Name: Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri il tracciamento del lignaggio delle cellule staminali nel cervello del topo adulto usando un modello transgenico inducibile. Questo metodo permette di analizzare attivazione, proliferazione e differenziazione cellulare in vivo.

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<p class="jove_content">Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) e il dottor Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) per la guida utilizzando animali mTert-rtTA.</p>

<p class="jove_content">Gli autori non hanno nulla da rivelare.</p>

<p class="jove_content">Viene descritto un metodo per la creazione, l'utilizzo e l'analisi di un triplo lignaggio transgenico che traccia la linea di topo che segna le cellule staminali all'interno del cervello di topo adulto <em>in vivo</em>. Se combinato con l'immunocolorazione o la pulizia del cervello, l'identificazione e la caratterizzazione delle cellule fluorescenti tracciate attraverso il cervello possono essere realizzate. Questa tecnica offre la capacità di comprendere il potenziale plastico / rigenerativo / rimodellante delle cellule...

<table><tbody><tr><td>Diluente anticorpale</td> Soluzione per il recupero dell'antigene <td>Agilent</td><td>S080983-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Anticorpo</td> anti-GFP Agilent <td>S2367</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>A2311</td><td>Utilizzare a 1:500-1:000</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>B6. Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:006234</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:007676</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Solution (IHC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato</td><td>BSTEAN</td><td>X0012SYHIV</td><td></td></tr><tr><td>Blocco cerebrale coronale</td><td>Braintree</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D564</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzil etere</td><td>Millipore Sigma</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina Iplato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Eparina Sale sodico da mucosa suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Fissazione tissutale di biologia molecolare</td><td>Amresco</td><td>H120</td><td>Da allora questo prodotto è stato interrotto, ma può essere sostituito con Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td></tr> <tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516813</td><td></td></tr><tr><td>IHC Select TBS Wash Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Westward</td><td>0143-95095-10</td><td>Questo prodotto richiede una licenza DEA per la conservazione e l'uso.</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Milipore</td><td>Millipore</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>Millipore Sigma</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione ottimale per la temperatura di taglio</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione PBS (10X)</td><td>Teknova</td><td>P0496</td><td></td></tr><tr><td>Blocco cerebrale sagittale</td><td>Braintree</td><td>RBM-2000S</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Braun</td><td>S8004-5264</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sudan (Typogen) Nero</td><td>Millipore Sigma</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidrofurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>186562</tr><tr><td>Cartuccia di tessuto</td><td>Simport</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Millipore Sigma</td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>AnaSed</td><td>sc-362950Rx</td><td></td></tr></tbody></table>

tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

<p class="jove_content" fo:break-after="page">Una linea di topo di tracciamento della trascrittasi inversa della telomerasi (Tert) è stata sviluppata per studiare il comportamento e il destino delle cellule staminali dei tessuti adulti, incrociando il sistema "Tet-On" oTet-Cre mouse con un nuovo transgene transattivatore inverso della tetraciclina (rtTA) collegato al promotore Tert, che abbiamo dimostrato segna una nuova popolazione di cellule staminali cerebrali adulte. Qui, la somministrazione del derivato tetraciclina doxiciclina a topi mTert-rtTA::oTet-Cre segnerà in modo indelebile una popolazione di cellule che esprimono un frammento di 4,4 kb della regione promotore del gene Tert. Quando combinato il reporter Rosa-mTmG, i topi mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG esprimeranno tdTomato di membrana (mTomato) fino a quando il trattamento con doxiciclina indurrà la sostituzione dell'espressione di mTomato con EGFP di membrana (mGFP) nelle cellule che esprimono anche Tert. Pertanto, quando questi topi di tracciamento del lignaggio triplo transgenico ricevono doxiciclina (il periodo di "impulso" durante il quale vengono marcate le cellule che esprimono TERT), queste cellule diventeranno cellule mGFP+ indelebilmente marcate, che possono essere monitorate per qualsiasi periodo di tempo desiderabile dopo la rimozione della doxiciclina (il periodo di "inseguimento"), anche se l'espressione di Tert viene successivamente persa. I cervelli vengono quindi fissati per perfusione ed elaborati per l'immunofluorescenza e altre applicazioni a valle al fine di interpretare i cambiamenti nell'attivazione delle cellule staminali, nella proliferazione, nell'impegno del lignaggio, nella migrazione a varie nicchie cerebrali e nella differenziazione verso tipi di cellule mature. Utilizzando questo sistema, qualsiasi topo rtTA può essere accoppiato a oTet-Cre e un reporter Rosa per condurre esperimenti di tracciamento del lignaggio "pulse-chase" inducibili dalla doxiciclina utilizzando marcatori di cellule staminali.</p>

<p class="jove_content">Mentre il segnale fluorescente risultante da un sistema Tet-On con un reporter fluorescente varierà a seconda del promotore di interesse e dei fluorofori utilizzati, descriveremo come i risultati sono stati analizzati con gli animali mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. L'analisi del cervello adulto dopo un inseguimento del polso ha portato a cellule che esprimono GFP di membrana in varie nicchie anatomiche. La differenza di intensità fluorescente tra i vari tipi di cellule deve essere notata. Una variabile per quanto riguar...

<p class="jove_content">La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione <em>in vivo</em>. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.</p>

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

<p>Contrassegnare le cellule staminali e la loro progenie con una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione delle cellule staminali adulte nel cervello in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza. I vantaggi degli approcci di tracciamento del lignaggio transgenico includono la specificità di tracciare un particolare lignaggio cellulare, l'espressione indelebile della proteina fluorescente indipendentemente dal turnover o dalla differenziazione cellulare, la bassa tossicità della doxicilina, l'attivazione condizionata e la facilità d'uso con saggi comuni a valle su tessuti traccia di lignaggio, tra cui immunocolorazione e immunofluorescenza.</p><p>A causa dell'ampia implicazione della plasticità e della cellula nel cervello adulto, la caratterizzazione e l'analisi delle cellule staminali adulte aiuteranno a informare lo studio delle malattie neurodegenerative, degli impatti metabolici sulla plasticità cerebrale, dell'invecchiamento e di altre condizioni cor</p>

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Fate mappatura genetica inducibile (GIFM) segna e cellule brani con fini di controllo spaziale e...

Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule<em> In Vivo</em

Questo articolo descrive una sequenza ottimizzata di eventi per l'imaging multimodale di innesti cellulari nel cervello di roditori utilizzando: (i) in bioluminescenza vivo e la risonanza magnetica, e (ii) post mortem l'analisi istologica. La combinazione di queste modalità di imaging su un singolo animale consente la valutazione del trapianto cellulare ad alta risoluzione, sensibilità e specificità.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

Questo video mostra la procedura per colorare le cellule staminali neurali appena proliferate in sezioni di tessuto cerebrale utilizzando l'incorporazione di EdU, seguita dall'immunofluorescenza per visualizzare proteine specifiche, migliorando la comprensione della dinamica cellulare e della proliferazione.

Colorazione in immunofluorescenza per la visualizzazione di cellule staminali neurali proliferate in sezioni cerebrali di topo

Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Imaging in tempo reale seguito da tracciamento di singole cellule per monitorare la biologia cellulare e la progressione del lignaggio di più popolazioni neurali. J. Vis. Exp. (2017) Il Il video mostra il processo di preparazione, imaging e monitoraggio delle cellule staminali neurali adulte in tempo reale per studiare i comportamenti cellulari, tra cui la divisione e la differenziazione.

 Imaging in tempo reale e tracciamento di singole cellule per monitorare il lignaggio neurale nelle cellule staminali neurali adulte

Fonte: Daynac, M., et. al. Smistamento cellulare di cellule staminali neurali e progenitrici dalla zona subventricolare del topo adulto e imaging dal vivo delle loro dinamiche del ciclo cellulare. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra l'imaging time-lapse di cellule staminali neurali (NSC) da un cervello di topo transgenico utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Le NSC emettono fluorescenza rossa durante la fase G1 e non sono fluorescenti in altre fasi del ciclo cellulare.

Imaging time-lapse della divisione delle cellule staminali neurali di topo mediante microscopia confocale

Riportiamo un metodo basato sul Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) per isolare le cellule staminali neurali (NSC) e la loro progenie dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello del topo adulto. Applicato a topi transgenici FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), consente lo studio della progressione del ciclo cellulare mediante imaging dal vivo.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Qui descriviamo una procedura basata sull'uso di particelle lentivirali per la modificazione genetica a lungo termine delle cellule staminali neurali e/o delle loro cellule ependimali adiacenti nella nicchia neurogenica ventricolare-subventricolare adulta che consente l'analisi separata degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

In questo articolo descriviamo i principi per progettare ed eseguire un esperimento di tracciamento del lignaggio multicolore utilizzando i topi R26R-Confetti. Forniamo un protocollo specifico per il tracciamento delle cellule epiteliali corneali che può essere modificato per altri tessuti di interesse.

Un metodo per Lineage Tracing di cellule corneali Utilizzando multicolori topi reporter fluorescente

È descritto un protocollo robusto per monitorare le popolazioni neurali di time-lapse video-microscopia seguita da basati su software di post-elaborazione. Questo metodo rappresenta un potente strumento per identificare gli eventi biologici in una popolazione selezionata durante esperimenti dal vivo di formazione immagine.

Seguita dalla singola cellula di rilevamento a Monitor biologia cellulare e la progressione di lignaggio di popolazioni neurali Multiple immagini dal vivo

Viene presentato un protocollo per eseguire il tracciamento del lignaggio e l'analisi genetica funzionale dei geni candidati a livello di singola cellula utilizzando l'analisi del mosaico con doppi marcatori (MADM). L'analisi clonale MADM fornisce un quadro quantitativo per misurare il comportamento proliferativo, l'output cellulare e la relazione di lignaggio dei singoli progenitori e delle loro cellule figlie.

Tracciamento del lignaggio e analisi clonale nello sviluppo della Corteccia cerebrale utilizzando l'analisi mosaica con doppi marcatori (MADM)

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Scopri il tracciamento del lignaggio delle cellule staminali nel cervello del topo adulto usando un modello transgenico inducibile. Questo metodo permette di analizzare attivazione, proliferazione e differenziazione cellulare in vivo.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

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