e aggiungere un volume di colonna di PBS filtrato a 0,2 micrometri per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il flush (AFC), far avanzare l'AFC premendo OK. Posizionare il coperchio del carosello sull'AFC e premere OK. Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali buffer in eccesso dalla colonna.Portare tre milligrammi di campione 100R a 500 microlitri con 1X PBS e aggiungere il campione nella parte superiore della colonna. Preparare un volume di colonna di PBS filtrato a 0,2 micrometri. Far avanzare l'AFC e lasciare che il campione si svolga nel tastio.Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato in precedenza al serbatoio. Monitorare l'esecuzione dell'AFC mentre raccoglie prima il volume vuoto e quindi le frazioni specificate. Al termine della corsa e la giostra ritorna nella posizione di scarico, rimuovere il coperchio e i tubi di frazione dal carosello.Per frazioni di 0,5 millimetri raccolte da tre milligrammi di CFP 100R Mtb, misurare la concentrazione proteica utilizzando il micro-BCA con una diluizione 1:3 per le frazioni numerate da 1 a 7 di ciascun campione in triplice copia. Per frazioni da 0,5 millilitri numerate da 5 a 13, utilizzare il BCA senza diluizione per ciascun campione in triplice copia. Aggiungere tampone campione SDS a 10 microlitri di ciascuna frazione e cinque microgrammi di CFP e 100R.Far bollire per cinque minuti a 100 gradi Celsius. Quindi caricare su un gel Bis-Tris dal 4 al 12% con una scala a peso molecolare per elettroforesi su gel di poliacrilammide o PAGE. Eseguire un gel SDS-PAGE utilizzando un buffer MES 1X e una corrente di 200 volt per 35 minuti.Rimuovere il gel dalla cassetta e applicare una corrente di 50 volt per un minimo di un'ora per trasferire le proteine risolte su una membrana nitrocellulosa di 0,2 micrometri. Infine, eseguire l'analisi Western blot per valutare le proteine. Un gel SDS-PAGE colorato con argento dimostra il profilo proteico complessivo per ogni frazione.I dati mostrano che le frazioni successive contengono più proteine e assomigliano al materiale 100R. I Western blot che rilevano LAM, LpqH e GroES dimostrano che i marcatori proteici cambiano tra le frazioni. Qui sono mostrate la microscopia elettronica a trasmissione, o immagini TEM, delle frazioni SEC da 1 a 3 tirate prima della fissazione.L'ultracentrifugazione del gradiente di densità dei veicoli elettrici Mtb è stata colorata negativamente per l'imaging TEM. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, o distribuzione NTA, delle frazioni SEC da 1 a 3 è mostrata qui. I veicoli elettrici Mtb a ultracentrifugazione a gradiente di densità sono stati analizzati con analisi di tracciamento delle nanoparticelle e la distribuzione delle dimensioni è visualizzata qui.Questo protocollo è stato ottimizzato per la purificazione EV da tre milligrammi di 100R. Se il carico proteico è variato, la diluizione raccomandata e la strategia BCA sulle frazioni risultanti possono richiedere aggiustamenti. I veicoli elettrici Mtb preparati con questa tecnica possono essere utilizzati per studi composizionali e omici a valle.Sono adatti anche per esperimenti in vitro e in vivo. Questa tecnica fornisce un modo semplice ed efficiente per produrre preparati EV Mtb di alta qualità, aprendo la strada a una maggiore riproducibilità nei futuri esperimenti di EV Mtb.

mycobacterium-tuberculosis-extracellular-vesicle-enrichment-through

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari prodotte da micobatteri limitati al ferro. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'isolamento graduale di vescicole extracellulari (EV) da Mycobacterium tuberculosis coltivate in condizioni limitanti il ferro che imitano l'ambiente ospite. Descrive l'uso dell'ultrafiltrazione, della centrifugazione differenziale e della separazione in gradiente di densità per arricchire e identificare le frazioni...

Isolamento di vescicole extracellulari contenenti siderofori da Mycobacterium tuberculosis

Fonte: Watson, DC, et.al. Isolamento e purificazione scalabili di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'isolamento e la concentrazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dalla membrana esterna di batteri geneticamente modificati. Il processo prevede la coltura dei batteri per rilasciare le vescicole extracellulari, seguita da fasi sequenziali di centrifugazione e filtrazione per rimuovere cellule e detriti. Infine,...

Isolamento e arricchimento di vescicole extracellulari derivate dalla membrana esterna da batteri

Fonte: Watson, D. C., et al. Isolamento e purificazione scalabili di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'uso della cromatografia ad esclusione dimensionale con perle di resina porosa per isolare le vescicole extracellulari batteriche (EV) da un filtrato di coltura batterica. Le vescicole extracellulari più grandi eluiscono presto bypassando i pori della resina, mentre le proteine più piccole entrano nei pori ed eluiscono più...

Isolamento di vescicole extracellulari batteriche mediante cromatografia ad esclusione dimensionale 

In questo video, dimostriamo una tecnica di cromatografia ad esclusione dimensionale per separare una popolazione eterogenea di vescicole della membrana esterna o OMV derivate da batteri. Queste vescicole sono strutture sferiche di dimensioni nanometriche e vengono separate in sottopopolazioni grandi e piccole in base alle loro dimensioni attraverso la cromatografia ad esclusione dimensionale.

Separazione basata sulla cromatografia ad esclusione dimensionale di vescicole extracellulari batteriche: una tecnica per separare la popolazione eterogenea di vescicole batteriche Gram-negative della membrana esterna in base alle loro dimensioni

Questo video dimostra l'isolamento e la concentrazione delle proteine filtrate della coltura batterica, che includono vescicole extracellulari batteriche, utilizzando l'ultrafiltrazione. Le vescicole extracellulari concentrate fungono da marcatori diagnostici per il rilevamento della malattia.

Concentrazione di proteine filtrate per colture batteriche utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione

Questo video mostra la tecnica di cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per purificare le vescicole extracellulari batteriche (EV) dal filtrato di coltura di Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La tecnica utilizza una colonna porosa impaccata di resina per ottenere frazioni purificate di EV. Le particelle porose consentono selettivamente alle proteine più piccole di entrare nei pori, con conseguente eluizione più lenta. Allo stesso tempo, le vescicole extracellulari sono escluse...

Una tecnica di cromatografia ad esclusione dimensionale per purificare le vescicole extracellulari micobatteriche

Mycobacterium tuberculosis mostra un aumento della produzione e del rilascio di vescibole extracellulari in risposta a basse condizioni di ferro. Questo lavoro descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di basse condizioni e metodi di ferro per la purificazione e la caratterizzazione delle vesciche extracellulari micobatteriche rilasciate in risposta alla carenza di ferro.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro

Le vescicole batteriche svolgono un ruolo importante nella patogenesi e hanno promettenti applicazioni biotecnologiche. L'eterogeneità delle vescicole complica l'analisi e l'uso; pertanto, è necessario un metodo semplice e riproducibile per separare le varie dimensioni delle vescicole. Qui, dimostriamo l'uso della cromatografia di esclusione dimensionale per separare vescicole eterogenee prodotte da Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografia di esclusione dimensionale per analizzare l'eterogeneità delle vescicole della membrana esterna batterica

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l'arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.

Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni

Scopri l'arricchimento delle vescicole extracellulari di Mycobacterium tuberculosis mediante cromatografia di esclusione dimensionale. Questo metodo semplice e riproducibile offre un'alternativa delicata alle tecniche tradizionali.

Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale

Esplora altri video