Name: Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri la fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati con stampa 3D per l'ingegneria tissutale. Questo metodo combina tecnologie di micro e mesostampa per creare reti vascolari gerarchiche anastomizzabili direttamente all'arteria femorale del ratto.

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Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (convenzione di sovvenzione n. 818808). rhCollMA è stato generosamente fornito da CollPlant (Rehovot, Israele). Gli autori ringraziano l'Autorità di ricerca pre-clinica del Technion per l'assistenza con la cura degli animali, così come Janette Zavin, Galia Ben David e Idan Redenski.

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<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scaffold+system+for+studying+the+effect+of+local+geometry+and+topology+on+the+development+and+orientation+of+sprouting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels.</a> Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

L'ingegneria dei tessuti vascolarizzati è una delle principali sfide dell'ingegneria tissutale20. I metodi attuali per la creazione di tessuto vascolare ingegnerizzato si concentrano sulla creazione di microvascolarizzazione autoassemblata 21,22,23 o sulla fabbricazione di scaffold vascolari a mesoscala 24,25 e non sulla ricreazione di un sistema di vascolarizzazione gerarchica, che può essere perfuso immediatamente e direttamente dopo l'impianto26 . In questo lavoro, descriviamo un protocollo che utilizza due modalità di stampa 3D per fabbricare una rete navale gerarchica composta da vascolari su microscala e mesoscala. Il protocollo combina una rete microvascolare auto-assemblata biostampata in 3D con un'impalcatura vascolare a mesoscala, ottenendo un lembo impiantabile e vascolarizzato. Inoltre, questo documento presenta un protocollo per anastomosizzare direttamente questo lembo all'arteria femorale di un ratto.
Il bioprinting 3D ha guadagnato interesse negli ultimi anni grazie alla sua versatilità rispetto alle tradizionali tecniche di ingegneria tissutale. Mentre questo protocollo descrive la generazione di una rete microvascolare in rhCollMA bioink, i metodi utilizzati possono essere applicati con poche modifiche a molti altri bioink dalla pletora di bioink studiati e nuovi e bagni di supporto27,28. Abbiamo scelto di utilizzare rhCollMA come bioink a causa dell'abbondanza di collagene di tipo I nell'ECM umano, fornendo un ambiente adatto per l'attaccamento cellulare. Inoltre, viene prodotto in modo ricombinante nelle piante e ulteriormente modificato con gruppi metacrilati, che consente la fotopolimerizzazione e la formazione di idrogel 3D stabili29,30. Il fotocrosslinking è stato ottenuto con l'aggiunta del fotoiniziatore LAP, che ha dimostrato di essere atossico e viene attivato dall'esposizione alla luce blu a 405 nm, riducendo la possibile fototossicità della luce UV. Tuttavia, l'uso di bioink fotosensibili richiede l'uso di un terreno di coltura privo di fenolo rosso per la preparazione del bioink e del materiale di supporto. Inoltre, il protocollo descrive l'uso di materiale di supporto alla gelatina, che consente l'estrusione ad alta fedeltà di bioink come rhCollMA. Pertanto, è fondamentale garantire l'uso di un mezzo freddo durante la sua preparazione e il raffreddamento del letto della stampante. Un riscaldamento eccessivo potrebbe verificarsi a causa della sorgente luminosa utilizzata per la reticolazione o da temperature ambiente elevate.
Una bioprinter basata sull'estrusione è stata utilizzata qui per creare la rete microvascolare bioprinted, e attualmente ci sono molte bioprinter disponibili in commercio che possono generare costrutti simili. Inoltre, i metodi proposti possono essere facilmente modificati e applicati per studiare diverse geometrie, dimensioni e modelli di riempimento. In questo lavoro, è stato scelto un modello di riempimento rettilineo per creare pori interconnessi, e questo può essere stampato relativamente rapidamente con alta fedeltà.
Le bolle d'aria introducono una sfida significativa nella bioprinting dell'estrusione, in particolare all'interno dei materiali di supporto. Pertanto, è fondamentale ridurre al minimo la presenza e la formazione di queste bolle utilizzando pipette a spostamento positivo per il trasferimento del materiale di supporto, la preparazione della sospensione bioink-cell e il loro trasferimento alle cartucce di stampa.
In questo lavoro, le cellule endoteliali di derivazione adiposa umana e le cellule staminali della polpa dentale sono state utilizzate come cellule di supporto a causa del loro isolamento relativamente facile dai pazienti. Inoltre, è stata scelta una concentrazione cellulare totale di 8 x 106 cellule/mL poiché questa concentrazione ha dimostrato di stabilire le reti vascolari più sviluppate16. Mentre questo protocollo può essere impiegato per generare microvascolarizzazione utilizzando diversi tipi di cellule e fonti, nonché diversi bioink, è necessario eseguire una calibrazione della concentrazione cellulare per stabilire le migliori condizioni per lo sviluppo della rete microvascolare. Inoltre, le cellule tessuto-specifiche (cioè mioblasti o osteoblasti) possono essere incorporate all'interno del bioink per ottenere lembi vascolarizzati specifici del tessuto.
Lo stampo per l'impalcatura vascolare porosa è stato fabbricato utilizzando materiale idrosolubile stampato in 3D su una stampante 3D per estrusione disponibile in commercio. Ciò si traduce in una tecnica economica basata su piattaforme di prototipazione rapida, in modo tale che molte geometrie e dimensioni diverse di scaffold vascolari possano essere studiate e vagliate rapidamente31. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è il limite di risoluzione della maggior parte delle stampanti 3D32. Tuttavia, con il settore in rapida evoluzione che circonda la produzione additiva, questi limiti dovrebbero migliorare nel tempo. L'uso di solventi organici per il processo di fabbricazione è un'altra limitazione del protocollo, poiché la maggior parte dei solventi organici sono tossici per le cellule, impedendo la possibilità di combinare la procedura di bioprinting con il processo di fabbricazione dell'impalcatura vascolare.
Il metodo descritto di seminare il lume dell'impalcatura usando l'aspirazione invece di spingere la sospensione cellulare ha effetti importanti sulla localizzazione delle cellule seminate. L'uso della pressione negativa consente l'endotelizzazione del lume interno dell'impalcatura riducendo al minimo qualsiasi fuoriuscita della sospensione cellulare attraverso le perforazioni sulla parete dell'impalcatura16.
Il metodo "cuff" descritto per le anastomosi microchirurgiche può essere facilmente modificato e adattato a diversi materiali o dimensioni di scaffold vascolare, nonché a diverse arterie e vene in un'ampia scala di modelli animali. Gli adattamenti al protocollo includerebbero diverse dimensioni del tubo di poliimmide e dimensioni di sutura. Questo metodo non richiede la perforazione della parete dell'impalcatura, che potrebbe portare allo sviluppo di difetti. Questo lavoro presenta un protocollo che può essere esteso a molte applicazioni. Gli aspetti critici di questo protocollo, che includono la fabbricazione di vascolarizzazione meso- e microscala e il loro assemblaggio e impianto, rappresentano aspetti critici dei lembi ingegnerizzati sia per applicazioni ricostruttive, sia per studi vascolari e altri studi di ingegneria tissutale.

Gravi difetti tissutali sono causati da lesioni traumatiche, difetti congeniti o malattie, e l'attuale gold standard per il trattamento di questi difetti è l'uso di innesti autologhi, lembi di tessuto vascolarizzato e lembi liberi microvascolari come sostituti tissutali. Tuttavia, queste opzioni presentano gli svantaggi del tessuto del sito donatore limitato e della morbilità del sito donatore1. Pertanto, vi è una crescente domanda di sostituti tissutali alternativi che possono essere utilizzati per correggere questi difetti2. Lo spessore dei costrutti tissutali ingegnerizzati è limitato dalla diffusione di nutrienti e gas verso le cellule e, quindi, una corretta rete vascolare è essenziale per generare impalcature grandi, spesse e adeguatamente nutrite.
Sono stati applicati diversi approcci per promuovere la vascolarizzazione di impianti ingegnerizzati3, tra cui il reclutamento in vivo del supporto vascolare dall'ospite, la consegna di fattori di crescita e citochine all'interno degli scaffold, la prevascolarizzazione degli impianti, la generazione di un letto di microvaso ramificato perfusibile utilizzando tecniche di micropatterning4, l'uso di materiali sacrificali per la formazione di canali/ reti vascolari5 , così come la creazione di canali all'interno di costrutti bioprinted 3D 5,6. La vascolarizzazione dei tessuti spessi richiede l'incorporazione di una rete vascolare gerarchica costituita da vasi su macro-scala e microcapillari. I vasi su macroscala distribuiscono il sangue in modo efficace in tutto il costrutto e consentono anastomosi microchirurgiche con i vasi sanguigni ospiti, mentre i vasi a scala microcapillare consentono la diffusione dei nutrienti.
Il bioprinting ha guadagnato una forte attenzione negli ultimi anni grazie ai vantaggi che offre rispetto ai metodi convenzionali di ingegneria tissutale. Tessuti e organi sono oggetti 3D complessi e intricati con un'architettura specifica. Il bioprinting 3D, con la sua capacità di depositare strati di biomateriali in alta risoluzione, consente la capacità di creare complessi sostituti di tessuti e organi (ad esempio, reni, polmoni, fegato)7. Diverse tecnologie di stampa sono state adattate per la bioprinting, tra cui l'estrusione, il getto d'inchiostro8, la deposizione assistita da laser 9,10 e la bioprinting11,12 basata su stereolitografia. Le tecnologie basate sull'estrusione si basano sull'estrusione del materiale attraverso un ugello applicando una pressione sulla superficie sfusa del materiale opposta all'ugello.
L'incorporamento reversibile a forma libera di idrogel sospesi (FRESH) è una tecnica di bioprinting13,14 che utilizza un materiale di supporto granulare in cui il materiale estruso viene depositato e fissato in posizione dal bagno di supporto. Il bagno di supporto fornisce supporto meccanico per il bioink estruso e pre-reticolato fino alla sua reticolazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il bagno di supporto consente di estrudere materiali a bassa viscosità che non possono mantenere la loro forma dopo l'estrusione e prima della reticolazione15. Ciò espande il pool di materiali disponibili che possono essere utilizzati come bioink.
Questo documento presenta un protocollo per la generazione di un lembo vascolarizzato che combina vascolarizzazioni su microscala e mesoscala. Per raggiungere questo obiettivo, vengono generate reti microvascolari biostampate, autoassemblanti e in idrogel di collagene metacrilato umano ricombinante (rhCollMA), che si collega quindi all'interno di un'impalcatura vascolare più grande, impiantabile, risultando in un lembo di tessuto completamente ingegnerizzato16. Per stabilire una perfusione rapida e diretta di tessuti ingegnerizzati, è necessaria un'anastomosi microchirurgica diretta ai vasi ospiti. L'impalcatura vascolare non ha una forza di ritenzione della sutura sufficiente per essere anastomosizzata utilizzando la tradizionale sutura microchirurgica della parete del vaso. Pertanto, descriviamo un metodo "cuff"17,18,19 per ottenere un'anastomosi con l'arteria femorale comune di un ratto. In questo metodo, le estremità della nave sono fissate con suture circonferenziali, senza la necessità di perforare la parete della nave.
Sebbene il protocollo proposto sia stato preparato per studiare la vascolarizzazione gerarchica nell'ambiente rhCollMA, questo approccio può essere ampliato e applicato a una varietà di nuove applicazioni. Il protocollo può essere applicato alla biostampa di varie cellule tessuto-specifiche in diversi bioink. Inoltre, la geometria e le dimensioni dei costrutti possono essere facilmente modificate per soddisfare requisiti specifici, come la ricostruzione di tessuti di grandi dimensioni o studi biologici.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxano</td><td>Biosolve Chemical</td><td>42405</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0,5" aghi per l'erogazione della punta smussata Fornitura</td><td>CML</td><td>901-27-050</td><td></td></tr><tr><td>Set di serbatoi e pistoni per siringhe ambrate da 3 cc</td><td>Nordson EFD</td><td>7012085</td><td>Siringhe ambrate utilizzate per bloccare la luce e prevenire la reticolazione prematura</td></tr><tr><td>Suture Assut 5-0 AssuCryl PGA absorbale</td><td>Suture</td><td></td><td>Suture riassorbibili utilizzate per la chiusura di ferite cutanee</td></tr><tr><td>6-0 suture in polipropilene</td><td>Suture Assut Sutures</td><td>9351</td><td></td></tr><tr><td>Acland clamps</td><td>S& T</td><td>B-1V</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Avventitia</td><td>S& T</td><td>SAS-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da gioielliere angolate n. 3</td><td>S & T</td><td>JFAL-3-18</td><td></td></tr><tr><td>BioAssemblyBot 400 Bioprinter 3D</td><td>Soluzioni avanzate</td><td></td><td>un bioprinter 3D a 6 assi</td></tr><tr><td>Siero di albumina bovina Probumin</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; 82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>Filamento BVOH</td><td>Verbatim</td><td>55903</td><td>un filamento solubile in acqua di 1,75 mm</td></tr><tr><td>di diametro Pinza per l'applicazione di pinze</td><td>S & T</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>Cellule staminali della polpa dentale</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Morsetti per bulldog Dietrich</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodio idrogeno fosfato (Na2HPO4)</td><td>Carlo Erba Reagenti</td><td>480141</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>S& T</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio, senza fenolo rosso</td><td>Sartorius</td><td>01-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>ECM media + kit proiettili</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>Gadot-Group</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>sostituto della glutammina</td></tr><tr><td>Capra anti-topo Anticorpo Cy3</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>Eparina Sodio&nbsp; 5.000 U.I./mL</td> Cellule microvascolari adipose <td>panpharma-umane</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina umana</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>Una concentrazione stock di 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Isoflurano, USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-011-25</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244</td><td>un impasto di supporto in gelatina per il bioprinting 3D FRESH</td></tr><tr><td>Litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td></td></tr><tr><td>DMEM a basso contenuto di glucosio Biological</td><td>Industries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E M1000E, 100-1.000 &; L</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SMA di topo</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>Porta ago</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS</td><td>ChemCruz</td><td>&nbsp; SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina-nistatina</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ossido di etilene), M.W. 250.000 - 400.000</td><td>Acros Organics</td><td>178602500</td><td></td></tr><tr><td>Acido poli(L-lattico), IV 5,0 dl/g (PLLA)</td><td>Polysciencse, Inc.</td><td>18582-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in poliimmide, ID: 0.0249", OD: 0.0273"</td><td>Cole-Parmer</td><td>95820-05</td><td>Un tubo a parete sottile utilizzato per fabbricare polsini per anastomosi microchirurgiche</td></tr><tr><td>Prusa I3 MK2.5 Stampante 3D</td><td>Prusa Research</td><td>http://www.prusa3d.com/</td> <td>una popolare stampante 3D commerciale</td></tr><tr><td>Resomer&nbsp; RG 503 H, Poli(D,L-lattide-co-glicolide) (PLGA)</td><td>Evonik Industries</td><td>719870</td><td></td></tr><tr><td>rhCollMA</td><td>CollPlant</td><td>https://collplant.com/</td> <td>generosamente fornito da CollPlant (Rehovot, Israele)</td></tr><tr><td>portaaghi a manico rotondo</td><td>S& T</td><td>B-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi - #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>piccole forbici dritte fini</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Biosolve Chemical</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico (NaH2PO4)</td><td>Riedel-de Haen</td><td>4276</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Dassault Systems</td><td></td><td>Software CAD</td></tr><tr><td>Dritto n.3 pinza da gioielliere</td><td>S& T</td><td>JF-3-18</td><td></td></tr><tr><td>Pinze seghettate diritte</td><td>Strumenti per la scienza fine (FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi chirurgico n. 15</td><td>Swann-Morton Limited</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>57836</td><td></td></tr><tr><td>TSIM</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>Software di affettatura e progettazione 3D per il</td></tr><tr><td>dilatatore di vasi</td> BioAssembly <td>Bot S & T</td><td>D-5a.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Tivato 700 microscopio operatorio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3d

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

L'ingegnerizzazione di tessuti impiantabili, funzionali e spessi richiede la progettazione di una rete vascolare gerarchica. Il bioprinting 3D è una tecnologia utilizzata per creare tessuti aggiungendo strato su strato di biomateriali stampabili, denominati bioink e cellule in modo ordinato e automatico, che consente di creare strutture altamente intricate che le tecniche tradizionali di ingegneria tissutale non possono raggiungere. Pertanto, il bioprinting 3D è un approccio in vitro accattivante per imitare la struttura complessa vascolare nativa, che va dai vasi millimetrici alle reti microvascolari. 
I progressi nel bioprinting 3D in idrogel granulari hanno permesso l'estrusione ad alta risoluzione di bioink a matrice extracellulare a bassa viscosità. Questo lavoro presenta un approccio combinato di bioprinting 3D e stampa 3D basato su stampi sacrificali per la fabbricazione di lembi di tessuto vascolarizzato ingegnerizzati. La bioprinting 3D di cellule endoteliali e di supporto utilizzando bioink collagene-metacrilato ricombinante all'interno di un bagno di supporto alla gelatina viene utilizzata per la fabbricazione di una rete capillare autoassemblata. Questa microvascolarizzazione stampata è assemblata attorno a un'impalcatura porosa simile a un vaso a mesoscala, fabbricata utilizzando uno stampo stampato in 3D sacrificale ed è seminata con cellule endoteliali. 
Questo assemblaggio induce l'endotelio del vaso a mesoscala ad anastomosi con la rete capillare circostante, stabilendo una rete vascolare gerarchica all'interno di un lembo tissutale ingegnerizzato. Il lembo ingegnerizzato viene quindi impiantato direttamente dall'anastomosi chirurgica a un'arteria femorale di ratto utilizzando una tecnica di bracciale. I metodi descritti possono essere ampliati per la fabbricazione di vari lembi di tessuto vascolarizzato per l'uso in chirurgia di ricostruzione e studi di vascolarizzazione.

Questo protocollo descrive la fabbricazione di un lembo ingegnerizzato composto da un'impalcatura vascolare (Figura 1Ai) e una microvascolarizzazione biostampata (Figura 1Aii), che sono stati assemblati per ottenere vascolarizzazioni a mesoscala e microscala (Figura 1Aiii). Seguendo il protocollo, sono stati progettati stampi BVOH dell'impalcatura vascolare e stampati in 3D (Figura 1B, C). Le strutture stampate ottenute sono state ispezionate visivamente per piccoli fili di BVOH, che potrebbero essere trovati negli spazi vuoti degli stampi (Figura 1D). Questi fili di solito indicano impostazioni errate del materiale o che il BVOH ha assorbito umidità. Questi fili devono essere rimossi in quanto potrebbero portare a un riempimento incompleto dello stampo e a difetti strutturali nell'impalcatura vascolare risultante. Successivamente, gli stampi sono stati riempiti con la soluzione PLLA:PLGA, seguita dal processo di liofilizzazione e dalle fasi di lavaggio, come descritto nel protocollo. L'impalcatura vascolare PLLA:PLGA ottenuta è stata ispezionata visivamente per verificare l'integrità della parete del vaso e la pervietà del lume (Figura 1E).
Un bioink rhCollMA neutralizzato ad una concentrazione di 10 mg/mL è stato preparato e combinato in un rapporto 1:1 con la soluzione PEO:LAP. Le cellule endoteliali microvascolari adipose umane etichettate con Zs-Green1 e le cellule staminali della polpa dentale sono state risospese con il bioink rhCollMA e la soluzione è stata caricata in una cartuccia di stampa e sulla stampante. Le forme di scatola con un canale centrale con un motivo rettilineo (Figura 1D) sono state biostampate all'interno del bagno di supporto alla gelatina. Dopo la stampa, i costrutti sono stati reticolati e il bagno di supporto è stato sciolto e lavato. Dopo 4 giorni di cultura, i costrutti sono stati ripresi dal vivo per verificare l'autoassemblaggio della rete microvascolare. La Figura 1D mostra un esempio di rete microvascolare HAMEC-ZsGreen1 altamente sviluppata nel costrutto bioprinted.
Successivamente, un'impalcatura vascolare rivestita di fibronectina è stata inserita nel canale centrale del costrutto stampato (Figura 2A). I costrutti assemblati sono stati coltivati per 2 giorni, durante i quali le cellule contraggono il gel, attaccandolo saldamente all'impalcatura vascolare. Quindi, l'impalcatura vascolare è stata rivestita con HAMEC che esprimono tdTomato, secondo il protocollo. Dopo 7 giorni di cultura, i costrutti sono stati fissati e ripresi. La Figura 2B mostra una vista laterale dei costrutti assemblati in cui le cellule endoteliali nella microvascolarizzazione biostampata sono raffigurate in verde, mentre il rivestimento endoteliale dell'impalcatura vascolare è raffigurato in rosso. L'immagine mostra un autoassemblaggio microvascolare verde nel gel biostampato, mentre l'impalcatura vascolare è rivestita con cellule endoteliali rosse. Con un ingrandimento più elevato, i germogli provenienti dal rivestimento endoteliale rosso sono visti germogliare e anastomosi con la rete microvascolare biostampata (Figura 2C). Successivamente, i costrutti sono stati colorati per α-liscia actina muscolare (SMA) come marcatore per le cellule staminali della polpa dentale. Dopo l'immunocolorazione, i costrutti sono stati ripresi utilizzando un microscopio confocale a scansione laser (Figura 2D).
Infine, dopo 7 giorni di coltura, i lembi ingegnerizzati sono stati microchirurgicamente anastomosi all'arteria femorale di un ratto, come descritto nel protocollo. Un video di una procedura rappresentativa può essere visto nel video supplementare S1. La Figura 2E mostra un'immagine rappresentativa di un'anastomosi completata prima della rimozione del morsetto e la Figura 2F mostra un'immagine rappresentativa del sito delle anastomosi dopo la rimozione del morsetto e l'emostasi. Non ci dovrebbe essere sanguinamento visibile prima della chiusura della ferita.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig01.jpg"> Figura 1: Immagini rappresentative dei vasi in meso e microscala fabbricati. (A) Panoramica schematica dei passaggi del protocollo. Riprodotto con il permesso16. (B) Progettazione CAD per lo stampo sacrificale dell'impalcatura vascolare. (C) Vista laterale di uno stampo sacrificale stampato in 3D rappresentativo (barra della scala = 0,5 mm). (D) Vista dall'alto dello stampo sacrificale (barra della scala = 0,5 mm) (E) Impalcatura vascolare rappresentativa fabbricata utilizzando il protocollo descritto (barra della scala = 5 mm). (F) Progettazione CAD per la rete microvascolare rhCollMA biostampata in 3D. Linee della griglia = 1 mm. (G) Immagine rappresentativa di una rete vascolare biostampata altamente sviluppata che mostra HAMEC-ZsGreen1 in verde. Barra della scala = 200 μm. Abbreviazioni: CAD = computer-aided design; rhCollMA = collagene umano metanrilato ricombinante; HAMEC = cellule endoteliali microvascolari adipose umane; PLLA = acido poli-L-lattico; PLGA = acido polilattico-co-glicolico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig02v2.jpg"> Figura 2: Immagini rappresentative del lembo vascolarizzato assemblato. (A) Fotografia di un insieme rappresentativo di microvascolarizzazione biostampata e dell'impalcatura vascolare. Barra della scala = 1 mm. (B) Vista laterale di un lembo ingegnerizzato rappresentativo ripreso 4 giorni dopo il rivestimento endoteliale dell'impalcatura vascolare. La microvascolarizzazione biostampata è mostrata in verde (HAMEC-ZsGreen1), mentre il rivestimento endoteliale è mostrato in rosso (HAMEC-tdTomato). Barra della scala = 1 mm. (C) Immagine rappresentativa delle anastomosi tra la vascolarizzazione biostampata in verde e il rivestimento endoteliale in rosso. Barra della scala = 200 μm. (D) Immagine rappresentativa dell'immunocolorazione per actina muscolare liscia (rossa), nuclei (blu) e cellule endoteliali (verde) dopo 7 giorni di incubazione. Barra della scala = 0,1 mm. (E) Immagine rappresentativa di un'anastomosi completata del lembo ingegnerizzato con l'arteria femorale di un ratto prima della rimozione del morsetto e (F) dopo la rimozione del morsetto. Abbreviazioni: HAMEC = cellule endoteliali microvascolari adipose umane; SMA = actina muscolare liscia; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video supplementare S1: Procedura microchirurgica rappresentativa per l'anastomosing dell'impalcatura vascolare all'arteria femorale di un ratto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/supplementary%20video%201%20(1).mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

I lembi ingegnerizzati richiedono una rete vascolare funzionale incorporata. In questo protocollo, presentiamo un metodo per fabbricare un lembo di tessuto stampato in 3D contenente una rete vascolare gerarchica e le sue anastomosi microchirurgiche dirette all'arteria femorale di ratto.

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Il nostro protocollo consente ai ricercatori di generare reti di vasi gerarchici all'interno di un lembo completamente ingegnerizzato e impiantabile, che ha aperto la strada a nuovi studi sul comportamento dei vasi sanguigni nell'integrazione in vivo. Questa tecnica ha combinato la versatilità di due tecnologie di stampa 3D per creare e assemblare vasi sulla micro e mesoscala che possono essere direttamente anastomosi con i vasi ospiti utilizzando la microchirurgia. I lembi vascolarizzati completamente ingegnerizzati possono essere utilizzati per trattare difetti tissutali di grandi dimensioni e per fornire una piattaforma per lo studio degli sviluppi e dell'integrazione dei tessuti.I metodi proposti possono essere estesi per studiare l'incorporazione di cellule tessuto-specifiche, nonché per valutare l'uso di diversi bioink e materiali di supporto. Inizia riempiendo lo stampo BVOH con 30 microlitri della soluzione polimerica. Centrifugare lo stampo a 100 volte g per 2 minuti e rabboccare lo stampo con ulteriori 20 microlitri della soluzione polimerica per garantire il riempimento completo.Congelare gli stampi riempiti a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti per garantire che tutta la soluzione polimerica si congeli. Rimuovere il solvente dagli stampi liofilizzandoli durante la notte. Per rimuovere il materiale dello stampo sacrificale, trasferire gli stampi dopo il processo di liofilizzazione in un bagno d'acqua deionizzato da 5 litri sotto delicata agitazione.Sostituisci l'acqua nella vasca da bagno quando diventa torbida. Quando tutto il BVOH si dissolve, asciugare all'aria gli scaffold e conservarli in una camera a vuoto fino all'uso. Trasferire circa 4 millilitri del materiale di supporto compattato preparato in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti utilizzando una pipetta a spostamento positivo.Toccare la piastra del pozzo su una superficie dura per forzare il materiale di supporto a diffondersi uniformemente nel pozzo. Preparare una sospensione contenente 2 milioni di HAMEC-ZsGreen e 6 milioni di cellule staminali della polpa dentale in 10 millilitri di mezzo cellulare endoteliale. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 volte g per 4 minuti per ottenere un pellet cellulare, quindi aspirare il mezzo surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 millilitro di bioink rhCollMA per ottenere un bioink con una concentrazione cellulare totale di 8 milioni di cellule per 1 millilitro di bioink.Montare un ago da 0,22 millimetri di diametro interno su una cartuccia di stampa ambra da 3 millilitri e posizionare la cartuccia in un tubo conico da 50 millilitri. Trasferire 1 millilitro della miscela cellule-bioink alla cartuccia di stampa riempiendola dall'alto utilizzando una pipetta a spostamento positivo per ridurre le bolle. Installare la cartuccia di stampa nello strumento appropriato presso la bioprinter.Tracciate un modello 2D di un quadrato di 4 millimetri contenente un canale circolare di 2 millimetri di diametro al centro. Estrudete lo sketch di 4 millimetri per ottenere un cubo di 4 millimetri con un canale centrale. Esportare questo oggetto come file STL.Importare un modello STL a 12 pozzetti nella scheda di modellazione solida del software di affettatura bioprinter e posizionarlo nell'area designata del piano di stampa virtuale. Importare il file STL della forma del cubo nella scheda di modellazione solida nel software di slicing bioprinter. Fare clic sulla casella di controllo Usa filtro dei dati esterno, quindi configurare il filtro dei dati nella sezione delle proprietà dell'oggetto.Nella finestra popup, scegliete un motivo rettilineo per il modello di riempimento e digitate 30% nella densità di riempimento, fate clic su Accetta (Accept). Fare clic sul cubo e spostarlo utilizzando il mouse per posizionare una copia della forma del cubo in ogni pozzo virtuale desiderato. Fare clic sul pulsante Aggiungi materiale nella scheda materiali del software di affettatura bioprinter per creare nuove impostazioni del materiale per rhCollMA bioink.Scegliere le impostazioni del materiale per la stampa. Per la pressione, digitare 2 psi e per la velocità digitare 20 millimetri al secondo nelle caselle corrispondenti. Assegnare i valori di larghezza e altezza della linea a 0,24 millimetri e il valore di accelerazione a 400 millimetri per secondo quadrato.Nella scheda Modellazione solida, fare clic sull'oggetto cubo e quindi fare clic sul materiale rhCollMA dalla sezione materiale per assegnarlo alla forma del cubo. Nella scheda Bioassemblaggio, fare clic sul pulsante Invia processo di stampa per inviare il processo di stampa alla bioprinter. Caricare la cartuccia di stampa caricata con il bioink cellulare nello strumento di erogazione pneumatica ambientale da 3 millilitri della bioprinter basata sull'estrusione 3D.Fare clic sul pulsante Freddo nella scheda Controllo riscaldamento o raffreddamento nella schermata dell'interfaccia bioprinter per impostare la temperatura del letto di stampa a 4 gradi Celsius. Caricare la piastra con il bagno di supporto sul letto della stampante. Nella scheda Stampa nella schermata dell'interfaccia bioprinter, fare clic sul processo di stampa, quindi fare clic su Start, seguito da GO per iniziare il processo di stampa.Dopo la stampa, esporre la piastra del pozzo a una sorgente luminosa a 405 nanometri con un'intensità di 3 milliwatt per centimetro quadrato per 30 secondi per avviare la reticolazione del bioink rhCollMA. Dopo la reticolazione, incubare la piastra del pozzo a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per almeno 20 minuti fino a quando tutto il bagno di supporto si scioglie. Aspirare delicatamente il bagno di supporto liquefatto e sostituirlo con il mezzo cellulare endoteliale.Incubare i costrutti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Immediatamente dopo la rimozione del materiale di supporto della rete microvascolare biostampata, posizionare un'impalcatura vascolare PLLA:PLGA rivestita di fibronectina accanto alla struttura biostampata. Inserire l'impalcatura vascolare nel canale principale della struttura bioprinted.Incubare i costrutti assemblati a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due giorni. Preparare una sospensione cellulare di cellule endoteliali microvascolari adipose umane che esprimono tdTomato-express ad una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro. Posizionare una goccia da 20 microlitro di questa sospensione cellulare su una superficie idrofoba.Posizionare delicatamente le impalcature vascolari sopra la goccia in modo tale che il lume dell'impalcatura su un'estremità entri in contatto con la goccia cellulare. Aspirare la goccia dall'estremità opposta dell'impalcatura riempiendo il suo lume con la sospensione cellulare. Posizionare l'impalcatura seduta in un tubo di microcentrazione e metterla in un rotatore all'interno di un incubatore umidificato per 60 minuti.Infine, trasferire l'impalcatura in una piastra a 12 pozzetti e aggiungere 2 millilitri di mezzo cellulare endoteliale. La vista laterale di un lembo ingegnerizzato rappresentativo ripreso quattro giorni dopo il rivestimento endoteliale dell'impalcatura vascolare è mostrata qui. La microvascolarizzazione biostampata è mostrata in verde, mentre il rivestimento endoteliale è mostrato in rosso.L'immagine rappresentativa mostra le anastomosi tra la vascolarizzazione biostampata e il rivestimento endoteliale. L'immunocolorazione per l'actina della muscolatura liscia, i nuclei e le cellule endoteliali dopo sette giorni di incubazione è mostrata qui. L'immagine rappresentativa mostra le anastomosi completate del lembo ingegnerizzato con l'arteria femorale di un ratto prima della rimozione del morsetto e dopo la rimozione del morsetto.Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la maturazione e l'integrazione della vascolarizzazione stampata in 3D in vivo e monitorare la perfusione dell'impianto nell'arto posteriore per stabilire il potenziale e la sicurezza per il suo uso per il trattamento dei difetti tissutali.

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Bioingegneria

Ad oggi, i difetti dei tessuti spessi vengono tipicamente ricostruiti applicando lembi di tessuto autologo o tessuti ingegnerizzati. In questo protocollo, presentiamo un nuovo metodo per l'ingegnerizzazione di un lembo di tessuto vascolarizzato con un peduncolo autologo, per fungere da sostituto dei lembi autologhi.

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

Scalabili vasi sanguigni ingegnerizzati migliorerebbero applicabilità clinica. Uso delle guide facilmente considerevoli 3D-stampati, anelli di muscolatura liscia vascolare sono stati creati e accatastati in una forma tubolare, formando un innesto vascolare. Innesti possono essere dimensionati per soddisfare la gamma di dimensioni delle arterie coronarie umane semplicemente cambiando la dimensione guida 3D-stampata.

Scaling di Engineered vascolari innesti Usando 3D Stampato Guide e il metodo di impilamento Anello

Forniamo un protocollo generalizzato basato su una strategia di multimateriali microfluidici per un letto vascolare di microfibrous, dove un tipo di cellula secondaria potrebbe essere ulteriormente seminato nello spazio interstiziale di questa struttura di microfibrous per generare organoids e tessuti vascolarizzati di ingegneria.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare modelli stampati tridimensionali per la pianificazione preoperatoria e intraoperatoria riorganizzazione dei percorsi vascolari complicati quando si maneggia un'anomalia aortica congenita.

Stampa tridimensionale di un'anomalia aortica complessa

Questo protocollo descrive la produzione di filamenti di policaprolattone (PCL) con microsfere di acido (PLA) incorporato polilattico che contengono matrici decellularizzate (DM) per la stampa 3D del tessuto strutturale ingegneria costrutti.

Processo innovativo per la stampa 3D Decellularized matrici

Presentato qui è un set-up biostampa tridimensionale semplice da usare, nucleo/guscio, tridimensionale per la fabbricazione in un solo passaggio di scaffold cavi, adatto per l'ingegneria tissutale di strutture vascolari e altre strutture tubolari.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Il presente protocollo descrive il modello di lembo fascio-cutaneo suino e il suo potenziale utilizzo nella ricerca sui tessuti compositi vascolarizzati.

Un modello affidabile di lembo fascio-cutaneo suino per studi di bioingegneria di allotrapianti compositi vascolarizzati

Il protocollo descrive l'approvvigionamento chirurgico e la successiva decellularizzazione dei lembi suini vascolarizzati mediante la perfusione di detergente dodecilsolfato di sodio attraverso la vascolarizzazione del lembo in un bioreattore di perfusione personalizzato.

Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

Questo articolo descrive come biostampare in 3D idrogel fototabili per studiare l'irrigidimento della matrice extracellulare e l'attivazione dei fibroblasti.

Idrogel fotoregistrabili in bioprinting 3D per studiare l'attivazione dei fibroblasti

Presentiamo un protocollo per la produzione ad alta produttività di canali vascolari con dimensioni flessibili e modelli desiderati su una piastra standard a sei pozzetti utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D, denominata vessels-on-a-plate (VOP). Questa piattaforma ha il potenziale per far progredire lo sviluppo di terapie per i disturbi associati all'endotelio compromesso.

Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

Scopri la fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati con stampa 3D per l'ingegneria tissutale. Questo metodo combina tecnologie di micro e mesostampa per creare reti vascolari gerarchiche anastomizzabili direttamente all'arteria femorale del ratto.

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

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