Name: Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri la spettrometria di massa imaging per analizzare il microambiente tumorale nei campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina. Questo metodo consente la caratterizzazione simultanea di fino a 40 marcatori su una singola sezione tessutale.

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Gli autori ringraziano Don Norwood di Editing Services, Research Medical Library di MD Anderson per aver modificato questo articolo e il Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory presso il Department of Translational Molecular Pathology di MD Anderson. Questa pubblicazione è il risultato in parte della ricerca facilitata dal supporto scientifico e finanziario per il Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) fornito attraverso il National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) all'Università del Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).

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<li>Mathieson, W., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+biospecimens+must+be+used+in+genomic+medicine%3A+An+evidence-based+review+and+conclusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).</li>
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<li>Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+spatial+bioimaging+for+combination+therapy+design%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).</li>
<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).</li>
<li>Rad, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pandora%27s+box+of+novel+technologies+that+may+revolutionize+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer.</a> Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Commununications%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+ion+beam+imaging+%28MIBI%29+for+characterization+of+the+tumor+microenvironment+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types.</a> Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

La spiegazione completa delle complesse e intricate interazioni tra le molteplici componenti di una TME rimane un obiettivo fondamentale della ricerca sul cancro. I produttori hanno introdotto numerosi saggi multiplex come parte di questo sforzo, specialmente negli ultimi 5 anni. L'analisi spaziale multiplexata è uno strumento versatile e potente che facilita la categorizzazione simultanea di diversi bersagli preservando la morfologia strutturale nei campioni tumorali. Le tecniche di analisi spaziale possono essere esegu...

L'importanza dei numerosi tipi di cellule che circondano le popolazioni tumorali clonali è un elemento cruciale nella categorizzazione della carcinogenesi. L'interesse nel chiarire la composizione e le interazioni di questo microambiente tumorale (TME) è aumentato continuamente in seguito all'istituzione della terapia a base immunitaria come parte dell'arsenale di trattamento del cancro. Pertanto, le strategie di trattamento sono passate da un approccio incentrato sul tumore a uno incentrato sulla TME1.
Gli sforzi per chiarire il ruolo delle cellule immunitarie nella sorveglianza del tumore e nello sviluppo del cancro sono aumentati notevolmente negli ultimi anni 2,3. Nella ricerca medica, una pletora di metodi, tra cui metodi basati sulla citometria e tecnologie di imaging singleplex e multiplex, sono sorti come parte di questo tentativo di decifrare le interazioni uniche di più elementi delle TME.
Metodi pionieristici come la citometria a flusso (inventata nel 1960), la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e la citometria di massa si concentrano principalmente sull'identificazione e la quantificazione dei componenti della TME4. Anche se le tecniche quantitative basate sulla citometria consentono la fenotipizzazione del paesaggio immunitario, determinare la distribuzione spaziale cellulare è impossibile. Al contrario, metodi come l'immunoistochimica singleplex standard preservano l'architettura tissutale e consentono ai ricercatori di analizzare la distribuzione cellulare, sebbene un numero ridotto di bersagli in una singola sezione di tessuto sia una limitazione di questi metodi 5,6. Negli ultimi anni, le tecnologie di imaging multiplexed per la risoluzione di singole cellule come l'immunofluorescenza multiplex, l'imaging a fluorescenza con codice a barre e la spettrometria di massa per imaging sono emerse come strategie complete per acquisire informazioni sulla colorazione simultanea dei marcatori utilizzando lastessa sezione 7 del tessuto.
Qui presentiamo una tecnologia che accoppia anticorpi marcati con metalli e spettrometria di massa a ioni secondari e consente la quantificazione della risoluzione di singole cellule, la co-espressione dei marcatori (fenotipizzazione) e l'analisi spaziale utilizzando campioni di tessuto fissati in formalina, incorporati in paraffina (FFPE) e freschi congelati (FF) 8,9. I campioni FFPE sono i materiali più utilizzati per i campioni di archiviazione dei tessuti e rappresentano una risorsa più facilmente disponibile per le tecnologie di imaging multiplexed rispetto ai campioni freschi congelati10. Inoltre, questa tecnologia offre la possibilità di riacquisire le immagini mesi dopo. Qui, discutiamo i nostri protocolli di colorazione ed elaborazione delle immagini utilizzando campioni di tessuto FFPE.

<table><tbody><tr><td>100% Alcool Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td></td></tr><tr><td>95% Alcool Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3404</td><td></td></tr><tr><td>80% Alcool Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3279</td><td></td></tr><tr><td>70% Alcool Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R315</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS-T</td><td>Ionpath</td><td>567005</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS a basso contenuto di bario pH 7.4</td><td>Ionpath</td><td></td><td></td>567004</tr><tr><td>10X Tris pH 8,5&nbsp;</td><td>Percorso ionico</td><td>567003</td><td></td></tr><tr><td>4 gradi C Frigorifero</td><td>ThermoScientific</td><td>REVCO</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette con barriera per aerosol P10</td><td>Olympus</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette con barriera per aerosol P20</td><td>Olympus</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette con barriera per aerosol P200</td><td>Olympus</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette con barriera per aerosol P1000</td><td>Olympus</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrifugo Ultrafree-MC</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC30VV00</td> Siero d'asino per 567002 <td></td></tr><tr><td></td><td></td>del <td>percorso</td><td>ionico H2O deionizzato</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip, barattolo per la colorazione dei vetrini EasyDip</td><td>Green, microscopia elettronica verde Sciences</td><td>71385-G</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo per la colorazione dei vetrini EasyDip,</td><td>microscopia elettronica gialla Sciences</td><td>71385-Y</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip Kit di colorazione dei vetrini (barattolo+rack),</td><td>microscopia elettronica bianca Sciences</td><td>71388-01</td><td></td></tr><tr><td>Supporto in acciaio inossidabile EasyDip Microscopia</td><td>elettronica Sciences</td><td>71388-50</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide 70% Microscopia elettronica di grado EM</td><td>Sciences</td><td>16360</td><td></td></tr><tr><td>Buffer per il recupero dell'epitopo indotto dal calore (HIER): 10X Tris con EDTA, pH 9</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino resistente al calore camera</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>62705-01</td><td></td></tr><tr><td>Penna barriera idrofobica</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>Software MIBI/O</td><td>Ionpath</td><td>NA</td> Software MIBIcontrol Ionpath NA <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIBIslide</td><td>Ionpath</td><td>567001</td><td></td></tr><tr><td>MIBIscope</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr> Camera di <tr><td>umidità (camera umida)</td><td>Simport</td><td>M922-1</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato (PBS) Compresse</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>Modulo PT</td><td>Thermo Scientific</td><td>A80400012</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti monouso sterili a flusso rapido</td><td>Fisher Scientific</td><td>097403A</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>BioRocker</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di rotazione (Filtro di rotazione Ultrafree-MC, 0,5 ml 0,1&mu; m )</td><td>MillQ</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Forno a scorrimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>6901</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore per armadio sottovuoto</td><td>VWR</td><td>30621-076</td><td></td></tr><tr><td>Task-whipe</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

I progressi nelle terapie a base immunitaria hanno rivoluzionato il trattamento e la ricerca sul cancro. Ciò ha innescato una crescente domanda per la caratterizzazione del panorama immunitario tumorale. Sebbene l'immunoistochimica standard sia adatta per lo studio dell'architettura tissutale, è limitata all'analisi di un piccolo numero di marcatori. Al contrario, tecniche come la citometria a flusso possono valutare più marcatori contemporaneamente, sebbene le informazioni sulla morfologia del tessuto vengano perse. Negli ultimi anni, le strategie multiplexed che integrano l'analisi fenotipica e spaziale sono emerse come approcci completi alla caratterizzazione del panorama immunitario tumorale. Qui, discutiamo di una tecnologia innovativa che combina anticorpi marcati con metallo e spettrometria di massa a ioni secondari concentrandoci sulle fasi tecniche nello sviluppo e nell'ottimizzazione del test, nella preparazione dei tessuti e nell'acquisizione e nell'elaborazione delle immagini. Prima della colorazione, è necessario sviluppare e ottimizzare un pannello anticorpale marcato in metallo. Questo sistema di immagini hi-plex supporta fino a 40 anticorpi marcati con metallo in una singola sezione di tessuto. Da notare, il rischio di interferenze del segnale aumenta con il numero di marcatori inclusi nel pannello. Dopo la progettazione del pannello, è necessario prestare particolare attenzione all'assegnazione dell'isotopo metallico all'anticorpo per ridurre al minimo questa interferenza. Il panel test preliminare viene eseguito utilizzando un piccolo sottogruppo di anticorpi e il successivo test dell'intero pannello nei tessuti di controllo. Sezioni di tessuto fissate in formalina e incorporate in paraffina sono ottenute e montate su vetrini rivestiti d'oro e ulteriormente colorate. La colorazione richiede 2 giorni e ricorda da vicino la colorazione immunoistochimica standard. Una volta che i campioni sono macchiati, vengono posizionati nello strumento di acquisizione delle immagini. I campi visivi vengono selezionati e le immagini vengono acquisite, caricate e archiviate. La fase finale è la preparazione delle immagini per il filtraggio e la rimozione delle interferenze utilizzando il software di elaborazione delle immagini del sistema. Uno svantaggio di questa piattaforma è la mancanza di software analitico. Tuttavia, le immagini generate sono supportate da diversi software di patologia computazionale.

Sono state ottenute sezioni di tessuto TMA di tonsille e adenocarcinoma polmonare (spessore 5 mm) e posizionate al centro di vetrini rivestiti d'oro seguendo le specifiche relative alle dimensioni del tessuto e ai margini sicuri dei vetrini. I margini di vetro liberi di 5 mm e 10 mm tra il bordo del tessuto e i bordi laterali e inferiori dei vetrini, rispettivamente, sono necessari per una colorazione ottimale. Le sezioni di tessuto sono state cotte durante la notte in un forno prima della colorazione per garantire la co...

Nell'era dell'immunoterapia del cancro, l'interesse nel chiarire le dinamiche del microambiente tumorale è aumentato in modo sorprendente. Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica di imaging con spettrometria di massa rispetto alle sue fasi di colorazione e imaging, che consentono un'analisi spaziale altamente multiplexata.

Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Questi protocolli consentono la quantificazione della risoluzione di singole cellule, la co-espressione dei marcatori e un'analisi speciale utilizzando campioni di tessuto congelato fresco e fissati in formalina e incorporati in paraffina per chiarire i ruoli delle cellule immunitarie nel cancro. Questa tecnica è un potente strumento che facilita la caratterizzazione simultanea di un marcatore 40 su una singola sezione di tessuto, preservando ampiamente la struttura del tessuto nei campioni. Il passo critico è l'ottimizzazione e la convalida degli anticorpi.Il mancato completamento del passaggio può causare immagini di bassa qualità che possono compromettere il mantenimento di dati e risultati riproducibili di alta qualità. Iniziare ruotando tutti i tubi contenenti anticorpi a 10.000 x G per cinque minuti, aggiungere singoli anticorpi al tampone bloccante e mescolare bene. Non disturbare il fondo del tubo anticorpale durante il pipettaggio.Filtrare il pannello anticorpale pre-bagnando un dispositivo filtrante centrifugo da 0,1 micrometri con 100 microlitri di tampone bloccante. Ruotare il filtro a 10.000 x G per due minuti e rimuovere il flusso del buffer di blocco con una pipetta. Quindi trasferire il pannello anticorpale in una colonna di rotazione e ruotare il filtro a 10.000 x G per due minuti.Scartare la colonna di rotazione e utilizzare il flow-through come pannello anticorpale filtrato. Per la colorazione degli anticorpi, rimuovere il tampone bloccante dalle diapositive ribaltando ogni diapositiva su un lato e picchiettando delicatamente i bordi contro un tergicristallo. Posizionare i vetrini in una camera di umidità e aggiungere da 100 a 200 microlitri di miscela principale anticorpale al tessuto.Aggiungere vetrini di controllo positivi e negativi al lotto di colorazione e incubare i vetrini a 4 gradi Celsius durante la notte. Per configurare lo strumento, accedere al software di controllo e fare clic su Wake Up, se lo strumento è in modalità di sospensione. Fare clic su Exchange Sample per caricare una diapositiva e quindi fare clic su Continua per aprire la porta.Metti la diapositiva nella fessura di caricamento con un campione rivolto verso l'alto e l'etichetta a destra, fai clic su Continua per chiudere la porta. Selezionare il progetto e quindi selezionare il nome della diapositiva per l'esempio caricato. Visualizzare l'immagine panoramica nel riquadro ottico dell'immagine della diapositiva per il campo visivo o la selezione FOV, fare clic sul menu Modalità e selezionare Rilevatore di elettroni secondario, quindi fare clic sul menu Modalità imaging e selezionare QC 300 micrometri.Fare clic su Jog Stage per controllare la posizione del FOV e quindi fare clic sulle frecce per navigare e selezionare la posizione del FOV. Fare clic su Aggiungi FOV, impostare 400 micrometri per 400 micrometri come dimensione del campo e selezionare Fine come modalità di imaging e 1 millisecondo di tempo di permanenza, fare clic su Conferma. Dopo aver creato un elenco FOV, procedere alla messa a fuoco dell'immagine e regolare la stigmazione spostando il raggio in una regione del tessuto che non verrà visualizzata.Regolare i parametri fino a ottenere un'immagine centrale chiara, fare clic su Avvia esecuzione. Le immagini acquisite verranno automaticamente caricate e archiviate nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul web. La matrice mostrata qui descrive la percentuale di diafonia derivata dalla purezza della sonda e dagli ossidi.Qui le caselle blu indicano maggiore o uguale allo 0,5% di diafonia e le caselle trasparenti indicano meno di 0,5% di diafonia. Per i tag di massa, qui sono mostrate le sonde che hanno contribuito almeno allo 0,5% di diafonia in nessun canale, uno o due canali o più di due canali. Vengono mostrati anche canali di massa che ricevono almeno lo 0,5% di diafonia da nessuna sonda, una o due sonde o più di due sonde.Le immagini di colorazione rappresentative in diversi tessuti come l'adenocarcinoma polmonare, il rene non neoplastico e le tonsille sono raffigurate qui. Qui viene presentata un'immagine di una sezione di tessuto tonsillare colorata con questa tecnica e visualizzata utilizzando un programma software di analisi delle immagini digitali di terze parti prima del filtraggio e della correzione. L'immagine della stessa sezione nelle stesse condizioni dopo i passaggi di filtraggio e correzione è mostrata qui.Questo metodo genera immagini che possono essere caricate su un software di analisi delle immagini digitali di terze parti, consentendo analisi complete come la compartimentazione tissutale, la segmentazione cellulare, la co-espressione dei marcatori, nonché l'analisi dei vicini e l'analisi a distanza. Attraverso la ricerca sono disponibili metodi di imaging altamente multiplex. Costruendo diversi pannelli, i ricercatori possono studiare campioni di cancro, normali, paraneoplastici, infiammatori e infettivi.

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Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina (Video) | JoVE Journal

Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

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