Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans
27 luglio 2022
I microbi intestinali, compresi i batteri extracellulari e gli agenti patogeni intracellulari come il virus Orsay e i microsporidi (funghi), sono spesso associati ai nematodi selvatici di Caenorhabditis . Questo articolo presenta un protocollo per rilevare e quantificare i microbi che colonizzano e / o infettano i nematodi C. elegans e per misurare il carico patogeno dopo infezioni controllate in laboratorio.
La colorazione di RNA FISH è utile per la visualizzazione, l'identificazione e la quantificazione dei microbi che colonizzano o infettano naturalmente C.elegans, compresi i batteri del microbioma e i patogeni intracellulari. Questa tecnica è semplice, rapida e robusta, consentendo di colorare e visualizzare efficacemente i microbi nel contesto di un intero animale intatto. Possiamo usare RNA FISH per rilevare e visualizzare i batteri del microbioma intestinale nei C.elegans selvatici.
Questo può aiutarci a capire interazioni comparabili nei sistemi dei mammiferi. Dopo aver trasferito i nematodi con il microbo desiderato di interesse, dalle piastre NGM alle provette per microcentrifuga, lavare i nematodi aggiungendo un millilitro di 1X PBST ai tubi di microfuge. Far girare i campioni in una microcentrifuga o Nanofuge alla velocità appropriata.
Utilizzando una pipetta, rimuovere tutti tranne 100 microlitri di surnatante. Ripetere il lavaggio con PBST due o tre volte. Per fissare i nematodi con paraformaldeide, iniziare aggiungendo 33 microlitri di paraformaldeide al 16% al tubo di microfuge contenente 100 microlitri di surnatante sopra il pellet di nematode per una concentrazione finale del 4% paraformaldeide.
Incubare i campioni contenenti i nematodi colonizzati o infettati dal microbo di interesse per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide e aggiungere 0,5 millilitri di PBST ai campioni. Far girare i campioni in una microcentrifuga alla velocità appropriata come indicato nel manoscritto testuale.
Con una pipetta, rimuovere il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 0,5 millilitri di PBST ai campioni nei tubi di microfuge. Ripetere il lavaggio con PBST due o tre volte.
Dopo l'ultimo lavaggio, girare i campioni e rimuovere il surnatante, lasciando il pellet indisturbato. Quindi, preparare un millilitro di tampone di ibridazione per campione. Aggiungere 800 microlitri di tampone di ibridazione ai tubi di microfuge contenenti il pellet di nematode.
Pellet i campioni nella microcentrifuga. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Preparare 100 microlitri per campione di tampone di ibridazione con la sonda FISH desiderata a una concentrazione finale da 5 a 10 nanogrammi per sonda da microlitri e vortice da miscelare.
Aggiungere 100 microlitri di tampone di ibridazione contenente sonda FISH a ciascun campione. Mescolare muovendo delicatamente o capovolgendo i tubi. Incubare i campioni durante la notte in un bagno asciutto a 46-54 gradi Celsius o in un miscelatore termico a 46-54 gradi Celsius a 1.200 rotazioni al minuto.
Preparare tre millilitri di tampone di lavaggio per campione. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata. Rimuovere il tampone di ibridazione utilizzando una pipetta facendo attenzione a lasciare indisturbato il pellet di nematode.
Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio preparato a ciascun campione. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata. Rimuovere il tampone di lavaggio con una pipetta, facendo attenzione a lasciare il pellet indisturbato.
Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio preparato a ciascun campione. Incubare i campioni per un'ora a 48-56 gradi Celsius in un bagno asciutto o miscelatore termico a 48-56 gradi Celsius a 1.200 rotazioni al minuto. Se si incuba in un bagno asciutto, capovolgere delicatamente i tubi ogni 15-20 minuti.
Centrifugare i campioni alla velocità appropriata. Utilizzando una pipetta, rimuovere il tampone di lavaggio, facendo attenzione a lasciare il pellet indisturbato. Aggiungere da 100 a 500 microlitri di PBST a ciascuno dei campioni.
A questo punto, i campioni possono essere conservati in PBST a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana fino a quando il protocollo è pronto per essere continuato. Pellet i campioni alla velocità appropriata. Rimuovere quanto più PBST possibile senza disturbare il pellet di nematode.
Aggiungere 20 microlitri di mezzo di montaggio anti-sbiadimento con DAPI ai campioni. Caricare un pipetter da 20 microlitri con una punta per pipetta da 200 microlitri e utilizzare le forbici per tagliare la punta della pipetta per consentire la pipetta dei nematodi più grandi. Con la punta della pipetta tagliata, trasferire da 5 a 10 microlitri di pellet su un vetrino da microscopio.
Coprire con un coprislip 22 per 22. Per conservare i vetrini, sigillare i bordi della copertina con lo smalto per unghie e tenerli in una scatola scura a quattro gradi Celsius fino al momento di un ulteriore utilizzo. Sotto il microscopio a contrasto a interferenza differenziale, un ceppo selvatico di Caenorhabditis tropicalis è stato trovato colonizzato con un batterio che sembra aderire direzionalmente all'epitelio intestinale.
Il segnale fluorescente della sonda universale 16S verde rRNA e della sonda rossa delle specie Alphaproteobacteria si sovrappone completamente, suggerendo che la maggior parte dei batteri che colonizzano l'intestino sono il batterio Alphaproteobacteria aderente. Il genoma bipartito dell'RNA del virus Orsay è costituito da segmenti di RNA1 e RNA2 e sono state sviluppate sonde FISH mirate a entrambi i segmenti. La proteina ZIP1 marcata con la proteina fluorescente verde è vista localizzata nei nuclei intestinali delle cellule che mostrano una colorazione positiva del virus Orsay FISH nel citoplasma.
È stato dimostrato che più animali colorati con FISH specifici di Orsay o N.parisii indicano la forza di questo segnale per una facile quantificazione. Co-infezione di C.elegans con due parassiti microsporidi utilizzando sonde specie-specifiche che competono per il legame con il 18S, l'uso di DAPI per colorare i nuclei consente una migliore localizzazione dell'infezione nel contesto dell'intero animale, specialmente per l'intestino che ha nuclei grandi e facilmente identificabili. Le infezioni da N.parisii provocano lo sviluppo di meronti in spore.
La colorazione FISH risultante mostra piccole e grandi strutture a forma di bastoncino che probabilmente corrispondono alle spore di N.parisii, che sono colorate con sonde specifiche di N.parisii in rosso. Quando si seleziona l'agente fissativo, ricordare che la fissazione PFA consente una migliore conservazione della morfologia e della GFP transgenica, ma la fissazione dell'acetone è necessaria per la visualizzazione degli sporoplasmi. RNA FISH può essere utilizzato per identificare e visualizzare i batteri che colonizzano l'intestino di C.elegans.
I ricercatori possono quindi eseguire più screening genetici per identificare i fattori coinvolti in queste interazioni ospite-microbo.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la rilevazione e la quantificazione di microrganismi che colonizzano e infettano C. elegans, inclusi batteri e patogeni intracellulari come il virus Orsay. Il metodo utilizza la colorazione RNA FISH per la visualizzazione e la quantificazione in nematodi interi.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Microbiologia
- Neuroscienze
- Interazione con agenti patogeni
Sfondo
- I microrganismi intestinali svolgono un ruolo fondamentale nella salute di C. elegans.
- Comprendere le interazioni ospite-microbo può fornire informazioni su processi simili nei mammiferi.
- La tecnica RNA FISH è un metodo potente per studiare la colonizzazione microbica.
- Patogeni come il virus Orsay e le microsporidie possono influenzare significativamente la biologia dei nematodi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per la rilevazione e la quantificazione delle infezioni microbiche in C. elegans.
- Migliorare la comprensione delle interazioni microbiche all'interno dell'intestino del nematode.
- Facilitare ulteriori studi genetici sulle dinamiche ospite-microbo.
Metodi Utilizzati
- Colorazione RNA FISH per la visualizzazione di microrganismi.
- Lavaggio e fissazione di nematodi con paraformaldeide.
- Ibridazione con sonde FISH specifiche per il rilevamento mirato.
- Analisi microscopica per valutare la colonizzazione microbica e l'infezione.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dei batteri del microbioma intestinale in C. elegans selvatici.
- Identificazione di patogeni specifici mediante sonde FISH.
- Quantificazione del carico di patogeni nei nematodi infettati.
- Informazioni sulla morfologia e localizzazione delle infezioni.
Conclusioni
- La tecnica RNA FISH è efficace per lo studio delle interazioni microbiche in C. elegans.
- Il protocollo consente un'analisi dettagliata della colonizzazione intestinale e della dinamica dei patogeni.
- I risultati potrebbero orientare future ricerche sulle interazioni ospite-microbo in altri organismi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'FISH su RNA consente la visualizzazione diretta e la quantificazione della colonizzazione microbica e dell'infezione all'interno dell'intestino di Caenorhabditis elegans, fornendo un modello solido per lo studio delle interazioni ospite-microbo rilevanti per i sistemi dei mammiferi. Questo approccio supporta la fase iniziale della scoperta chiarificando la dinamica microbica in un organismo geneticamente manipolabile, guidando la ricerca traslazionale e la riduzione del rischio meccanicistica per terapie mirate al microbioma. La capacità del metodo di rilevare microrganismi diversi, inclusi quelli privi di strumenti genetici, aumenta la fiducia predittiva nella selezione del modello preclinico e nella validazione degli obiettivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente la validazione funzionale della colonizzazione microbica e dell'infezione in un contesto di organismo intero.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica distinguendo tra interazioni commensali e patogeniche.
- Facilita l'analisi guidata da ipotesi sui percorsi ospite-microbo rilevanti per la salute umana.
- Fornisce una piattaforma per schermate genetiche finalizzate all'identificazione di fattori dell'ospite che influenzano la dinamica microbica.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture quantitative standardizzate del carico microbico e della localizzazione in organismi integri.
- Permette la rilevazione riproducibile di batteri, microsporidi e virus mediante sonde specifiche per specie o a spettro ampio.
- Supporta la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per diversi bersagli microbici.
- Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro di screening di composti o screening genetico successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia modellando in vivo l'infezione e la colonizzazione intestinale.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica delle interazioni ospite-microbo.
- Permette decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio quantificando la dinamica dell'infezione e la risposta dell'ospite.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali attraverso la visualizzazione della localizzazione e del carico infettivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di FISH su RNA si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la verifica di ipotesi, la validazione di bersagli e la valutazione quantitativa della colonizzazione microbica in C. elegans. È particolarmente indicato per applicazioni nella fase iniziale della scoperta, nello sviluppo di saggi e nei flussi di lavoro della ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione dei rischi biologici mediante la visualizzazione delle interazioni ospite-microbo in vivo.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per il rilevamento microbico e il carico infettivo.
- Analisi: Permette la misurazione diretta e il confronto della colonizzazione microbica tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti nei modelli sperimentali ai sistemi mammiferi sfruttando la biologia intestinale conservata.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per il rilevamento di diversi microrganismi senza dipendere dalla modifica genetica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi su ospite e microrganismi.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, scalabili e riproducibili per la visualizzazione microbica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati a bersagli legati al microbioma.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di programmi mirati al microbioma in base a un adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di sonde per RNA FISH e nella microscopia a fluorescenza.
- Necessita dell'accesso a reagenti per la fissazione (PFA, acetone) e a infrastrutture per l'acquisizione di immagini.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per la selezione delle sonde e i protocolli di acquisizione.
- Adattabile a diversi bersagli microbici modificando la specificità della sonda.
- Limitato dalla necessità di una selezione accurata della fissazione in base al tipo di microbo e al grado desiderato di preservazione della morfologia.
