Name: Sintesi microfluidica di blocchi costitutivi in microgel per scaffold di particelle ricotto microporose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Impara la sintesi microfluidica di microgel monodispersi per scaffold microporosi in medicina rigenerativa. Questo metodo ad alto rendimento garantisce controllo della porosità e migliore integrazione tissutale.

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Gli autori desiderano ringraziare Joe de Rutte e il Di Carlo Lab dell'Università della California, Los Angeles, per la loro assistenza con il design originale del dispositivo microfluidico da cui è stato sviluppato il dispositivo segnalato, nonché la loro guida iniziale nella fabbricazione e risoluzione dei problemi dei dispositivi PDMS. Gli schemi delle figure sono stati creati con Biorender.com.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo protocollo descrive i metodi per sintetizzare e caratterizzare i microgel, che fungono da elementi costitutivi per gli scaffold di particelle ricotto microporose (MAP). Questo protocollo utilizza un approccio microfluidico ad alto rendimento per generare grandi volumi di microgel uniformi, che non possono essere raggiunti con altri metodi come la microfluidica a focalizzazione del flusso 1,4,7,9 (alta monodisperistia, bassa resa), emulsione batch 6,10 e elettrospruzzatura 5,12 (bassa monodispersità, alto rendimento). Con i metodi descritti nel presente documento, i microgel monodispersi possono essere realizzati per l'uso in scaffold MAP che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni di medicina rigenerativa (ad esempio, consegna cellulare, guarigione delle ferite).
Un passaggio critico di questo protocollo è la creazione dei dispositivi microfluidici PDMS. Se i dispositivi non sono realizzati correttamente, ciò potrebbe avere effetti negativi a valle sulla formazione di microgel e sulla monodispersità. È importante prevenire l'introduzione di artefatti (ad esempio, bolle, polvere) nel PDMS prima che si polimerizzi, poiché ciò potrebbe ostruire i canali e influire significativamente sulla formazione di microgel. Per mitigare il più possibile questo problema, è necessario utilizzare del nastro adesivo per rimuovere la polvere, conservare i dispositivi in un contenitore privo di polvere e lavorare in un cappuccio privo di polvere, se possibile. Si consiglia inoltre di conservare i dispositivi a 60 °C per ottenere i migliori risultati con il trattamento superficiale.
Quando si versano i dispositivi PDMS, è importante mantenere uno spessore uniforme che sia circa uguale o inferiore alla lunghezza del punch bioptico. Se il dispositivo è troppo spesso, il pugno della biopsia non sarà in grado di penetrare fino in fondo. È inoltre fondamentale non strappare gli ingressi/uscite del dispositivo PDMS durante la punzonatura con il punzone bioptico e/o l'inserimento del tubo. Uno strappo nel dispositivo PDMS causerà perdite dagli ingressi / uscite, che possono causare la perdita della soluzione precursore del gel. Se c'è una perdita in un dispositivo PDMS, la soluzione migliore è sostituirlo con un nuovo dispositivo il più rapidamente possibile.
Durante il trattamento al plasma del dispositivo, l'uso di ossigeno puro e il trattamento al plasma per 30 secondi hanno prodotto i migliori risultati per l'adesione del PDMS al vetrino. Se il dispositivo non si lega correttamente (ad esempio, il PDMS può ancora essere sollevato dal vetrino dopo il trattamento al plasma), è necessario verificare che il trattamento al plasma funzioni correttamente e che il dispositivo e i vetrini siano stati puliti accuratamente. È anche importante utilizzare il corretto trattamento superficiale silano e, per ottenere i migliori risultati, i dispositivi PDMS devono essere trattati direttamente prima dell'uso. Altri metodi di trattamento superficiale, come la deposizione chimica da vapore, potrebbero anche essere utilizzati.
Un altro passo cruciale è l'uso corretto dei dispositivi microfluidici PDMS per la formazione di microgel. Si consiglia di utilizzare un rapporto di portata di almeno 2:1 (questo protocollo utilizza una portata d'olio di 6 mL/h e una portata acquosa di 3 mL/h), ma questo può essere regolato per ottenere la dimensione desiderata del microgel. Il pH della soluzione precursore del microgel è anche una metrica importante da ottimizzare per prevenire l'intasamento del dispositivo. La soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) accelera la formazione di tiolato nella chimica di addizione di tipo Michael e le concentrazioni di PBS utilizzate in questo protocollo producono i migliori risultati per la gelificazione del microgel nei dispositivi microfluidici. Una volta avviate le pompe a siringa, potrebbero esserci alcune bolle nei canali microfluidici, ma questo dovrebbe equilibrarsi dopo pochi minuti. Si raccomanda di monitorare la formazione di microgel con un microscopio. Se il flusso non sembra simile a quello di questo video e/o ci sono alcuni canali che producono particelle di grandi dimensioni, ciò è probabilmente dovuto a problemi con la fase di trattamento superficiale. La soluzione migliore è sostituire il dispositivo con uno appena trattato in superficie.
Se i microgel sembrano essere in coalescenza, ciò può essere dovuto a una concentrazione insufficiente di FluoroTensioattivo. La soluzione consigliata è quella di aumentare la percentuale in peso del tensioattivo in fase oleosa. Tuttavia, una limitazione all'uso di alte concentrazioni di tensioattivi è che può essere più difficile da rimuovere durante la fase di purificazione. Si consiglia di utilizzare dispositivi microfluidici una sola volta, ma i dispositivi possono essere riutilizzati se lavati con olio Novec immediatamente dopo l'uso per rimuovere qualsiasi soluzione acquosa che potrebbe gelificare nel dispositivo e ostruire i canali. Mentre un dispositivo microfluidico può produrre un volume ad alta produttività di microgel (mL / h), questa velocità di produzione può essere scalata utilizzando più dispositivi microfluidici in parallelo.
La fase di ricottura dell'assemblaggio dello scaffold MAP si basa sull'uso di un fotoiniziatore di polimerizzazione radicalica attivato dalla luce e il fotoiniziatore può essere selezionato in base all'applicazione desiderata. Ad esempio, il fotoiniziatore LAP ha tempi di ricottura rapidi (<30 s) quando si utilizza la luce UV a onde lunghe, che ha un impatto minimo sulla vitalità cellulare in vitro14. Tuttavia, questa lunghezza d'onda è altamente assorbita dal tessuto16 e potrebbe non avere un'elevata efficacia di ricottura in vivo come in vitro.
Eosin Y è un altro fotoiniziatore attivato da lunghezze d'onda visibili (505 nm) e ha una penetrazione più profonda nel tessuto, che migliora la capacità dello scaffold MAP di essere ricotto sotto il tessuto. Tuttavia, i lunghi tempi di esposizione alla luce necessari per la ricottura di Eosin Y possono prolungare l'esposizione cellulare ai radicali liberi e influire sulla vitalità cellulare in vitro14. L'utilizzo di questi metodi per la generazione ad alta produttività di blocchi di microgel altamente uniformi accelererà la ricerca focalizzata sugli scaffold MAP e farà progredire le conoscenze nel campo dei materiali porosi iniettabili per la medicina rigenerativa.

La piattaforma di scaffold MAP è un biomateriale iniettabile composto interamente da microparticelle di idrogel (microgel) che forniscono microporosità su scala cellulare quando reticolate insieme, consentendo la migrazione cellulare indipendente dalla degradazione e l'integrazione di tessuti sfusi1. Grazie alla sua capacità di integrarsi rapidamente con il tessuto ospite e all'immunogenicità intrinsecamente bassa, la piattaforma di scaffold MAP ha dimostrato l'applicabilità preclinica per un'ampia varietà di terapie di medicina rigenerativa 2,3,4,5,6,7,8,9,10, inclusa l'accelerazione della guarigione delle ferite dermiche 1,3 ,11, rivascolarizzando la cavità cerebrale7, fornendo cellule staminali mesenchimali2 e fornendo bulking tissutale per trattare l'insufficienza glottica6. È stato anche dimostrato che la MAP trasmette effetti antinfiammatori al tessuto ospite attraverso il reclutamento di macrofagi M23 e può anche essere sintonizzata per promuovere una risposta immunitaria di "riparazione tissutale" Th28. Queste proprietà favorevoli della piattaforma di scaffold MAP consentono di espanderla a una vasta gamma di applicazioni cliniche.
I metodi precedentemente pubblicati per generare microgel per la formazione di scaffold MAP hanno incluso la microfluidica a goccia di focalizzazione del flusso 1,4,7,9, l'elettrospruzzatura 5,12 e la filatura aerea con emulsione batch 6,10. Il metodo microfluidico a goccia può produrre particelle con elevata monodispersità ma utilizza portate molto lente che producono basse rese di particelle (μL / h). In alternativa, i metodi di elettrospruzzatura e di emulsione batch possono produrre un elevato volume di particelle, ma con elevata polidispersità delle particelle. Questo protocollo utilizza un metodo microfluidico ad alto rendimento per produrre microgel con una popolazione monodispersa, basato sul lavoro di de Rutte et al13. Questo metodo utilizza tecniche di litografia morbida per realizzare un dispositivo microfluidico di polidimetilsilossano (PDMS) da una fotomaschera, che viene poi incollata a un vetrino. Il design del dispositivo si basa sull'emulsificazione a gradini per generare un elevato volume di particelle di microgel (mL/h). La monodispersità che può essere raggiunta con questo metodo fornisce un controllo superiore della porosità rispetto ad altre tecniche, poiché i microgel monodispersi possono formare scaffold con dimensioni dei pori più uniformi2.
I metodi per sintetizzare e caratterizzare i singoli microgel che possono fungere da elementi costitutivi per gli scaffold MAP sono delineati all'interno di questo manoscritto, in particolare in termini di creazione di microgel costituiti da una spina dorsale PEG con un gruppo maleimmide (MAL), che partecipa prontamente all'efficiente aggiunta di tipo Michael con reticolanti funzionalizzati tioli per la gelificazione di microgel. Per disaccoppiare la gelificazione del microgel dalla ricottura dello scaffold MAP, questo manoscritto descrive anche come sintetizzare un macromero di ricotturapersonalizzato pubblicato su 14 , MethMAL, che è un macromero PEG eterofunzionale a 4 bracci metacrilammide / maleimmide. I gruppi funzionali di metacrilammide partecipano prontamente alla fotopolimerizzazione dei radicali liberi (per la ricottura di microgel), pur rimanendo relativamente inerti alle condizioni che promuovono l'aggiunta di tipo Michael per i gruppi funzionali MAL.
Inoltre, questo manoscritto delinea i protocolli per la creazione di dispositivi microfluidici PDMS, la determinazione della cinetica di gelificazione del microgel e la caratterizzazione delle dimensioni del microgel. La parte finale del manoscritto descrive in dettaglio la ricottura dello scaffold MAP, che è quando i microgel vengono trasferiti in situ in un'impalcatura di massa attraverso una fase secondaria di reticolazione avviata dalla foto che lega covalentemente le superfici dei microgel. È importante notare che esistono altri metodi di ricottura che possono essere implementati nei sistemi di scaffold MAP che non si basano su sostanze chimiche basate sulla luce, come la ricottura mediata da enzimi, come descritto in precedenza1. Nel complesso, questi metodi possono essere utilizzati direttamente o utilizzati con diverse sostanze chimiche di formulazione di idrogel (ad esempio, a base di acido ialuronico) per generare scaffold MAP per qualsiasi applicazione.

<table><tbody><tr><td>2-amminoetanetiolo cloridrato</td><td>Acros Organics</td><td>AC153770250</td><td>per sintesi di meta MW: 113,61 Da</td></tr><tr><td>rotore a piastra da 35 mm</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>Geometria per viscosimetro HAAKE</td></tr><tr><td>PEG-Maleimmide a 4 bracci (10 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td><td>Per soluzione precursore microgel</td></tr><tr><td>PEG-Maleimmide a 4 bracci (20 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-200MA</td><td>per la sintesi di MethMal Peso molecolare specifico per ogni lotto</td></tr><tr><td>Siringa BD con punte Luer-Lok</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Siringhe di plastica monouso Punzone</td></tr> per <tr><td>biopsia</td><td>Mitex</td><td>MLTX33-31A-P/25</td><td>diametro 1,5 mm</td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC209561000</td><td>Per la sintesi di MethMal</td></tr><tr><td>Luce LED collimata Fonte</td>: <td>ThorLabs</td><td>M365LP1-C1</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>Piatto di coltura (15 cm)</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM(4-(4,6-dimetossi-1,3,5-triazina-2-il)-4-metil-morfolinium chloride)</td><td>Oakwood Chemical 151882</td><td></td><td>For MethMal Synthesis MW: 276,72 Da</td></tr><tr><td>Fluorosurfactant</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>5 percentuale in peso di 008- Flurostensioattivo nel sistema di</td></tr><tr><td>liofilizzazione HFE7500 FreeZone Triad</td><td>Labconco</td><td>serie 7400000</td><td>per liofilizzatore di sintesi MethMal Vetrini</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Vetrini in vetro liscio, viscosimetro</td></tr><tr><td>HAAKE Rheowin</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>versione 1.8.0_172</td></tr><tr><td>KDS Legato 210 Siringa a due punte Pompa</td><td>Kd Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Driver LED</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>Litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)</td><td>Fotoiniziatore</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td></tr><tr><td>Acido metacrilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>155721</td><td>Per sintesi di MW: 86,09 Da Densità: 1,015g/mL</td></tr><tr><td>Dispositivo microfluidico SU8-Si master wafer</td><td>FlowJem</td><td>N/A</td><td>Su misura, con silanizzazione</td></tr><tr><td>MMP-2 reticolante degradabile</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Sequenza: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2</td></tr><tr><td>Aghi (25 G, smussati)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Lunghezza: 15,88 mm Calibro: 0,5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td>7100025016</td><td>Olio fluorurato</td></tr><tr><td>Ossigeno</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>Tubo in</td></tr><tr><td>Peek compresso</td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>1/32" Diametro esterno; 0,02" Diametro interno; 10' Lunghezza</td></tr><tr><td>PFOCTS (tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Per il trattamento superficiale</td></tr><tr><td>Soluzione salina Fisher con tampone con fosfato</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP3994</td><td>Diluito a 1x in acqua ultrapura, pH = 7,4</td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD peptide adesivo cellulare</td><td>WatsonBio Sciences</td><td></td><td>Sequenza: Ac-RGDSPGGC-NH2</td></tr><tr><td>Rheowin software</td><td>HAAKE&nbsp;</td><td></td><td>Software compatibile con il viscosimetro HAAKE</td></tr><tr><td>Lama per bisturi</td><td>Bard-Parker</td><td>371210</td><td>Dimensioni: #10</td></tr><tr><td>Manico per bisturi</td><td>Bard-Parker</td><td>371030</td><td>Dimensioni: #3</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>Per sintesi di < > MW: 58,44 Kit</td></tr> di <tr><td>elastomeri siliconici Da Sylgard 184</td><td>DOW Chemical</td><td>2065622</td><td>Base e agente indurente</td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4884-100</td><td>per sintesi di MethMal MW: 101,19 Da Densità: 0,73 g/mL</td></tr><tr><td>Tubi Tygon</td><td>Saint Gobain Performance Plastics AAD04103</td><td></td><td>ID: 0,51 mm OD: 1,52 mm</td></tr><tr><td>Spettrometro Varian Inova 500</td><td>Varian</td><td></td><td>NMR Situato nell'impianto di risonanza magnetica biomolecolare UVA</td></tr></tbody></table>

sintesi microfluidica di blocchi costitutivi in microgel per scaffold di particelle ricotto microporose

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

La piattaforma di scaffold a particelle ricotto microporose (MAP) è una sottoclasse di idrogel granulari. È composto da un impasto iniettabile di microgel che può formare un'impalcatura strutturalmente stabile con porosità su scala cellulare in situ seguendo una fase di reticolazione chimica secondaria basata sulla luce (cioè ricottura). Lo scaffold MAP ha dimostrato il successo in una varietà di applicazioni di medicina rigenerativa, tra cui la guarigione delle ferite dermiche, l'aumento delle corde vocali e la somministrazione di cellule staminali. Questo articolo descrive i metodi per la sintesi e la caratterizzazione dei microgel di poli(glicole etilenico) (PEG) come elementi costitutivi per formare un'impalcatura MAP. Questi metodi includono la sintesi di un macromero di ricottura personalizzato (MethMAL), la determinazione della cinetica di gelificazione del precursore del microgel, la fabbricazione di dispositivi microfluidici, la generazione microfluidica di microgel, la purificazione del microgel e la caratterizzazione di base dello scaffold, incluso il dimensionamento del microgel e la ricottura dello scaffold. In particolare, i metodi microfluidici ad alta produttività descritti nel presente documento possono produrre grandi volumi di microgel che possono essere utilizzati per generare scaffold MAP per qualsiasi applicazione desiderata, specialmente nel campo della medicina rigenerativa.

Lo scopo di questo protocollo è quello di delineare tutti i passaggi necessari per sintetizzare i mattoni del microgel da utilizzare in uno scaffold MAP. Il macromero di ricottura MethMAL è altamente selettivo ed efficiente ed è compatibile con più dorsali polimeriche14. È importante che almeno il 67%-75% dei 20 kDa PEG-maleimmide sia modificato con gruppi funzionali di metacrilammide per garantire un'elevata efficienza di ricottura. La variazione percentuale può essere determinata più facilmente analizzando 1 picco spettrale H-NMR, come mostrato in Figura 1. La cinetica di gelificazione, determinata da un viscosimetro, è una metrica importante da considerare per ogni formulazione di gel. Questo protocollo utilizza una soluzione precursore del gel costituita da una spina dorsale PEG con un gruppo MAL, che reagisce efficacemente con reticolanti funzionalizzati al tiolo per la gelificazione del microgel. Tuttavia, molte sostanze chimiche dell'idrogel possono essere utilizzate per fabbricare microgel tramite il metodo microfluidico ad alta produttività descritto nel presente documento. Il tempo di inizio della gelificazione fornirà informazioni sulla durata della generazione di microgel microfluidici. Si raccomanda di scegliere un pH precursore del gel che possa iniziare la gelificazione tra 30 minuti (Figura 2) e 2 ore.
Se il tempo di gelificazione è troppo veloce, la soluzione precursore del gel inizierà a polimerizzare all'interno del dispositivo microfluidico e ostruirà i canali. Inoltre, è importante notare che la variazione delle concentrazioni di ligando tiolato (ad esempio, RGD) può avere impatti sulla formazione della rete durante la gelificazione e potrebbe essere necessario tenere conto regolando la formulazione. Le fasi di fabbricazione del dispositivo microfluidico possono essere noiose, ma i risultati rappresentativi di un dispositivo legato con successo sono mostrati nella Figura 3. Questo protocollo utilizza un dispositivo microfluidico ad alta produttività, parallelizzato, ad emulsificazione a gradini che è stato adattato da un progetto di de Rutte et al.13, e la fabbricazione di wafer di silicio è stata esternalizzata a una società di tecnologia microfluidica. Tuttavia, i passaggi descritti in questo protocollo possono essere utilizzati con qualsiasi design del dispositivo inciso su una fotomaschera di wafer di silicio SU-8. È importante notare che la dimensione del passo dei canali sulla fotomaschera deve essere ottimizzata durante la fabbricazione del dispositivo, poiché avrà un impatto sulla dimensione delle particelle di microgel.
Le portate per la generazione microfluidica di microgel devono essere ottimizzate per ogni formulazione di gel in base a fattori quali il tempo di gelificazione, la dimensione delle particelle desiderata e il design del dispositivo microfluidico. Se si utilizza il dispositivo ad alta produttività, le portate per la fase acquosa possono arrivare fino a 5 ml/h. La figura 4B mostra la configurazione per i dispositivi ad alta produttività utilizzati in questo protocollo. Se il dispositivo funziona correttamente, la formazione di microgel dovrebbe apparire simile a quella mostrata nella Figura 4D. Prima della purificazione, i microgel saranno opachi. Dopo aver completato i vari lavaggi con olio, PBS ed esano, il gel dovrebbe apparire chiaro come l'immagine rappresentativa nella Figura 5. Se si incorpora un fluoroforo nei microgel, il prodotto purificato può avere una leggera tinta colorata ma dovrebbe comunque essere vicino al traslucido. Dopo la purificazione e il gonfiore, i microgel dovrebbero essere di dimensioni molto uniformi e avere un PDI compreso tra 1,00 e 1,05, come mostrato in Figura 6. Vari fotoiniziatori possono essere utilizzati per la fotoricottura degli scaffold MAP. Se si utilizza un'alternativa al LAP, descritta nel presente documento, è necessario determinare la cinetica di ricottura come descritto in precedenza14. Inoltre, varie sorgenti luminose possono essere utilizzate per la fotoricottura, purché la sorgente luminosa corrisponda al fotoiniziatore. Bisogna essere sicuri di calibrare e focalizzare la sorgente luminosa. Potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di ricottura e l'intensità della luce in base alla formulazione del gel e alla concentrazione del fotoiniziatore. Il metodo di ricottura descritto in questo protocollo può essere utilizzato per studi in vitro e in vivo. Dopo la ricottura, i microgel formeranno un'impalcatura porosa che può essere visualizzata con microscopia a due fotoni (Figura 7B-C).

Questo protocollo descrive una serie di metodi per sintetizzare i mattoni del microgel per lo scaffold di particelle ricotto microporoso, che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni di medicina rigenerativa.

Sintesi microfluidica di blocchi costitutivi in microgel per scaffold di particelle ricotto microporose

The microporous annealed particle (MAP) scaffold platform is a subclass of granular hydrogels. It is composed of an injectable slurry of microgels that ...

La fabbricazione ad alta produttività di blocchi costitutivi in microgel monodispersi per scaffold di particelle ricotto microporose fornisce un maggiore controllo della porosità dello scaffold. Ciò può influire sulla dimensione dei pori e sui successivi risultati dell'integrazione tissutale. Questo protocollo utilizza un approccio microfluidico ad alto rendimento per generare grandi volumi di microgel monodispersi che non possono essere raggiunti con altri metodi come la microfluidica a focalizzazione del flusso, l'emulsione batch e l'elettrospruzzatura.I microgel generati possono essere formati in scaffold di particelle ricotto microporose che sono vantaggiosi per le applicazioni di medicina rigenerativa a causa della porosità della scala cellulare che consente una rapida crescita e dei tessuti. Iniziare preparando un vetrino per ogni dispositivo microfluidico PDMS. Utilizzare nastri adesivi, aria filtrata o lavaggi con alcool isopropilico per rimuovere la polvere dal vetrino.Posizionare un vetrino in un dispositivo PDMS affiancato all'altro su un coperchio a piastra a 96 pozzetti e posizionarlo in un detergente al plasma. Chiudere la porta e la valvola del flusso d'aria e accendere la pompa per vuoto. Lascia funzionare per almeno 30 secondi, quindi spegnilo.Collegare il tubo del gas del serbatoio dell'ossigeno alla valvola del flusso d'aria. Lasciare riempire la camera al plasma di ossigeno per 30 secondi, quindi spegnere l'ossigeno e chiudere la valvola del flusso d'aria. Accendere la pompa per vuoto e impostare il livello di radiofrequenza su alto.Attendere che la camera diventi di colore rosa viola e lasciare passare 30 secondi. Quando il timer si spegne, spegnere il plasma e aspirare, quindi aprire lentamente la valvola del flusso d'aria per rilasciare il vuoto. Rimuovere il vassoio dal detergente al plasma.Capovolgere delicatamente il dispositivo PDMS sul vetrino per incollarli. Mentre avviene l'incollaggio, osservare la leggera differenza nella trasparenza del PDMS. Per ottenere i migliori risultati, conservare i dispositivi incollati a 60 gradi Celsius fino a immediatamente prima dell'uso.Preparare il trattamento superficiale diluendo PFOCTS e olio Novec e utilizzare un millilitro per tre o quattro dispositivi. Trasferire il volume in una siringa da un millilitro e inserire un ago da 25 gauge. Tagliare un pezzo di tubo Tygon da 10 a 12 centimetri per dispositivo.Tagliare un pezzo di tubo PEEK lungo circa un pollice. Inserire un paio di millimetri del tubo in PEEK all'estremità del tubo Tygon per evitare che l'ago fori le prese dei tubi Tygon. Estrarre i dispositivi dalla camera riscaldata e inserire l'estremità non PEEK del tubo Tygon nel foro di ingresso acquoso.Inserire l'ago della siringa per il trattamento superficiale nel tubo in PEEK e coprire il foro di uscita della camera dell'olio. Iniettare il trattamento lentamente e assicurarsi che riempia il dispositivo senza bolle. Attendere che le camere acquose si riempiano prima, seguite dai canali più piccoli e poi dalla camera dell'olio.Rimuovere il tubo Tygon dal dispositivo. Una volta riempito il dispositivo, lasciarlo riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. Riempire una siringa da cinque millilitri solo con olio e collegare un ago da 25 gauge.Aspirare il trattamento superficiale dal dispositivo attraverso gli ingressi e l'uscita. Inserire il tubo Tygon nell'ingresso acquoso. Inserire la siringa con olio nel tubo PEEK e lavare ogni dispositivo con olio.Aspirare l'olio dal dispositivo. Ripetere il lavaggio dell'olio due volte e rimuovere il tubo Tygon. Inserire l'estremità non PEEK del tubo Tygon negli ingressi dei dispositivi microfluidici.Inserire il pezzo rimanente del tubo Tygon senza tubo PEEK all'estremità nell'uscita del dispositivo microfluidico. Aggiungere almeno tre millilitri di olio a una siringa di plastica da cinque millilitri e collegarla a un ago da 25 gauge. Inserire con cautela l'ago nel tubo in PEEK su una delle prese Tygon.Lavare delicatamente il tubo e il dispositivo con olio. Raccogliere l'olio dall'uscita in un tubo conico. Ripetere il flusso dell'olio sull'altra entrata di Tygon.Impostare le pompe a siringa sulle portate desiderate. Collegare la siringa contenente il tensioattivo all'ingresso dell'olio tramite un ago da 25 gauge ed erogare delicatamente abbastanza olio per innescare il tubo e il canale dell'olio del dispositivo microfluidico. Una volta installato il dispositivo e le prese dell'olio, aggiungere 0,5 millilitri di olio a una nuova siringa da cinque millilitri che conterrà il precursore del gel.Utilizzare questa piccola quantità di olio per aiutare a lavare la soluzione precursore attraverso il dispositivo microfluidico. In un tubo conico, combinare 1,5 millilitri della soluzione dorsale PEG e 1,5 millilitri della soluzione reticolante. Vortice per 30 secondi e trasferire rapidamente la soluzione combinata di precursori del gel alla siringa da cinque millilitri.Collegare la siringa con la soluzione di precursore del gel all'ingresso acquoso tramite un ago da 25 gauge. Erogare delicatamente una soluzione sufficiente per innescare il tubo e il canale acquoso. Bloccare le siringhe sulle pompe a siringa e premere il funzionamento.Cerca particelle di dimensioni uniformi dai canali. Raccogliere i microgel dalla presa in un tubo conico. Una volta completata la gelificazione, utilizzare una pipetta per rimuovere con attenzione la fase dell'olio dal fondo del tubo.Depositarlo in un contenitore appropriato per i rifiuti fluorurati. Aggiungere altro olio nel tubo di raccolta del microgel. Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo di raccolta.Lasciare riposare il tubo di raccolta per cinque minuti per consentire alle fasi di separarsi. Cerca la fase oleosa in basso e la fase microgel acquosa in alto. Ripetere i lavaggi dell'olio almeno due volte di più.Aggiungere più olio con il gel come dimostrato in precedenza, quindi aggiungere PBS al gel. Capovolgere per mescolare più volte. Per separare gli strati, centrifugare il tubo a 2.000 RCF per circa 30 secondi.Cerca la fase dell'olio nella parte inferiore del tubo, il gel al centro e il PBS in alto. Rimuovere la fase dell'olio con una pipetta e gettarla in un contenitore per i rifiuti. Ripetere l'olio e i lavaggi PBS due volte.Cerca che il gel passi da opaco a trasparente entro il lavaggio finale. Rimuovere tutto l'olio. Non rimuovere PBS dal tubo conico.In una cappa aspirante chimica, utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere esano al tubo con un volume uguale al PBS. Vortice il tubo conico per 30 secondi o fino a quando non viene miscelato accuratamente. Centrifugare a 4.696 RCF per cinque minuti.Dopo la separazione, cercare esani nello strato superiore, PBS nel mezzo e gel nella parte inferiore. Rimuovere lo strato di esano e gettarlo in un contenitore per rifiuti organici. Aspirare il PBS.Ripetere l'esano nei lavaggi PBS almeno due volte o fino a quando il gel appare quasi traslucido. Lavare nuovamente il gel con PBS per rimuovere eventuali residui di esano. Centrifugare a 4.696 RCF per cinque minuti e aspirare lo strato PBS.Circa il 67-75% dei 20 kilodalton PEG maleimmide è stato modificato con gruppi funzionali di metacrilammide per garantire un'elevata efficienza di ricottura. La modifica percentuale è stata determinata analizzando i picchi spettrali NMR 1H. L'inizio della gelificazione ha fornito informazioni sulla durata della generazione di microgel microfluidici.Si consiglia di scegliere il pH precursore del gel che può iniziare la gelificazione tra 30 minuti e due ore. Dopo la purificazione e il gonfiore, i microgel avevano una dimensione uniforme e un indice di polidispersità tra 1,00 e 1,02 definito come popolazione monodispersa. Dopo la ricottura, i microgel hanno formato un'impalcatura porosa visualizzata con microscopia a due fotoni.L'incollaggio corretto del dispositivo PDMS al vetrino e il corretto trattamento superficiale del dispositivo sono fondamentali per le migliori prestazioni del dispositivo microfluidico. Questa tecnica consente una rapida produzione di blocchi di microgel uniformi per formare scaffold cartografici che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni rigenerative in vivo, compresa la guarigione delle ferite.

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