Un metodo semi-automatico e riproducibile a base biologica per quantificare la deposizione di calcio in vitro

Il nostro metodo consente di misurare la propensione alla calcificazione dei campioni di pazienti utilizzando cellule muscolari lisce vascolari umane. Ciò contribuirà a spingere la ricerca sui disturbi della calcificazione vascolare, assistendo nello sviluppo di nuove terapie. Questa tecnica utilizza un rilevamento basato su fluorescenza, che aumenta la sensibilità e consente di misurare i campioni nel tempo, riducendo così la necessità di repliche e aumentando la robustezza.

Per iniziare, colture di cellule muscolari lisce vascolari umane su palloni di coltura cellulare non rivestiti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dividere le celle al raggiungimento del 70-90% di confluenza. Per dividere, lavare gli HVSMC due volte con PBS.

Aggiungere tripsina e incubare per 2-5 minuti a 37 gradi Celsius. Inibire la reazione della tripsina aggiungendo un siero contenente mezzo. Centrifugare le celle per 4 minuti a 350 RCF e risospendere il pellet in un mezzo di mantenimento.

Dopo aver preparato le cellule per una divisione come dimostrato, contare e seminare le cellule in una piastra a 48 pozzetti per iniziare l'esperimento di calcificazione. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, lavare delicatamente le cellule due volte con PBS, aspirando accuratamente tutto il PBS rimanente dopo il secondo lavaggio. Aggiungere delicatamente il mezzo di calcificazione e incubare ulteriormente a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Controllare quotidianamente con un microscopio ottico fino a quando non si verifica la calcificazione. Per rilevare la calcificazione tramite imaging, aprire il software e selezionare Protocolli e Crea nuovo. Selezionare Procedura e fare clic su Imposta temperatura.

Impostare la temperatura su 37 gradi Celsius e la sfumatura su 1 grado Celsius nella finestra pop-up e fare clic su OK. Selezionare il tipo di piatto scelto dal menu a discesa. Aggiungere il passaggio dell'immagine facendo clic su Immagine. Selezionare l'Inverted Imager e fare clic su OK. Aggiungere tre canali di imaging e impostarli su DAPI, RFP e Bright Field.

Spuntare la casella Montaggio e impostare il numero desiderato e la posizione delle immagini. Modificate la sovrapposizione per rappresentare una migliore copertura di ciascun pozzo. Selezionare i pozzi da fotografare.

Si aprirà una nuova finestra dove è possibile selezionare i pozzi di interesse. Fare clic su Opzioni di messa a fuoco per impostare la modalità di messa a fuoco. Si aprirà una nuova finestra.

Imposta ogni canale singolarmente. Comunemente, i pozzi sono auto-focalizzati sul canale DAPI. Impostate tutti gli altri canali su Altezza focale fissa dal primo canale e impostate facendo clic su OK. Chiudere la finestra.

Avviare i passaggi di riduzione dei dati di preimpostazione facendo clic su Riduzione dati e selezionare Pre-elaborazione immagini. Accettare le impostazioni predefinite selezionando OK. Impostare un passaggio per contare le celle selezionando Analisi cellulare. Selezionare TsF DAPI Images dal menu a discesa del canale.

Impostare ulteriori dettagli dopo l'esecuzione dell'imaging. Preparare l'analisi del segnale RFP selezionando Statistiche nel passaggio Etichetta della finestra pop-up e selezionare TsF RFP come canale di ingresso. Selezionare le caselle Valore superiore e Valore inferiore.

Spuntare la casella per Area totale nell'elenco inferiore. Selezionate Nessuno nella colonna Effetto colore. Nella finestra pop-up, fai clic su Personalizzato e seleziona la casella Sfondo.

Premere OK. Per una lettura corretta, normalizzare il segnale RFP per cella premendo Ratio sul lato sinistro. Nella finestra pop-up, selezionare Area totale quantificazione RFP. Per Input dati 1 dal menu a discesa e selezionare Conteggio celle come Input dati 2.

Infine, selezionare un nuovo nome set di dati e premere OK due volte. Selezionare Effetto colore come illustrato in precedenza e fare clic OK.In'angolo superiore sinistro, selezionare File e salvare il file come tipo di file di protocollo. Registrare le osservazioni per ogni punto temporale dopo che si è verificata la prima istanza di calcificazione.

Premere Leggi ora nel software di avvio e fare clic su Protocollo esistente. Selezionare il protocollo creato nel passaggio precedente. Il programma chiederà di salvare l'esperimento.

Questo può essere fatto in questa fase o successivamente manualmente facendo clic sul pulsante Salva in alto a sinistra. Una finestra pop-up chiederà di attendere che il sistema si riscaldi. Accendere il controller del gas anidride carbonica e impostarlo su 5%Una volta che il sistema ha raggiunto la temperatura impostata, apparirà un prompt per inserire una piastra e leggere.

Premere Annulla. Trasportare la piastra dall'incubatore all'imager in una cassetta di sicurezza per evitare rotture e fuoriuscite ed è in linea con le normative locali sulla biosicurezza per il trasporto di cellule vive in caso di incidente. Inserire la piastra nel lettore di piastre.

Fare clic su Procedura. Nella finestra pop-up, selezionare Preset Imaging Step (Passaggio imaging predefinito). Regolare prima la messa a fuoco e l'esposizione sul canale DAPI.

Deseleziona la casella Esposizione automatica su tutti i canali, quindi fai clic sull'icona del microscopio accanto al canale DAPI. Si aprirà una nuova finestra. Selezionare il riquadro per dirigere lo stato attivo.

Se un segnale è già visibile, fare clic su Autofocus e quindi su Auto Exposure. In caso contrario, aumentare prima l'esposizione e ripetere Autofocus e Auto Exposure. L'esposizione può essere regolata manualmente selezionando il menu a discesa Esposizione.

Controllare le impostazioni su più pozzi, quindi salvare le impostazioni. Regolare l'esposizione nello stesso modo per tutti i canali. Per il canale RFP, assicurati di iniziare con un pozzo con calcificazione medio-alta.

Chiudere la finestra della procedura e selezionare il pulsante verde Leggi ora nella barra delle applicazioni superiore. Salvare l'esperimento come indicato dal software. Ripetere questo processo per ogni punto temporale.

Mentre il sistema legge la lastra, tutte le immagini vengono elaborate automaticamente in background. Regolare le impostazioni per il conteggio delle celle selezionando le immagini DAPI TsF da visualizzare. Selezionare il pozzo di scelta facendo doppio clic.

Apparirà una nuova finestra. Seleziona una delle immagini. Selezionare la scheda Analisi nella finestra pop-up.

Selezionare Cellular Analysis Cell Count (Conteggio celle analisi cellulare) e fare clic su OK. Deselezionate i canali RFP e Bright Field. Selezionare la casella Evidenzia oggetti. Fare clic su Opzioni per aprire il menu.

Regolare la soglia di dimensione e intensità per includere tutti i nuclei, ma escludere i detriti, quindi fare clic su OK. Fai clic su Applica modifiche in basso a sinistra per applicare le impostazioni a tutte le immagini. Allo stesso modo, seleziona un'immagine ben fine con una quantità medio-alta di calcificazione. Per regolare al meglio il rapporto segnale/rumore, fare clic sulla scheda Analisi nel menu Attività.

Seleziona Statistiche immagine. Deselezionate il canale DAPI e Bright Field. Fare clic su Opzioni per aprire il menu.

Spuntare la casella Soglia valori anomali. Per impostare il valore di soglia non soggettivo per il segnale sopra lo sfondo, selezionate lo strumento Linea dalla barra delle applicazioni. Apparirà una finestra.

Disegna una linea attraverso una macchia di segnale includendo un'area dello sfondo. Regolare i valori superiori e inferiori delle soglie. Conta solo il segnale sopra lo sfondo ed escludi se ci sono detriti o artefatti.

Fare clic su OK e applicare le modifiche per trasferire le impostazioni a tutti gli altri pozzi. Verificare che la soglia sia selezionata accuratamente negli altri pozzi. Una volta impostate le soglie di conteggio delle celle e RFP, esportare i dati.

Fai clic sul pulsante Excel accanto al menu a discesa per esportare i dati direttamente in un foglio di calcolo. Sono state rilevate e analizzate diverse fasi di calcificazione che vanno dal basso all'alto. La calcificazione è stata individuata come macchie nere utilizzando la microscopia ottica, che sono state utili per la valutazione primaria e determinare quando iniziare l'imaging.

Per un migliore rapporto segnale-rumore, le immagini RFP elaborate sono state analizzate per quantificare la calcificazione. I dati sono stati ottenuti confrontando due o più condizioni nello stesso punto temporale. I dati sono stati normalizzati al conteggio delle cellule come area di calcificazione per cellula.

I dati sono stati anche rappresentati come una serie temporale che mostra la stessa condizione in vari punti temporali. È importante che i risultati dopo la riduzione e l'analisi dei dati riflettano ancora ciò che si può vedere prima della trasformazione e della soglia dell'immagine.