Name: Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Scopri un metodo per misurare la crescita del muscolo scheletrico in Danio rerio vivo con alta precisione spaziale e temporale. Questa tecnica aiuta a studiare la regolazione della crescita muscolare e le sue implicazioni per le patologie da atrofia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori sono profondamente in debito con gli sforzi dei membri del laboratorio Hughes Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin e Vladimir Snetkov per lo sviluppo dei protocolli descritti, e a Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau e Peter Currie per aver condiviso plasmidi o linee di zebrafish. SMH è uno scienziato del Medical Research Council (MRC) con sovvenzione del programma G1001029, MR / N021231 / 1 e MR / W001381 / 1. MA ha conseguito una borsa di studio di dottorato del programma di formazione di dottorato MRC presso il King's College di Londra. Questo lavoro ha beneficiato dell'input trigonometrico di David M. Robinson, studioso, mentore e amico.

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Qui riportiamo un metodo per la stima accurata ed efficiente del volume muscolare delle larve vive di zebrafish in stadi o in varianti genetiche in cui la pigmentazione non è un grosso ostacolo all'imaging e quando l'anestesia transitoria e / o l'immobilizzazione sono ben tollerate. Mentre abbiamo impiegato la microscopia confocale a scansione laser, gli approcci descritti sono applicabili alla microscopia confocale a disco rotante o a foglio luminoso e a qualsiasi altro metodo che crea pile di immagini su piani focali d...

La crescita tissutale regolata, che comprende l'aumento del numero cellulare (iperplasia) e / o delle dimensioni delle cellule (ipertrofia), è un fattore cruciale nello sviluppo, nella rigenerazione e nell'adattamento ecologico ed evolutivo. Nonostante gli enormi progressi nella comprensione genetica molecolare della biologia cellulare e dello sviluppo negli ultimi decenni, la comprensione meccanicistica della regolazione delle dimensioni dei tessuti e degli organi è ancora agli inizi. Una delle ragioni di questa lacuna nella conoscenza è la difficoltà di quantificare la crescita dei tessuti negli organismi viventi con la necessaria precisione spaziale e temporale.
Vari aspetti della crescita di organismi interi possono essere misurati ripetutamente nel tempo, rivelando curve di crescita per ogni individuo 1,2,3,4,5. Metodi di scansione sempre più sofisticati, come la doppia assorbimetria a raggi X (DXA), la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI), consentono di tracciare la crescita di interi organi e altre regioni del corpo (ad esempio, singoli muscoli scheletrici identificati) in singoli individui, sia umani che in organismi modello 6,7,8,9,10 . Tuttavia, questi metodi non hanno ancora la risoluzione di rivelare le singole cellule e quindi i legami tra i comportamenti cellulari e la crescita a livello tissutale sono stati difficili da discernere. Per stabilire tali collegamenti, gli studi tradizionali si sono spesso basati su coorti di singoli animali simili, alcuni dei quali vengono sacrificati in punti temporali successivi e quindi analizzati in dettaglio citologico. Tali approcci richiedono la media dei cambiamenti osservati tra gruppi di individui (preferibilmente simili, ma comunque variabili) e quindi soffrono di una mancanza di risoluzione temporale e spaziale, rendendo difficile trovare eventi correlati a livello cellulare indicativi di causa ed effetto.
Studi su organismi modello invertebrati, inizialmente in C. elegans e D. melanogaster, hanno aggirato questi problemi sviluppando la microscopia ottica per ottenere la risoluzione cellulare e misurare con precisione la crescita nel tempo in singoli individui. Tali studi hanno rivelato comportamenti di lignaggio cellulare sorprendentemente invarianti nella crescita di questi piccoli organismi modello 11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, molti animali, compresi tutti i vertebrati, hanno linee cellulari indeterminate e controllano la crescita dei tessuti attraverso misteriosi processi di feedback che servono a trasformare il programma di crescita geneticamente codificato in un organismo tridimensionale funzionale con tutti i suoi tessuti e organi costitutivi adeguatamente abbinati in termini di dimensioni. Per comprendere questi complessi processi di crescita, è auspicabile immaginare interi tessuti o organi nel tempo in singoli individui che possono essere manipolati sperimentalmente da interventi genetici, farmacologici o di altro tipo in un momento di scelta e l'effetto successivamente analizzato.
Ogni muscolo scheletrico vertebrato ha una dimensione, una forma e una funzione definite e interazioni ben caratterizzate con i tessuti adiacenti, come ossa, tendini e nervi. Alcuni muscoli sono piccoli, si trovano appena sotto la pelle e sono quindi buoni candidati per studi di imaging ad alta risoluzione. Simile alla maggior parte degli organi, ogni muscolo cresce durante la vita embrionale, postnatale e giovanile, prima di raggiungere una dimensione adulta stabile. Il muscolo, tuttavia, ha anche una capacità unica di cambiare dimensione durante la vita adulta, a seconda dell'uso e della nutrizione18, e questa proprietà ha un impatto importante sulla forma fisica dell'organismo, sulle prestazioni sportive e sulla vita indipendente. La perdita di massa muscolare e di funzione in età avanzata, la sarcopenia, è un problema di crescente preoccupazione per le società che affrontano l'invecchiamento della popolazione 19,20,21.
Noi e altri ci siamo concentrati sulla crescita di blocchi definiti di tessuto muscolare scheletrico nel corpo segmentalmente ripetuto delle larve di zebrafish, come un sistema apparentemente chiuso contenente diverse centinaia di cellule in cui la crescita, il mantenimento e la riparazione dei tessuti possono essere osservati e manipolati 22,23,24,25,26. Mentre alcuni lavori quantitativi sono stati precedentemente riportati 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, non è disponibile alcun metodo dettagliato e convalidato per misurare la crescita muscolare in dettaglio cellulare nei singoli organismi vertebrati nel tempo. Qui viene descritto un protocollo efficiente su come eseguire tali misurazioni ripetute, insieme alla convalida, e viene fornito un esempio del suo uso per analizzare i cambiamenti nella crescita ipertrofica e iperplastica in risposta all'attività elettrica alterata.

<table><tbody><tr><td>Adesivo, Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Aspirapolvere per aerosol&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-Agarosio</td><td></td></tr><tr><td>, bassa temperatura di gelificazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Una volta sciolto, conservare a 37oC in un riscaldatore a blocco per rimanere in forma liquida per un uso ripetuto.</td></tr><tr><td>Riscaldatore a blocco</td><td>Cole-Parmer</td><td>SBH130-BODIPY</td><td></td></tr> <tr><td>FL C5-ceramide</td><td>Thermo Scientific</td><td>D3521</td><td>Da diluire in acqua di pesce e utilizzare a 5 &5; M per l'incubazione notturna.</td></tr><tr><td>Clip e fili di coccodrillo</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Fiji/imageJ</td><td>National Institutes of Health, NIH-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Medium per pesci, acqua per pesci-</td><td></td><td>-</td><td>Acqua del sistema di circolazione raccolta dall'impianto ittico.</td></tr><tr><td>Pesce medio, E3 medio</td><td>-</td><td>-</td><td>E3 è descritto in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 e 0,33 mM MgSO4 in acqua distillata).</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16F</td><td>Si prevede che siano adatti anche microscopi a fluorescenza di altro tipo.</td></tr><tr><td>Ago di vetro</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100-6</td><td>Da lucidare a fuoco per evitare danni agli embrioni durante la manipolazione.</td></tr><tr><td>Stimolatore per erba</td><td>Grass Instruments</td><td>S88</td><td>Si prevede che siano adatti anche stimolatori di altro tipo.</td></tr><tr><td>Kimwipes, panni per attività delicate</td><td>Kimberly-Clark Microscopio a scansione professionale</td> <td>13258179-Laser</td><td></td></tr> <tr><td>(LSM)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880</td><td>LSM di altro tipo dovrebbero essere adatti.</td></tr><tr><td>Nunc Piastra a 6 pozzetti trattata</td> per colture cellulari <td>Thermo Scientific</td> <td>140675-Objective</td><td></td></tr><tr><td>, 20&/1.0W</td> immersione in acqua <td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur, graduata 1 mL</td> Pipetta <td>Starlab Group</td><td>E1414-0100-Pasteur</td><td></td></tr><tr><td>, Micro Fine Tip 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-1100-Piastra</td><td></td></tr> <tr><td>di Petri, 60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td>-</td></tr><tr><td>Plasmide, CMV-Cerulean</td><td>Christina L. Hammond (Università di Bristol)</td><td></td><td>pCS2+_cerulean_kanR plasmide iniettato a 25-75 pg allo stadio di una cellula. Citazione: Bussman J e Schulte-Merker S. (2011) Sviluppo 138:4327-4332. DOI: 10.1242/dev.068080.</td></tr><tr><td>Plasmide, pCS-mCherry-CAAX</td><td>Henry Roehl (Università di Sheffield)</td><td>-</td><td>Per la trascrizione in vitro utilizzando il promotore SP6 (possono essere utilizzati plasmidi contenenti altri marcatori di marcatura della membrana); sintetizzato mRNA con cappuccio da iniettare a 100-200 pg allo stadio di una cellula.</td></tr><tr><td>Regolatore di impulsi&nbsp;</td><td>Hoefer Scientific Instruments</td><td>PC750-Saldatore</td><td></td></tr> -<tr><td></td><td></td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato / MS-222; da sciogliere in acqua di pesce e utilizzare a 0,6 mM.</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pinze per orologiai, n. 5</td><td>-</td><td>-</td><td>-Filo</td></tr><tr><td>, Platino</td><td>Goodfellow</td><td>PT005142/12</td><td>0,40 mm di diametro; una costosa alternativa all'argento.</td></tr><tr><td>Filo, Silver</td><td>Acros Organics</td><td>317730010</td><td>0,25 mm di diametro (è stato testato un intervallo di diametri cioè 0,25-0,5 mm, che ha prodotto risultati simili).</td></tr><tr><td>Zebrafish, myog:H2B-mRFP</td><td>David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)</td><td>-</td><td>Nome ufficiale ZFIN: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2&nbsp; Citazione: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yord&aacute; n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging dell'eterogeneità delle cellule tumorali dopo il trapianto di cellule in zebrafish immunodeficiente otticamente chiaro. Nat Commun. 21 gennaio 2016;7:10358. DOI: 10.1038/ncomms10358.</td></tr><tr><td>Zebrafish, &alpha;-actin:mCherry-CAAX</td><td>Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)</td><td>-</td><td>ZFIN nome ufficiale: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citazione: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, e Currie PD. Perdita di Tropomodulina4 nel mutante del pesce zebra tr&auml; La GE provoca la formazione di bastoncelli citoplasmatici e debolezza muscolare che ricorda la miopatia nemalinica. Dis Model Mecc. 2014 Dicembre; 7(12):1407-15. DOI: 10.1242/dmm.017376.</td></tr><tr><td>Zebrafish, &beta;-actina:HRAS-EGFP</td><td>-</td><td>-</td><td>ZFIN nome ufficiale: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2&nbsp; Citazione: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I e Kimelman D. Visualizzazione della morfogenesi in embrioni di zebrafish transgenico utilizzando il colorante BODIPY TR metilestere come controcolorante vitale per la GFP. Dev Dyn. febbraio 2005; 232(2):359-68. DOI: 10.1002/dvdy.20252.</td></tr><tr><td>ZEN software</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

Un certo numero di metodi può essere utilizzato per visualizzare singole cellule in tutto il corpo di zebrafish embrionale, larvale o giovanile vivo. Mostriamo che i pesci vivi con membrane plasmatiche marcate in modo fluorescente possono essere scansionati in un microscopio a scansione laser confocale per determinare il volume del tessuto muscolare e il numero di fibre muscolari presenti. Approcci efficienti per la misurazione del numero e delle dimensioni delle cellule negli animali vivi nel tempo sono descritti e convalidati rispetto a metodi di segmentazione più difficili. Vengono descritti metodi che consentono il controllo dell'attività elettrica muscolare, e quindi contrattile. La perdita dell'attività contrattile del muscolo scheletrico ha ridotto notevolmente la crescita muscolare. Nelle larve viene descritto un protocollo che consente la reintroduzione dell'attività contrattile evocata elettricamente. I metodi descritti minimizzano l'effetto della variabilità interindividuale e permetteranno di analizzare l'effetto di stimoli elettrici, genetici, farmacologici o ambientali su una varietà di parametri di crescita cellulare e fisiologica nel contesto dell'organismo vivente. Il follow-up a lungo termine degli effetti misurati di un intervento definito all'inizio della vita sugli individui può essere successivamente eseguito.

Una misura rapida e precisa del volume di somite Viene descritto un metodo di preparazione del campione, acquisizione dei dati e analisi volumetrica che consente la rapida misurazione della crescita muscolare nelle larve di zebrafish. La dimensione muscolare può essere misurata negli animali vivi utilizzando pesci marcati sulle loro membrane plasmatiche con una GFP mirata alla membrana (β-actina: HRAS-EGFP) o mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). Le larve sono state anestetizzate transit...

La chiarezza ottica è un grande vantaggio per il lavoro biologico e fisiologico delle cellule nel pesce zebra. Vengono descritti metodi robusti per la misurazione della crescita cellulare nei singoli animali che consentono nuove intuizioni su come la crescita del muscolo scheletrico e dei tessuti vicini sono integrati con la crescita di tutto il corpo.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Il nostro protocollo ci permette di studiare come i tessuti, come il muscolo scheletrico, regolano le loro dimensioni, che rimane una questione chiave nella biologia cellulare e dello sviluppo con importanti implicazioni fisiologiche e mediche. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che la crescita cellulare può essere osservata e misurata in animali vivi in vivo in vivo con un alto grado di accuratezza spaziale e temporale. I progressi nella comprensione di base della crescita muscolare precoce possono evidenziare le origini dello sviluppo dei problemi muscolari precoci e portare alla scoperta di Novo Therapeutics per la protezione contro la perdita muscolare negli anziani e nei pazienti con disturbi muscolari.Preparare l'1% LMA in un tubo da 1,5 millilitri e tenerlo in un blocco termico di 37 gradi Celsius per un uso ripetuto. Seleziona il pesce da montare e anestetizza transitoriamente ogni pesce. Per evitare shock termici, rimuovere l'aliquota LMA dal blocco termico e lasciarla raffreddare appena sopra l'impostazione.Prendi una capsula di Petri da 60 millilitri che è stata rivestita con uno strato di LMA all'1% e posizionala sul palco di un microscopio da dissezione. Tr

real-time-repeated-measurement-skeletal-muscle-growth-individual-live

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo video dimostra la registrazione di segnali elettrici dai neuroni afferenti in una larva di pesce zebra paralizzata posizionando una micropipetta vicino al ganglio della linea laterale e formando un sigillo allentato per la cattura del segnale. La soluzione extracellulare mantiene la vitalità neuronale durante questo processo.

Monitoraggio dei segnali elettrici dai neuroni afferenti in una larva di pesce zebra immobilizzata

Un metodo semplice per registrare potenziali di campo extracellulari nel proencefalo larvale zebrafish è descritto. Il metodo fornisce un...

Proencefalo registrazione elettrofisiologica in larvale Zebrafish

Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

Misure di forza possono essere utilizzati per dimostrare i cambiamenti nella funzione muscolare a causa di sviluppo, infortunio, malattia, trattamento o tossicità chimica. In questo video, dimostriamo un metodo per misurare la forza durante una contrazione massimale di zebrafish muscolare tronco larvale.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Il pesce zebra è ora uno strumento consolidato e potente per modellare distrofie muscolari, miopatie congenite e malattie neuromuscolari correlate. La birifrangenza e il comportamento di fuga evocato dal tatto sono due comuni test non invasivi utilizzati per determinare il grado di disorganizzazione muscolare e compromissione locomotiva degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo precoce.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

Questo documento descrive come un zebrafish adulto può essere immobilizzata, intubato, e utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia in vivo per permettere registrazioni e manipolazione di attività neurale in un animale intatto.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

I pesci zebra sono un modello eccellente per studiare la funzione muscolare e le malattie. Durante l'embriogenesi precoce, il pesce zebra inizia contrazioni muscolari regolari producendo un comportamento ritmico di nuoto, che viene alterato quando il muscolo viene interrotto. Qui descriviamo una risposta evocata al tatto e un saggio di locomozione per esaminare le prestazioni di nuoto come misura della funzione muscolare.

Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

Qui vi mostriamo il processo di creazione di una linea di zebrafish del reporter di tensione elettrica cellulare per visualizzare lo sviluppo embrionale, il movimento, e cellule di pesce del tumore in vivo.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

La giunzione neuromuscolare larvale di pesce zebra è un modello interessante per lo studio della fisiologia sinaptica. È suscettibile di molte tecniche sperimentali, tra cui l'elettrofisiologia e l'imaging ottico. Qui, descriviamo un protocollo per l'imaging della trasmissione sinaptica utilizzando una sonda basata su pHluorin, sotto un microscopio a epifluorescenza verticale.

Imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato

Scopri un metodo per misurare la crescita del muscolo scheletrico in Danio rerio vivo con alta precisione spaziale e temporale. Questa tecnica aiuta a studiare la regolazione della crescita muscolare e le sue implicazioni per le patologie da atrofia.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica (Video) | JoVE Journal

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Esplora altri video