Name: Metodi per lallevamento del parassitoide Ganaspis brasiliensis, un promettente agente di controllo biologico per la Drosophila suzukii invasiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Scopri i metodi per l'allevamento di Ganaspis brasiliensis, un parassitoide utile contro Drosophila suzukii. Questo protocollo efficiente supporta la ricerca e il rilascio in campo di questo promettente agente di controllo biologico.

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Gli autori ringraziano Lukas Seehausen e Marc Kenis (CABI, Svizzera) per aver gentilmente fornito G1 G. brasiliensis. I finanziamenti in Italia sono stati forniti dalla Provincia Autonoma di Trento, Trento, Italia, e negli Stati Uniti dal National Institute of Food and Agriculture, dal premio USDA Specialty Crops Research Initiative (# 2020-5118-32140), dall'USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fondo 14-8130-0463) e dai fondi di base USDA ARS CRIS (progetto 8010-22000-033-00D). L'USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro e non approva i prodotti menzionati in questa pubblicazione.

1. Metodi per l'allevamento in laboratorio su piccola scala di G3 Ganaspis brasiliensis
<ol><li>Prepara la dieta dell'ospite.<ol>
<li>Aggiungere 600 ml di acqua distillata in un contenitore di vetro da 1.500 ml e riscaldare l'acqua su una piastra calda.</li>
		<li>Aggiungere 88,6 g di dieta secca disponibile in commercio (a base di agar, lievito di birra, farina di mais, metil parabene e saccarosio) o preparare la dieta utilizzando la formula pubblicata da Dalton et al.28 (vedere il passaggio 2.1.2).</li>
		<li>Aggiungere 300 ml di acqua distillata nella dieta secca e mescolare accuratamente la miscela dietetica.</li>
		<li>Aggiungere la miscela all'acqua bollente.</li>
		<li>Lasciare bollire la dieta liquida sulla piastra calda per 10 minuti mescolando periodicamente la miscela per evitare che si bruci.</li>
		<li>Lasciare raffreddare la dieta a temperatura ambiente per 30 minuti mescolando di tanto in tanto per distribuire uniformemente il rilascio di calore e impedire alla dieta di solidificarsi sulla superficie.</li>
		<li>Misurare 6,7 mL di EtOH al 95% in un contenitore e 3,5 mL di soluzione di acido propionico da 1 M in un altro contenitore.</li>
		<li>Una volta che la dieta si è raffreddata, aggiungere l'EtOH e poi la soluzione di acido propionico, mescolando accuratamente dopo ogni aggiunta.</li>
		<li>Preparare i mirtilli (acquistati dal mercato locale) risciacquandoli in acqua fredda, quindi in una soluzione di candeggina all'ipoclorito di sodio (diluita al 5%) e di nuovo acqua fredda.</li>
		<li>Asciugare i frutti con un tovagliolo di carta e schiacciarli manualmente fino a quando la buccia di ciascun frutto è rotta e i succhi e la polpa del frutto sono esposti.</li>
		<li>Aggiungere 25-30 g di purè di mirtilli a ogni pallone da 250 ml. Toccare i lati del pallone per assicurarsi che il fondo interno del pallone sia coperto da uno strato uniforme di purè di mirtilli.</li>
		<li>Versare la dieta preparata in ogni pallone in modo che copra solo la parte superiore del purè di mirtilli.</li>
		<li>Aggiungere tappi di schiuma al collo dei palloni e lasciare che la dieta si solidifichi a temperatura ambiente (Figura 1).</li>
		<li>Una volta che la dieta si è solidificata, utilizzarla immediatamente o conservare a 5 °C per un massimo di 3 settimane.</li>
	</ol></li>
	<li>Ospite posteriore Drosophila suzukii.
	<ol>
<li>Rimuovere la dieta immagazzinata dal frigorifero e lasciarla equilibrare alla temperatura ambiente o utilizzare una dieta appena fatta.</li>
		<li>Tagliare un pezzo di carta assorbente (ad esempio, 5 cm x 20 cm) e ruotarlo al centro. Posizionare la sezione centrale attorcigliata del tovagliolo di carta nel matraccio (Figura 1).</li>
		<li>Bagnare il tovagliolo di carta e la superficie della dieta con acqua distillata per trattenere l'umidità.</li>
		<li>Trasferire le mosche adulte sessualmente mature dalle attuali fiasche della colonia a una nuova fiaschetta dietetica rimuovendo con cura il tappo sul vecchio pallone e invertendo rapidamente il pallone e allineando l'apertura del vecchio pallone con il nuovo pallone.</li>
		<li>Picchiettare delicatamente sul lato del vecchio pallone per indurre le mosche a cadere nel nuovo pallone. Assicurati che ci siano ~ 25-30 coppie di accoppiamento di D. suzukii nel nuovo pallone. Una volta che ci sono abbastanza mosche nel nuovo pallone, capovolgere rapidamente il vecchio pallone in posizione verticale e sostituire i tappi su entrambi i palloni.</li>
		<li>Ripeti i trasferimenti di mosche fino a quando non rimangono mosche nelle vecchie fiasche. Se necessario, unire o raccogliere le mosche da più di un vecchio pallone in un nuovo pallone per assicurarsi che ci siano abbastanza mosche (20-30 paia) per pallone.</li>
		<li>Tenere i nuovi palloni dopo una settimana di esposizione alle mosche adulte in condizioni adeguate (21 °C, 16 L: 8 D fotoperiodo, 60%-80% di umidità relativa [RH%]) in una camera ambientale per 3 settimane per l'emergenza della mosca.</li>
	</ol></li>
	<li>Esporre le larve dell'ospite ai parassitoidi.<ol>
<li>Prendere un pallone (vedi punto 1.2.7) contenente uova di mosca e larve dopo aver rimosso eventuali mosche adulte e il tovagliolo di carta attorcigliato dal pallone.</li>
		<li>Piegare un pezzo di carta assorbente a metà e metterlo nel pallone come substrato di pupa per le larve parassitate.</li>
		<li>Aspirare sei coppie femminili e maschili di G3 G. brasiliensis in ciascun pallone (Figura 1). Strisciare un sottile strato di miele sul fondo del tappo di schiuma.</li>
		<li>Lasciare i parassitoidi nel pallone per 5 giorni.</li>
		<li>Dopo un'esposizione di 5 giorni, rimuovere i parassitoidi e tenere i palloni nelle condizioni sopra descritte in una camera ambientale per 35 giorni fino all'emergenza prevista della vespa.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogli e conserva i parassitoidi adulti.<ol>
<li>Durante la seconda e la terza settimana di incubazione, controllare i palloni settimanalmente per l'emergenza precoce dell'ospite e rimuovere le mosche adulte.</li>
		<li>Una volta che i parassitoidi adulti iniziano ad emergere, aspirarli tre volte alla settimana e tenerli in flaconcini di drosophila (ad esempio, 2,5 cm x 9,5 cm) (Figura 1).</li>
		<li>Posizionare un piccolo pezzo di carta assorbente inumidito, ma non saturo, con acqua distillata sul fondo del flaconcino.</li>
		<li>Aggiungere ~60 parassitoidi a ciascun flaconcino ed etichettare il flaconcino con le date di emergenza. Strisciare un sottile strato di miele sul fondo del tappo di schiuma, due volte a settimana. Conservare i flaconcini con parassitoidi adulti nelle condizioni sopra descritte nella camera ambientale per un massimo di un mese se non utilizzati prima.</li>
		<li>Rimostrare la carta nel flaconcino una volta ogni 4-7 giorni o sostituire il tovagliolo di carta se ci sono segni di muffa.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Metodi per l'allevamento su larga scala di G1 Ganaspis brasiliensis
<ol><li>Implementare un allevamento su larga scala dell'ospite Drosophila suzukii.
	<ol>
<li>D. suzukii posteriore all'interno di grandi gabbie ricoperte di maglie a maglia (ad esempio, 50 cm x 50 cm x 100 cm) contenenti ciascuna 1.500-2.000 mosche adulte sessualmente mature (rapporto tra i sessi 50:50) (Figura 2).</li>
		<li>Preparare la Drosophila Medium Standard (SDM) facendo bollire tutti gli ingredienti (6 g di agar batteriologico, 75 g di farina di mais, 17 g di lievito alimentare, 15 g di saccarosio, 10 g di farina di soia, 10 ml di acido propionico) in 1 L di acqua distillata per 10 minuti mescolando periodicamente la miscela per evitare che si bruci28.</li>
		<li>Lasciare raffreddare il composto per 5 minuti e aggiungere 5 g di acido ascorbico.</li>
		<li>Versare l'SDM appena cotto in piastre di Petri da 9 cm e lasciare che il mezzo si solidifichi a temperatura ambiente prima di chiudere le piastre.</li>
		<li>Impilare le piastre di Petri SDM, avvolgere la pila con un foglio di alluminio e conservare le piastre a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
		<li>All'interno di ogni gabbia di allevamento, posizionare un piatto con cotone imbevuto d'acqua e da quattro a sei piastre di Petri con SDM (Figura 2).</li>
		<li>Due volte a settimana, sostituire le piastre di Petri SDM infestate con quelle fresche.</li>
		<li>Posizionare le piastre di Petri SDM infestate senza coperchio singolarmente in bicchieri di plastica (13,3 cm di diametro o 800 ml), chiudere ogni tazza con un rivestimento di rete fine (<0,5 mm) e incubare per 12-15 giorni a 23 °C e 75% RH (Figura 2).</li>
		<li>Trasferire gli adulti D. suzukii appena nati dai bicchieri di plastica alle gabbie di allevamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare le larve dell'ospite.<ol>
<li>Risciacquare i mirtilli in acqua fredda per 1 minuto e immergere i frutti in una bacinella riempita con una soluzione di candeggina (diluita al 5%) per 3 minuti.</li>
		<li>Scolare la soluzione di candeggina e riempire la bacinella con acqua fredda per risciacquare i mirtilli. Mescolare delicatamente a mano per almeno 30 s.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.2.2 con acqua dolce almeno tre volte per rimuovere i residui di candeggina e altri artropodi (ad esempio acari, tripidi) che possono essere presenti sul frutto.</li>
		<li>Posizionare il frutto su un vassoio con diversi strati di carta assorbente e inclinare con cura il vassoio avanti e indietro, arrotolando le bacche per asciugarle.</li>
		<li>Preparare diverse piastre di Petri da 9 cm (la metà superiore o inferiore, rivolta verso l'alto) e riempire ciascuna con i mirtilli lavati (15-25 frutti per piatto a seconda delle dimensioni del frutto).</li>
		<li>Durante le ore del tardo pomeriggio, esporre le piastre di Petri a mosche adulte sessualmente mature all'interno delle gabbie di allevamento dell'ospite (vedere il punto 2.1) e lasciarle durante la notte.</li>
		<li>La mattina successiva, rimuovere le piastre di Petri dalle gabbie di allevamento dell'ospite soffiandole delicatamente o picchiettandole per rimuovere le mosche sui frutti e utilizzare il frutto infestato per l'allevamento di parassitoidi (vedere il punto 2.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Implementare un allevamento di parassitoidi su larga scala.<ol>
<li>Usa due tipi di gabbie per allevare il parassitoide: una per il parassitismo e un'altra per l'emergenza della vespa.</li>
		<li>Assicurarsi che la gabbia per parassitismo sia cubica (ad esempio, 45 cm per lato) con un pannello di plastica trasparente sul davanti per osservare l'attività degli insetti, due aperture per maniche da 18 cm nel pannello frontale per l'aggiunta o la rimozione di insetti e la sostituzione di materiale alimentare e una rete in poliestere fine (ad esempio, rete 96 x 26) sulla parte superiore e sui lati per la ventilazione.</li>
		<li>Rendere la gabbia di emergenza più piccola (ad esempio, 30 cm per lato), con una singola apertura del manicotto su due lati opposti e un pannello di plastica trasparente sul davanti per la visibilità (Figura 2).</li>
		<li>Assicurarsi che entrambi i tipi di gabbia abbiano una corda sottile appesa sotto il soffitto da cui sospendere uno o più alimentatori (Figura 2). NOTA: Un alimentatore è costituito da un grande tappo cilindrico in schiuma (diametro 9 cm) ricoperto da goccioline di miele sparse e può essere posizionato sul pavimento della gabbia o appeso al soffitto della gabbia (Figura 2).</li>
		<li>All'interno di ogni gabbia, fornire acqua in un flaconcino di drosophila a parete diritta (2,5 cm x 9,5 cm) sigillato con un tappo di acetato di cellulosa (diametro 2,5 cm) ogni 5-7 giorni a seconda dell'RH. Appendere il flaconcino capovolto al soffitto della gabbia (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Esporre le larve dell'ospite ai parassitoidi.<ol>
<li>Esporre il frutto infestato dall'ospite all'interno delle piastre di Petri a G1 G. brasiliensis immediatamente dopo l'infestazione notturna di D. suzukii (vedere passo 2.2.7).</li>
		<li>Lasciare le 10-15 piastre di Petri di frutta infestata nella gabbia di parassitizzazione contenente 1.500-2.000 vespe per 2-3 giorni.</li>
		<li>Utilizzare bicchieri di plastica (13,3 cm di diametro o 800 ml) con strati di carta assorbente sul fondo per raccogliere il frutto contenente gli ospiti parassitizzati (Figura 2).</li>
		<li>Posizionare le coppette aperte nella gabbia di eclosione e incubare per almeno 28 giorni a 21 °C e 65% di umidità relativa (Figura 2).</li>
		<li>Durante la seconda e la terza settimana di incubazione, controllare settimanalmente la gabbia per l'eclosione precoce dell'ospite e rimuovere le mosche adulte per facilitare la successiva raccolta di parassitoidi.</li>
		<li>Alla fine della quarta settimana di incubazione, aggiungere un alimentatore e una fonte d'acqua alla gabbia.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogli e conserva i parassitoidi adulti.<ol>
<li>Una volta iniziata l'emergenza parassitoide, raccogli una porzione (10%-15%) degli adulti e trasferiscili nella gabbia del parassitismo per sostituire i vecchi individui improduttivi.</li>
		<li>Raccogliere e conservare i restanti parassitoidi in bicchieri di plastica (diametro 13,3 cm o 800 ml) (Figura 3A).</li>
		<li>Posizionare un tubo (2 ml) riempito d'acqua e sigillato con un rotolo di cotone dentale (1 cm x 3,8 cm) sul fondo della tazza (Figura 3A).</li>
		<li>Chiudere la tazza con un coperchio modificato dotato di un tappo in schiuma rimovibile (diametro 3,5 cm) come substrato di alimentazione e di un foro coperto di rete per la ventilazione (Figura 3B).</li>
		<li>Aggiungere fino a 700 adulti a ciascuna tazza (rapporto tra i sessi 50:50), etichettare la tazza con la data di emergenza e conservarla in una camera ambientale (17 °C; 65% RH) fino all'uso o per un massimo di 1 mese (Figura 3B).</li>
	</ol></li>
	<li>Spedisci i parassitoidi adulti.<ol>
<li>Utilizzare tubi conici (50 ml) per spedire i parassitoidi adulti.</li>
		<li>Forare un foro di ventilazione (diametro 8 mm) sul cappuccio e coprirlo con una rete a maglie sottili (Figura 3C).</li>
		<li>Aggiungere un anello di alimentazione in acetato di cellulosa all'interno del cappuccio (Figura 3C).</li>
		<li>Preparare una soluzione di saccarosio saturo usando acqua distillata, applicare alcune gocce sull'anello di alimentazione e lasciare che assorba il liquido.</li>
		<li>Posizionare un tovagliolo di carta assorbente a forma di ventaglio all'interno del tubo (Figura 3D).</li>
		<li>Aggiungi ~ 200 parassitoidi adulti a ciascun tubo e posiziona i tubi in un contenitore di spedizione isolato insieme a impacchi di ghiaccio.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Seehausen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+cryptic+parasitoid+species+reveals+its+suitability+as+a+biological+control+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evidence for a cryptic parasitoid species reveals its suitability as a biological control agent.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19096(2020).</li>
<li>Nomano, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differentiation+of+Ganaspis+brasiliensis+%28Hymenoptera%3A+Figitidae%29+from+East+and+Southeast+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Genetic differentiation of Ganaspis brasiliensis (Hymenoptera: Figitidae) from East and Southeast Asia.</a> Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 429-437 (2017).</li>
<li>Kasuya, N., Mitsui, H., Ideo, S., Watada, M., Kimura, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological%2C+morphological+and+molecular+studies+on+Ganaspis+individuals+%28Hymenoptera%3A+Figitidae%29+attacking+Drosophila+suzukii+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Ecological, morphological and molecular studies on Ganaspis individuals (Hymenoptera: Figitidae) attacking Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae).</a> Applied Entomology and Zoology. 48 (1), 87-92 (2013).</li>
<li>Matsuura, A., Mitsui, H., Kimura, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+study+on+distributions+and+oviposition+sites+of+Drosophila+suzukii+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29+and+its+parasitoids+on+wild+cherry+tree+in+Tokyo%2C+central+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">A preliminary study on distributions and oviposition sites of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) and its parasitoids on wild cherry tree in Tokyo, central Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 53 (1), 47-53 (2018).</li>
<li>Abram, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+records+of+Leptopilina%2C+Ganaspis%2C+and+Asobara+species+associated+with+Drosophila+suzukii+in+North+America%2C+including+detections+of+L.+japonica+and+G.+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hymenoptera+Research%22%5BJournal%5D)">New records of Leptopilina, Ganaspis, and Asobara species associated with Drosophila suzukii in North America, including detections of L. japonica and G. brasiliensis.</a> Journal of Hymenoptera Research. 78, 1-17 (2020).</li>
<li>Puppato, S., Grassi, A., Pedrazzoli, F., De Cristofaro, A., Ioriatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Leptopilina+japonica+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">First report of Leptopilina japonica in Europe.</a> Insects. 11 (9), 611(2020).</li>
<li>Dalton, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+survival+of+Drosophila+suzukii+under+simulated+winter+conditions+of+the+Pacific+Northwest+and+seasonal+field+trapping+in+five+primary+regions+of+small+and+stone+fruit+production+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Managagement+Science%22%5BJournal%5D)">Laboratory survival of Drosophila suzukii under simulated winter conditions of the Pacific Northwest and seasonal field trapping in five primary regions of small and stone fruit production in the United States.</a> Pest Managagement Science. 67 (11), 1368-1374 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

La ricerca a lungo termine e le successive emissioni sul campo di un agente di controllo biologico dipendono dalla disponibilità di tecniche di allevamento efficaci ed economiche. I metodi descritti in questo studio hanno dimostrato di essere protocolli efficienti sia per l'allevamento su piccola scala che su larga scala di Ganaspis brasiliensis. Il protocollo di allevamento su piccola scala è stato sviluppato nel corso di diversi anni per ottimizzare la quantità di manodopera e ridurre le attrezzature specializ...

Originaria dell'Asia orientale, la drosophila ad ala maculata, Drosophila suzukii (Matsumura) (Ditteri: Drosophilidae), si è diffusa nelle Americhe, in Europa e in alcune parti dell'Africa 1,2. La mosca è estremamente polifaga, essendo in grado di utilizzare vari frutti coltivati e selvatici con pelli morbide e sottili nelle sue regioni native e invase 1,2,3. Le attuali strategie di gestione per questo parassita si basano fortemente sull'uso frequente di insetticidi che colpiscono le mosche adulte nei campi coltivati quando i frutti sensibili stanno maturando. Vengono spesso utilizzati spray ripetuti, probabilmente a causa della costante ricaduta di popolazioni di mosche da giacimento provenienti da habitat non coltivati e della mancanza di nemici naturali efficaci residenti nelle regioni invase 1,4. Il controllo biologico, in particolare per mezzo di parassitoidi specializzati che si auto-perpetuano, può aiutare a sopprimere le popolazioni di mosche a livello paesaggistico e svolgere un ruolo fondamentale per la gestione sostenibile a livello di area di questo parassita altamente mobile e polifago 4,5,6.
Negli ultimi dieci anni, i ricercatori hanno concentrato gli sforzi per scoprire parassitoidi co-evoluti di Drosophila suzukii negli areali nativi della mosca in Asia orientale 7,8,9, così come parassitoidi efficaci ma recentemente associati nelle regioni invase della mosca nelle Americhe e in Europa 4,5,6. Nelle regioni appena invase della mosca, i parassitoidi larvali Drosophila comunemente presenti, come Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.), e L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), non sono in grado di svilupparsi o avere bassi livelli di parassitismo su D. suzukii a causa della forte resistenza immunitaria della mosca10. Solo alcuni parassitoidi pupali cosmopoliti e generalisti come Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) e Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) in Nord America e in Europa, e Trichopria anastrephae Lima in Sud America possono facilmente svilupparsi da questa mosca4. Al contrario, le esplorazioni in Asia orientale hanno scoperto un certo numero di parassitoidi larvali da D. suzukii 4,5,6. Tra questi, Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering e Leptopilina japonica Novković & Kimura sono i parassitoidi larvali dominanti 7,8,9,11. In particolare, i due figitidi (L. japonica e G. brasiliensis) erano i principali parassitoidi presenti prevalentemente nella frutta fresca infestata da D. suzukii e/o altri drosofilidi strettamente imparentati nella vegetazione naturale 7,8,9. Questi tre parassitoidi larvali asiatici sono stati importati in strutture di quarantena negli Stati Uniti e in Europa e valutati per la loro efficienza relativa 12,13,14,15,16,17, adattabilità climatica18, potenziali interazioni competitive interspecifiche 19 e, soprattutto, specificità dell'ospite 8,20,21 ,22.
Le valutazioni di quarantena hanno mostrato che Ganaspis brasiliensis era più specifico per l'ospite di Drosophila suzukii rispetto ad altri parassitoidi larvali asiatici testati, sebbene probabilmente consiste di diversi biotipi o specie criptiche con specificità dell'ospite variabile 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 hanno raggruppato individui Ganaspis provenienti da diverse regioni geografiche in cinque gruppi genetici (denominati G1-G5) sulla base di analisi molecolari del frammento del gene della citocromo ossidasi I mitocondriale. I gruppi G2 e G4 sono segnalati solo da alcune località tropicali dell'Asia meridionale, e il gruppo G5 è stato segnalato dall'Asia e da altre regioni (ad esempio, Argentina, Brasile, Hawaii e Messico) da ospiti sconosciuti (Buffington, osservazione personale). Collezioni sul campo di frutti selvatici infestati da D. suzukii in Corea del Sud7, Cina8 e Giappone 9,23,25 hanno trovato G1 da solo o una miscela di esemplari che rappresentano i gruppi G1 e G3. I due gruppi sembrano essere simpatrici e coesistono sulle stesse piante ospiti abitate da D. suzukii e altre mosche ospiti strettamente correlate. Tuttavia, sono state osservate alcune differenze tra i due gruppi, con G1 che sembra avere un grado più elevato di specificità dell'habitat ospite o ospite rispetto a G3, sebbene entrambi attacchino un certo numero di specie strettamente correlate nei test di quarantena21,22. Ulteriori analisi molecolari dettagliate possono aiutare a determinare lo stato delle specie, in particolare per i gruppi G1 e G3. Questo studio si riferisce a loro come G1 G. brasiliensis e G3 G. brasiliensis. Alcuni primi studi hanno anche chiamato il G1 G. brasiliensis come G. cf. brasiliensis 14,21,22. Il G1 G. brasiliensis è stato recentemente approvato per il rilascio sul campo contro D. suzukii negli Stati Uniti e in Italia (diversi altri paesi europei stanno attualmente considerando la sua introduzione), mentre il G3 G. brasiliensis potrebbe essere considerato per il rilascio sul campo nel prossimo futuro. Recenti indagini hanno anche trovato popolazioni avventive di L. japonica e G1 G. brasiliensis nella Columbia Britannica, Canada26, e nello Stato di Washington, USA (Beers et al., dati non pubblicati), e popolazioni avventive di L. japonica nella provincia di Trento, Italia27.
Dato il significativo interesse per lo sviluppo di programmi di controllo biologico per la gestione della Drosophila suzukii e il sostanziale potenziale di controllo biologico delle introduzioni avventive e deliberate di Ganaspis brasiliensis, vi è la necessità di sviluppare metodi di allevamento efficienti per questo parassitoide larvale per future ricerche a lungo termine e / o rilascio sul campo. Questo protocollo e l'articolo video associato descrivono due serie di metodi di allevamento per questo parassitoide: (1) allevamento di laboratorio su piccola scala in palloni utilizzando una miscela di frutta ospite (mirtillo) e dieta artificiale per la coltura di D. suzukii. I metodi sono stati sviluppati utilizzando materiale G3 originariamente raccolto da Kunming, Cina8. (2) Allevamento di massa per il rilascio in campo in grandi gabbie utilizzando frutta ospite (mirtillo) per la coltura di D. suzukii. Il gruppo genetico utilizzato per l'allevamento su larga scala era lo stock G1 originario di Tokyo, in Giappone 9,22. Altre scale di metodi di allevamento, come l'uso di fiale o piccoli contenitori per entrambi i gruppi, sono anche brevemente discusse.

<table><tbody><tr><td>Lievito secco attivo</td><td>Fleischmanns Yeast, Cincinnati, OH, USA</td><td>Nessuno</td><td>Utilizzato per coprire la frutta per ridurre la crescita di muffe e migliorare l'attrazione per le mosche</td></tr><tr><td>Agar batteriologico</td><td>Merk Life Science S.r.l., Milano, Italia</td><td>A1296 - 5KG</td><td>Utilizzato per preparare la soluzione standard</td></tr> di <tr><td>candeggina</td> media <td>Drosophila Clorox Company, Oakland, CA, USA</td><td>Nessuno</td><td>Utilizzato per disinfettare la polpa della frutta</td></tr><tr><td>Tappo blu</td><td>Azer Scientific, Morgantown, PA, USA</td><td>ES3837</td><td>Utilizzato per sigillare il tubo consentendo la ventilazione per gli insetti</td></tr><tr><td>Mirtilli</td><td>Grocery Store, Newark, DE, USA</td><td>Nessuno</td><td>Fornito come frutto ospite per le mosche (possono essere utilizzati anche vari altri frutti)</td></tr><tr><td>Gabbia per l'allevamento di insetti BugDorm (L24,5 x P24,5 x H63,0 cm)</td><td>Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan</td><td>4E3030</td><td>Utilizzato per l'allevamento di parassitoidi (gabbia</td></tr> per parassiti)<tr><td>Gabbia per l'allevamento di insetti BugDorm (L32,5 x P32,5 x H32,5 cm)</td><td>Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan</td><td>4E4590</td><td>Utilizzato per l'allevamento di mosche</td></tr><tr><td>Gabbia per insetti BugDorm (L32,5 x P32,5 x H32,5 cm)</td><td>Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan</td><td>4E4545</td><td>Utilizzato per l'allevamento di parassitoidi (gabbia per l'esplosione)</td></tr><tr><td>Filo di pollo (0,64 cm, 19 gauge)</td><td>Everbilt, OH, USA</td><td>308231EB</td><td>Utilizzato per sollevare il frutto per consentire la massima ovdeposizione dei parassitoidi</td></tr><tr><td>Cornmeal</td><td>Grocery Store, Trento, TN, Italy</td><td>Nessuno</td><td>Utilizzato per preparare il rotolo di cotone dentale medio standard Drosophila</td></tr><tr><td>(1 x 3,8 cm)</td><td>Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy</td><td>35000</td><td>Utilizzato per fornire acqua ai parassitoidi all'interno del contenitore di stoccaggio</td></tr><tr><td>Dieta</td> <td>DrosophilaFrontier Scientific, Newark, DE, USA</td><td>TF1003</td><td>Dieta personalizzata utilizzata per allevare mosche</td></tr><tr><td>Fiala di Drosophila stretta, Polistirene (2,5 x 9,5 cm)</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>75813-160</td><td>Utilizzato per fornire acqua ai parassitoidi all'interno della gabbia</td></tr><tr><td>Tappi per fiale di Drosophila, acetato di cellulosa (2,5 cm)</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>89168-886</td><td>Utilizzato per fornire acqua ai parassitoidi all'interno della gabbia</td></tr><tr><td>Pallone di Erlenmeyer (250 mL)</td><td>Carolina Biological, Burlington, NC, USA</td><td>731029</td><td>Utilizzato per l'allevamento di mosche e parassitoidi Provetta</td></tr> da <tr><td>centrifuga in stile Falcon (50 mL)</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>VWRI525-0611</td><td>Modificato per la spedizione di parassitoidi adulti</td></tr><tr><td>Tappo in schiuma</td><td>Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA</td><td>L800-C</td><td>Utilizzato per sigillare i palloni consentendo la ventilazione per gli insetti</td></tr><tr>Negozio di alimentari <td>per il miele</td><td>, Newark, DE, USA</td><td>Nessuno</td><td>Fornito come cibo per parassitoidi Tappo</td></tr> in <tr><td>schiuma di plastica Identi-Plug</td><td>Fisher Scientific Company, LLC, Pittsburg, PA, US</td><td>14-127-40E</td><td>Utilizzato come alimentatore per parassitoidi e per sigillare il contenitore di stoccaggio</td></tr><tr><td>Asciugamano di carta industriale</td><td>Negozio di alimentari, Newark, DE, USA</td><td>Nessuno</td><td>Fornito come substrato di pupa per pupe e umidità mitigata</td></tr><tr><td>Tessuto a rete micron (250 mL)</td><td>Rete industriale, Maple Grove, MN, USA</td><td>WN0250-72</td><td>Utilizzato per realizzare il coperchio di ventilazione per insetti</td></tr><tr><td>Lievito alimentare (fiocchi)</td><td>Negozio di alimentari, Trento, TN, Italia</td><td>Nessuno</td><td>Utilizzato per preparare il sottobicchiere di carta medio standard Drosophila</td></tr><tr><td>(10,2 cm)</td><td>Hoffmaster, WI, USA</td><td>35NG26</td><td>Utilizzato come substrato di pupa per mosche e pupe</td></tr> <tr><td>parassitateBicchiere di plastica (&Oslash; 13,3 cm, 800 mL)</td><td>Berry Superfos, Taastrup, Danimarca</td><td>Unipak 5134</td><td>Modificato per conservare i parassitoidi adulti</td></tr><tr><td>Coperchio in plastica (&Oslash; 13,3 cm)</td><td>Berry Superfos, Taastrup, Danimarca</td><td>PP 2830</td><td>Modificato per conservare i parassitoidi adulti</td></tr><tr><td>Acido propionico</td><td>Merk Life Science S.r.l., Milano, Italia</td><td>P1386 - 1L</td><td>Utilizzato per preparare lo standard Drosophila Medium</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Negozio di alimentari, Trento, TN, Italia</td><td>Nessuno</td><td>Utilizzato per preparare la tazza da zuppa media Standard Drosophila</td></tr><tr><td>con coperchio (475 mL)</td><td>StackMan, Vietnam</td><td>DC1648</td><td>Utilizzato per larve parassitate per impupare</td></tr><tr><td>Farina di soia Negozio</td><td>di alimentari, Trento, TN, Italia</td><td>Nessuno</td><td>Utilizzato per preparare la rondella in feltro bianco media standard Drosophila</td></tr> (<tr><td>0,64 cm di spessore, 5 mm ID x 20 mm OD)</td><td>Quiklok, Lincoln, NH, US</td><td>WFW/.25 x 5 x 20 mm</td><td>Utilizzato come anello di alimentazione per parassitoidi</td></tr></tbody></table>

metodi per l'allevamento del parassitoide ganaspis brasiliensis, un promettente agente di controllo biologico per la drosophila suzukii invasiva

Methods for Rearing the Parasitoid Ganaspis brasiliensis, a Promising Biological Control Agent for the Invasive Drosophila suzukii

Originaria dell'Asia orientale, la drosophila ad ala maculata, Drosophila suzukii (Matsumura) (Ditteri: Drosophilidae), si è diffusa nelle Americhe, in Europa e in alcune parti dell'Africa nell'ultimo decennio, diventando un devastante parassita di vari frutti dalla pelle morbida nelle sue regioni invase. Il controllo biologico, in particolare per mezzo di parassitoidi auto-perpetuanti e specializzati, dovrebbe essere un'opzione praticabile per una gestione sostenibile a livello di area di questo parassita altamente mobile e polifago. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) è un parassitoide larvale ampiamente distribuito in Asia orientale, ed è stato trovato per essere uno dei parassitoidi più efficaci di D. suzukii.
A seguito di rigorose valutazioni pre-introduzione della sua efficacia e dei potenziali rischi non bersaglio, uno dei gruppi genetici più specifici dell'ospite di questa specie (G1 G. brasiliensis) è stato recentemente approvato per l'introduzione e il rilascio sul campo negli Stati Uniti e in Italia. Un altro gruppo genetico (G3 G. brasiliensis), che è stato anche comunemente trovato per attaccare D. suzukii in Asia orientale, potrebbe essere considerato per l'introduzione nel prossimo futuro. Attualmente c'è un enorme interesse nell'allevamento di G. brasiliensis per la ricerca o nella produzione di massa per il rilascio sul campo contro D. suzukii. Questo protocollo e l'articolo video associato descrivono metodi di allevamento efficaci per questo parassitoide, sia su piccola scala per la ricerca che su larga scala per la produzione di massa e il rilascio sul campo. Questi metodi possono beneficiare di ulteriori ricerche a lungo termine e l'uso di questo parassitoide nativo asiatico come promettente agente di controllo biologico per questo parassita invasivo globale.

La Figura 4 mostra i risultati rappresentativi dell'allevamento in laboratorio su piccola scala di G3 Ganaspis brasiliensis utilizzando due diverse densità parassitoidi (sei o 10 coppie) e due diversi tempi di esposizione (5 o 10 giorni) presso la struttura di quarantena dell'USDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Newark, Delaware). Ci sono state 14 repliche per ogni combinazione di densità parassitoide e tempo di esposizione. In totale, i 64 palloni hanno prodotto 4.018 ves...

Ganaspis brasiliensis- un parassitoide larvale di Drosophila suzukii (un parassita invasivo globale delle colture da frutto) - è stato approvato o è considerato per l'introduzione in Europa e negli Stati Uniti per il controllo biologico di questo parassita. Questo articolo fornisce protocolli per l'allevamento su piccola scala e su larga scala di questo parassitoide.

Metodi per l'allevamento del parassitoide Ganaspis brasiliensis, un promettente agente di controllo biologico per la Drosophila suzukii invasiva

Native to East Asia, the spotted-wing drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), has established widely in the Americas, Europe, ...

La ricerca a lungo termine e l'uso di un agente di biocontrollo dipendono dalla disponibilità di tecniche di allevamento efficaci ed economiche, e questo protocollo si è dimostrato efficiente per l'allevamento di questo parassitoide. Attualmente c'è un enorme interesse nell'allevamento di questo parassitoide per la ricerca o il rilascio sul campo, e il protocollo andrà a beneficio della futura ricerca a lungo termine e dell'uso di questo promettente agente di biocontrollo. I primi utenti potrebbero aver bisogno di comprendere alcune biologie di base degli insetti coinvolti attraverso la lettura dei riferimenti pertinenti forniti nell'articolo e alcune pratiche dei metodi.Per fare la dieta ospite, in primo luogo, preparare la parte liquida della dieta come descritto nel manoscritto. Quindi, aggiungere da 25 a 30 grammi di purè di mirtilli in un pallone vuoto da 250 millilitri. Quindi, versare il liquido nel pallone con il liquido che copre solo la parte superiore del purè di mirtilli.Successivamente, per allevare l'ospite Drosophila suzuki, prima tagliare un pezzo di tovagliolo di carta assorbente e ruotarlo al centro. Quindi, posizionare la sezione centrale contorta del tovagliolo di carta nel pallone dietetico. Per trattenere l'umidità, utilizzare acqua distillata per bagnare il tovagliolo di carta e la dieta.Quindi, per trasferire mosche adulte sessualmente mature, rimuovere con cura il tappo di una fiaschetta della colonia di mosche e invertirlo nel pallone dietetico. Dopo una settimana di questa esposizione, tenere le mosche in una camera ambientale per tre settimane per l'emergenza della mosca. Per esporre la larva ospite ai parassitoidi, rimuovere prima le mosche adulte e il tovagliolo di carta dal pallone, lasciando le uova e le larve della mosca.Per fungere da substrato di pupa per le larve, piegare un nuovo tovagliolo di carta assorbente e inserirlo nel pallone. Quindi aspirare sei coppie femminili e maschili del parassitoide G3 Ganaspis brasiliensis nel pallone e strisciare un sottile strato di miele sul fondo del tappo di schiuma. Per raccogliere e conservare i parassitoidi, rimuovere gli adulti dopo cinque giorni.Quindi conservare il pallone nella camera ambientale per 35 giorni nelle condizioni menzionate in precedenza. Con l'emergere di vespe adulte, aspirarle tre volte a settimana. Per tenere le vespe, prima posizionare un tovagliolo di carta inumidito ma non saturo di acqua distillata sul fondo di una fiala di Drosophila di 2,5 per 9,5 centimetri quadrati.Quindi, trasferire circa 60 vespe alla fiala e segnare la data di emergenza. Conservare il flaconcino nella camera ambientale. Due volte a settimana, strisciare un sottile strato di miele sul fondo del tappo di schiuma delle fiale.In primo luogo, organizzare l'allevamento su larga scala di Drosophila suzuki posizionando da 1.500 a 2.000 mosche adulte sessualmente mature con un rapporto sessuale 50: 50 in una grande gabbia a maglia coperta di rete. Quindi, posizionare un piatto con cotone imbevuto d'acqua e da quattro a sei piastre di Petri con mezzo Standard Drosophila nella gabbia. Due volte alla settimana, sostituire le piastre di Petri esposte con quelle fresche.Metti ogni capsula di Petri infestata senza coperchio in un bicchiere di plastica da 800 millilitri e copri la tazza con una rete sottile. Quindi, incubare le tazze a 23 gradi Celsius e 75% di umidità relativa per 12-15 giorni. Dopo l'incubazione, trasferire Drosophila suzuki adulta appena schiusa in una gabbia di allevamento.Quindi, iniziare a preparare le larve ospiti risciacquando i mirtilli in acqua fredda per un minuto e immergere i frutti in una bacinella piena di una soluzione di candeggina, diluita al 5% per tre minuti. Quindi, riempire le piastre di Petri di nove centimetri con i mirtilli lavati. Nelle ore del tardo pomeriggio, metti le piastre di Petri nella gabbia di allevamento e lasciale durante la notte.La mattina dopo, picchietta delicatamente le piastre di Petri per rimuovere le mosche dai frutti e rimuovere i frutti dalla gabbia di allevamento. Nel frattempo, prepara una gabbia per parassitismo e una gabbia di emergenza per vespa per il parassitoide G1 Ganaspis brasiliensis. Entrambe le gabbie dovrebbero avere una corda sottile sotto il soffitto per sospendere uno o più alimentatori.In ogni gabbia, sospendere una fiala di Drosophila contenente acqua e sigillare con un tappo di acetato di cellulosa capovolto dal soffitto ogni cinque-sette giorni, a seconda dell'umidità relativa. Subito dopo aver estratto i mirtilli infestati dalla gabbia di Drosophila suzuki, mettili nella gabbia del parassitismo con 1.500-2.000 vespe Ganaspis brasiliensis per due o tre giorni. Quindi, raccogliere i frutti in un bicchiere di plastica da 800 millilitri con carta assorbente sul fondo.Incubare la tazza aperta nella gabbia di emergenza o di eclosione a 21 gradi Celsius e 65% di umidità relativa per almeno 28 giorni. Durante la seconda e la terza settimana di incubazione, controllare settimanalmente la gabbia per l'eclosione precoce dell'ospite. Per facilitare la successiva raccolta di parassitoidi, rimuovere le mosche adulte.Alla fine della quarta settimana di incubazione, fornire un alimentatore e una fonte d'acqua alla gabbia. Raccogli circa il 10-15% delle vespe adulte e trasferiscile nella gabbia del parassitismo per sostituire le vespe vecchie e improduttive. Dalle vespe rimanenti della gabbia di eclosion, conservare fino a 700 adulti con un rapporto di 50:50 tra i sessi con un bicchiere di plastica da 800 millilitri contenente un tubo da due millilitri riempito d'acqua e sigillato con un rotolo di cotone dentale sul fondo della tazza.Conservare la tazza con un marcato stato di emergenza in una camera ambientale per un massimo di un mese. Per la spedizione di parassitoidi, posizionare circa 200 adulti in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi, metti tutti i tubi in un contenitore di spedizione isolante insieme a impacchi di ghiaccio.Questo protocollo ha portato al successo dell'allevamento su piccola scala di G3 Ganaspis brasiliensis, un agente parassitoide, contro il parassita agricolo Drosophila suzuki in laboratorio. La produzione di prole non è stata influenzata dalle differenze nella densità dei parassitoidi e nel tempo di esposizione. È stato inoltre possibile ottenere la generazione su larga scala di G1 Ganaspis brasiliensis, con la produzione che inizia cinque settimane dopo l'esposizione iniziale all'ospite Drosophila suzuki.Dalla settimana 8 alla settimana 22, la produzione di parassitoidi è diventata proporzionale alla quantità di frutta esposta a loro. È di fondamentale importanza mantenere una temperatura di allevamento adeguata, controllare l'umidità e fornire sempre cibo per gli insetti adulti. I metodi potrebbero essere ulteriormente migliorati ottimizzando le densità di allevamento di ospiti e parassitoidi per massimizzare la riproduzione delle vespe ed esplorando la possibilità di allevare questo parassitoide su ospiti alternativi.

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Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Questo articolo descrive il mantenimento in laboratorio (compreso l'accoppiamento e l'alimentazione) della mosca dittera inferiore Bradysia (Sciara) coprophila.

Manutenzione in laboratorio della mosca dei ditteri inferiori Bradysia (Sciara) coprophila: un nuovo/vecchio organismo modello emergente

Presentiamo due metodi per gli agricoltori per propagare in massa nematodi entomopatogeni come bio-insetticidi. Il primo metodo utilizza gel di poliacrilammide come substrato per la coltura del nematode, mentre il secondo utilizza il filone rivestito di polimero come substrato di coltura. Entrambi i metodi si basano sulla propagazione in vivo dei nematodi all'interno di cadaveri di insetti.

Propagazione in vivo basata sul coltivatore di nematodi entomopatogeni

L'obiettivo di questo protocollo è facilitare l'analisi funzionale delle interazioni parassitoide–ospite in Asobara japonica e Drosophila melanogaster. attraverso metodi di allevamento ottimizzati, un saggio di infezione a posizione unica e un knockdown genico mediato da RNAi.

Protocolli per l'allevamento efficiente e l'analisi funzionale della vespa endoparassitoide Asobara japonica e del suo ospite Drosophila melanogaster

Questo video illustra le tecniche generali utilizzate per posteriore Anopheles gambiae in laboratorio. I metodi per la cura per le zanzare di laboratorio sono dimostrati in tutte le fasi del ciclo di vita dell'organismo da larve di pupe al sangue al seno adulti.

Protocollo per la cura dei Mosquito (A. gambiae)

Scopri i metodi per l'allevamento di Ganaspis brasiliensis, un parassitoide utile contro Drosophila suzukii. Questo protocollo efficiente supporta la ricerca e il rilascio in campo di questo promettente agente di controllo biologico.

Metodi per lallevamento del parassitoide Ganaspis brasiliensis, un promettente agente di controllo biologico per la Drosophila suzukii invasiva (Video) | JoVE Journal

Metodi per l'allevamento del parassitoide Ganaspis brasiliensis, un promettente agente di controllo biologico per la Drosophila suzukii invasiva

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