Name: Imaging 3D quantitativo di cellule infette da Trypanosoma cruzi, amastigoti dormienti e cellule T in organi chiarificati intatti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Impara l'imaging 3D quantitativo di organi chiarificati per visualizzare Trypanosoma cruzi e cellule T. Questo metodo consente di valutare l'efficacia dei trattamenti nella malattia di Chagas.

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Ringraziamo il Dr. Etsuo Susaki per il loro prezioso aiuto e le raccomandazioni riguardanti i protocolli di pulizia dei tessuti e immunocolorazione. Inoltre, siamo grati a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core per il supporto tecnico utilizzando LSFM e imaging confocale. Ringraziamo anche tutti i membri del Tarleton Research Group per gli utili suggerimenti durante questo studio.

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
<li>Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+Chagas+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic Chagas heart disease.</a> Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).</li>
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<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Martin, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-Cell+responses+to+Trypanosoma+cruzi+are+highly+focused+on+strain-variant+trans-sialidase+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes.</a> PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), 199369(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
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<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

L'assenza di un'ampia imaging dell'intero organo dei parassiti e della risposta immunitaria limita la comprensione della complessità delle interazioni ospite-parassita e impedisce la valutazione delle terapie per la malattia di Chagas. Il presente studio ha adottato la pipeline CUBIC per chiarire e colorare organi e tessuti intatti di topi infetti da T. cruzi.
In questo studio sono stati testati più protocolli di pulizia dei tessuti (PACT32, ECi 33, FLASH<sup c...

La malattia di Chagas, causata dal parassita protozoo T. cruzi, è tra le malattie tropicali più trascurate al mondo, causando circa 13.000 morti all'anno. L'infezione spesso progredisce da uno stadio acuto a uno cronico producendo patologia cardiaca nel 30% dei pazienti, tra cui aritmie, insufficienza cardiaca e morte improvvisa 1,2. Nonostante la forte risposta immunitaria dell'ospite suscitata contro il parassita durante la fase acuta, un basso numero di parassiti persiste cronicamente per tutta la vita dell'ospite in tessuti come il cuore e il muscolo scheletrico. Diversi fattori, tra cui l'insorgenza ritardata delle risposte immunitarie adattative e la presenza di forme non replicanti del parassita, possono contribuire alla capacità di T. cruzi di evitare una completa eliminazione da parte del sistema immunitario 3,4,5,6. Inoltre, le forme dormienti non replicanti del parassita mostrano una bassa suscettibilità ai farmaci tripanocidi e possono in parte essere responsabili del fallimento del trattamento osservato in molti casi 7,8.
Lo sviluppo di nuove tecniche di imaging offre l'opportunità di ottenere informazioni sulla distribuzione spaziale dei parassiti nei tessuti infetti e sulla loro relazione con le cellule immunitarie coinvolte nel loro controllo. Queste caratteristiche sono cruciali per una migliore comprensione dei processi di controllo dei parassiti da parte del sistema immunitario e per tracciare i rari parassiti dormienti presenti nei tessuti cronici.
La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) è uno dei metodi più completi e imparziali per l'imaging 3D di tessuti o organi di grandi dimensioni senza sezionamento sottile. I microscopi a foglio di luce utilizzano un sottile foglio di luce per eccitare solo i fluorofori nel piano focale, ridurre il fotosbiancamento e la fototossicità dei campioni e registrare immagini di migliaia di strati di tessuto utilizzando telecamere ultraveloci. L'elevato livello di trasparenza tissutale necessario per la corretta penetrazione della luce laser nei tessuti si ottiene omogeneizzando l'indice di rifrazione (RI) dopo la delipidazione e la decolorazione dei tessuti, che riduce la dispersione della luce e rende immagini di alta qualità 9,10,11.
Sono stati sviluppati approcci di pulizia dei tessuti per l'imaging di topi interi 12,13,14, organoidi 15,16,17, organi che esprimono marcatori fluorescenti reporter 18,19,20,21,22,23 e recentemente un numero limitato di tessuti umani 24 . Gli attuali metodi per la pulizia dei tessuti sono classificati in tre famiglie: (1) metodi a base di solventi organici come i protocolli DISCO 25,26, (2) metodi a base di idrogel, come CLARITY27, e metodi acquosi, come CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . I protocolli CUBIC mantengono la forma degli organi e l'integrità dei tessuti, preservando la fluorescenza delle proteine reporter espresse endogenamente. L'aggiornamento più recente di questa tecnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), consente anche la rilevazione di epitopi utilizzando anticorpi marcati con fluorescenza e marcatura del DNA28.
Nel presente protocollo, è stata utilizzata la pipeline CUBIC per rilevare T. cruzi che esprimono proteine fluorescenti in tessuti murini chiariti intatti. I tessuti otticamente trasparenti sono stati ripresi con LSFM, ricostruiti in 3D e il numero totale preciso di cellule infette da T. cruzi , amastigoti dormienti e cellule T per organo è stato quantificato automaticamente. Inoltre, questo protocollo è stato adottato con successo per ottenere un'etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. Questi approcci sono essenziali per comprendere l'espansione e il controllo di T. cruzi negli ospiti infetti e sono utili per valutare pienamente la chemioterapia e l'immunoterapia per la malattia di Chagas.

<table><tbody><tr><td>1-metilimidazolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolone (Antipirina</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>6 pozzetti piastre per colture cellulari</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-topo Frammento Fab</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-coniglio Frammento favoloso</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>nanocorpo anti-GFP Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>anti-&alpha;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J topo</td><td>Il ceppo Jackson</td><td>Laboratory #007914</td><td>Nome comune: Ai14 , Ai14D o Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J topo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Nome comune: Ai14 , Ai14D o Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1 Ioduro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J topo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #032080</td><td>Comune Nome: Cd8a-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Salviette per la pulizia Kimwipes</td><td>&nbsp; Microscopio</td> a scansione laser confocale Kimberly-Clark <td>T8788</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 kit di immunocolorazione 3D</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 kit di colorazione nucleare 3D</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>Supercolla gel a base di cianoacrilato</td><td>Scotch</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7); 1,1'-diottadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina ioduro) Azienda: Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Provette da centrifuga 15 mL</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Falcon Provette da centrifuga 50&nbsp; mL</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920. BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>#H3884 o #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris File Converter x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>ImSpector software</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>Ago per iniezione endovenosa 23-G</td><td>Sartori, Minisart Filtro per siringa</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>salviette prive di lanugine Microscopio</td>fluorescente <td></td><td></td></tr><tr>a<td>foglio luminoso</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II sistema</td><td></td>di imaging</tr><tr><td>Metanolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per micropipette, 10 &; L, 200 & micro; L e 1.000 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y e T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatore motorizzato</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di montaggio</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-butildietanolammina</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-metilnicotinamide</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Sacrifice Perfusion System</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche</td><td>Costar Sterile</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore con agitazione</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio (NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G Macchia di acido nucleico verde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging 3d quantitativo di cellule infette da trypanosoma cruzi, amastigoti dormienti e cellule t in organi chiarificati intatti

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

La malattia di Chagas è una patologia trascurata che colpisce milioni di persone in tutto il mondo, principalmente in America Latina. L'agente della malattia di Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), è un parassita intracellulare obbligato con una biologia diversificata che infetta diverse specie di mammiferi, compresi gli esseri umani, causando patologie cardiache e digestive. Il rilevamento affidabile delle infezioni in vivo da T. cruzi è stato a lungo necessario per comprendere la complessa biologia della malattia di Chagas e valutare accuratamente l'esito dei regimi di trattamento. L'attuale protocollo dimostra una pipeline integrata per la quantificazione automatizzata delle cellule infette da T. cruzi in organi ricostruiti in 3D e cancellati. La microscopia fluorescente a foglio luminoso consente di visualizzare e quantificare con precisione i parassiti T. cruzi attivamente proliferanti e dormienti e le cellule effettrici immunitarie in interi organi o tessuti. Inoltre, è stata adottata con successo la pipeline CUBIC-HistoVision per ottenere un'etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. La pulizia dei tessuti accoppiata con l'immunocolorazione 3D fornisce un approccio imparziale per valutare in modo completo i protocolli di trattamento farmacologico, migliorare la comprensione dell'organizzazione cellulare dei tessuti infetti da T. cruzi e si prevede che farà avanzare le scoperte relative alle risposte immunitarie anti-T. cruzi, al danno tissutale e alla riparazione nella malattia di Chagas.

I tessuti fissi CUBIC sono stati lavati con PBS per rimuovere i fissativi e quindi incubati con cocktail CUBIC-L, una soluzione tamponata di base di amminoalcoli che estraggono pigmenti e lipidi dal tessuto con conseguente decolorazione del tessuto mantenendo l'architettura tissutale. Le linee della griglia nella carta possono essere viste attraverso i tessuti che indicano un'appropriata pulizia degli organi (Figura 2A). Dopo la delipidazione, i tessuti sono stati lavati e i...

Il presente protocollo descrive la microscopia fluorescente a foglio luminoso e metodi automatizzati assistiti da software per visualizzare e quantificare con precisione i parassiti proliferanti e dormienti del Trypanosoma cruzi e le cellule T in organi e tessuti intatti e cancellati. Queste tecniche forniscono un modo affidabile per valutare i risultati del trattamento e offrono nuove informazioni sulle interazioni parassita-ospite.

Imaging 3D quantitativo di cellule infette da Trypanosoma cruzi, amastigoti dormienti e cellule T in organi chiarificati intatti

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Questa tecnica ha fornito un'immagine più completa e 3D di interi organi trasparenti ed è stata utile per la quantificazione, non solo delle cellule replicanti, ma anche di parassiti dormienti e dei fattori immunitari. Questa tecnica ci consente di determinare l'associazione speciale di parassiti, cellule immunitarie e danni tissutali derivanti dall'infezione. Anche l'immunocolorazione degli epitopi e l'etichettatura del DNA erano paragonabili a questa tecnica.Questo protocollo è stato efficacemente utilizzato per valutare i risultati del trattamento in modelli murini della malattia di Chagas. Un trattamento di dosi individuali più elevate, somministrato meno frequentemente per un periodo di trattamento prolungato, elimina sia i parassiti replicanti che quelli dormienti. A dimostrare la procedura sarà Caleb Hawkins, un tecnico di ricerca del laboratorio di Rick Tarleton.Dopo l'eutanasia, la dissezione e la fissazione degli organi di un topo infetto come descritto nel manoscritto, immergere i singoli organi in 10 millilitri di CUBIC-L diluito al 50% in acqua, con un leggero scuotimento a temperatura ambiente in tubi conici da 50 millilitri durante la notte protetti dalla luce. Il giorno successivo, sostituire 50% CUBIC-L con 10 millilitri di 100% CUBIC-L e incubare per sei giorni a 37 gradi Celsius, mantenendo il tubo piatto sull'incubatore dello shaker. Alla fine di questo periodo di incubazione, i tessuti dovrebbero essere quasi completamente trasparenti.Lavare gli organi trasparenti due volte con PBS per due ore a 37 gradi Celsius, con un leggero scuotimento. Ad ogni lavaggio, trasferire i tessuti in un nuovo tubo conico da 50 millilitri per rimuovere Triton X-100. Per la colorazione del DNA, diluire il colorante di acido nucleico disponibile in commercio in cinque millilitri di tampone colorante a 1:2, 500.Quindi, immergere il tessuto in un tubo conico da 15 millilitri contenente una soluzione di colorante nucleare e incubare a 37 gradi Celsius, con una leggera rotazione per cinque giorni in posizione eretta. Lavare il tessuto tre volte con 15 millilitri di tampone di lavaggio 3D per due ore a temperatura ambiente, con un leggero scuotimento. Calcolare la quantità richiesta di anticorpi primari e secondari.Mescolare anticorpi primari e secondari in un tubo ambrato da due millilitri e incubare a 37 gradi Celsius per 1,5 ore. Per lo scambio di tampone, mescolare 7,5 millilitri di 2x tampone immunocolorante HV1 3D con 7,5 millilitri di acqua bidistillata. Immergere il campione di tessuto nel tampone e incubare per 1,5 ore a 32 gradi Celsius, agitando delicatamente in un tubo conico da 15 millilitri in posizione orizzontale.Raccogliere il campione di tessuto dal mezzo di scambio tampone e immergerlo nella soluzione di colorazione anticorpale. Incubare i tessuti individualmente per una settimana a 32 gradi Celsius, scuotendo delicatamente i tubi in posizione eretta lontano dalla luce. Spostare i campioni di tessuto a quattro gradi Celsius e incubare in posizione eretta.Dopo aver raffreddato il tampone immunocolorante HV1 3D a quattro gradi Celsius, lavare il campione con 15 millilitri di tampone due volte a quattro gradi Celsius per 30 minuti, ciascuno con un leggero agitazione in posizione orizzontale. Diluire la formalina all'1% in tampone di lavaggio immunocolorante HV1 3D e immergere il campione in otto millilitri della soluzione per 24 ore a quattro gradi Celsius, con un leggero scuotimento. Ora, incubare il campione in soluzione fresca di formalina all'1% per un'ora a 37 gradi Celsius e lavare in 15 millilitri di PBS per due ore a 25 gradi Celsius.Immergere organi trasparenti in un tubo conico da 50 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione CUBIC-R+ diluita al 50% di acqua a temperatura ambiente, agitando delicatamente. Sostituirlo con cinque millilitri 100% CUBIC-R + e incubare con agitazione delicata per due giorni. Asciugare i tessuti usando Kimwipes, quindi trasferirli in cinque millilitri di soluzione di montaggio in una piastra di coltura a sei pozzetti e incubarli a temperatura ambiente.Far aderire i tessuti al supporto del campione del microscopio usando la super colla in gel. Immergere i campioni nella cuvetta di quarzo del microscopio riempita con 120 millilitri di soluzione di montaggio. Immaginateli trasversalmente al loro asse longitudinale e fate aderire il cuore, con l'apice e l'aorta allineati orizzontalmente.Il cuore infetto da Trypanosoma cruzi ricostruito in 3D ha mostrato una percentuale maggiore di cellule infette nell'atrio, rispetto ai ventricoli. I parassiti dormienti possono essere identificati nel cuore, come raffigurato nei riquadri ingranditi in 3D. Le cellule T che esprimono ZsGreen1, così come le cellule infette da Trypanosoma cruzi, sono state visualizzate nel muscolo scheletrico da un topo reporter CD8 infetto da Trypanosoma cruzi.Gli zoom 3D dell'immagine ricostruita in 3D hanno identificato le cellule T nella regione di una cellula infetta. L'interfaccia delle cellule T nelle cellule infettate dall'ospite è stata visualizzata mediante microscopia confocale. Nel cuore di un topo immunodeficiente, sono state rilevate cellule ospiti infettate da due diversi ceppi di Trypanosoma cruzi e il taglio attraverso i tessuti ha mostrato abbondanti cellule infette da parassiti negli atri cardiaci a varie profondità tissutali.L'immunorilevazione della vascolarizzazione nel cuore infetto e cancellato da Trypanosoma cruzi rivela l'intricata vascolarizzazione del cuore. Le cellule infettate da parassiti potrebbero essere osservate negli atri cardiaci. La colorazione nucleare del muscolo scheletrico ha mostrato un accumulo di nuclei in aree con pochi o non rilevabili parassiti tdTomato.L'aumento dei marcatori reporter parassiti tdTomato e GFP con anticorpi contro RFP e GFP e l'intero muscolo scheletrico eliminato ha provocato una forte fluorescenza. Quindi i punti critici sono il tempo di incubazione nel tampone CUBICO, il tempo di diluizione e incubazione nel colorante del DNA, il tempo di incubazione negli anticorpi e il tempo di incubazione nella soluzione di corrispondenza dell'indice rifratto. L'uso di colorazione aggiuntiva, con coloranti anticorpali specifici e reazione rapida, potrebbe aumentare significativamente il potenziale di questa tecnica, consentendo la rilevazione di più cellule, processi e strutture in organi intatti.Ora abbiamo un modo migliore e più completo per esplorare le cellule immunitarie responsabili dell'uccisione dei parassiti, i tessuti in cui i parassiti persistono cronicamente e la distribuzione dei farmaci specifici nei tessuti.

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