Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

I nostri protocolli aiutano a creare topi geneticamente modificati che richiedono esperimenti avanzati in vivo sui topi, come la visualizzazione dell'espressione genica, l'umanizzazione genetica e il knockout condizionale del gene. La tecnica di editing del genoma dello zigote di topo qui presentata consente un'induzione altamente efficiente, rapida e semplice di modificazioni genetiche avanzate, come il knock-in e il flox della cassetta genica. Poiché i topi geneticamente modificati sono utilizzati in diversi campi di ricerca come neurologia, immunologia, metabolismo, riproduzione e malattie infettive, la nostra tecnologia qui presentata supporta fondamentalmente questo ampio campo di ricerca.

A dimostrare la procedura saranno Natsumi Iki, Miyuki Ishida e Yoko Tanimoto, staff tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, preparare due piastre di Petri da 35 millimetri per la coltura dello zigote e metterle nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino all'uso. Raccogliere gli ovidotti e metterli in una goccia da 20 microlitri di terreno M2 contenente 0,75 milligrammi per millilitro di ialuronidasi sul coperchio della capsula di Petri.

Utilizzare una pinza a punta fine per raccogliere un ovidotto e perfondere circa 50 microlitri di terreno M2 con ialuronidasi attraverso le fimbrie. Dopo 30 secondi, usando un capillare di vetro, prelevare zigoti morfologicamente normali con una piccola quantità di terreno e lavarli trasferendoli in goccioline medie M16 fresche. Quindi, raggruppare gli zigoti lavati in una capsula di Petri e ripetere il processo fino a quando tutti gli zigoti non vengono recuperati.

Utilizzando l'estrattore di pipette programmabile, tirare alcune pipette di vetro. Rompere la punta dell'ago di microiniezione colpendo la sfera di vetro attaccata alla punta della microforgiatura. Controllare la dimensione della punta al microscopio con un ingrandimento di 1.000x e assicurarsi che la dimensione della punta dell'ago per microiniezione abbia un diametro di circa un micrometro.

Utilizzare una microforgia per piegare l'ago di microiniezione a circa due o tre millimetri dalla punta. Iniettare da 1 a 1,5 centimetri del liquido operativo al centro dell'ago per microiniezione e collegarlo al supporto del microiniettore manuale con l'attuatore piezoelettrico. Quindi, collegare l'ago di tenuta al supporto del microiniettore manuale opposto e spostare il liquido operativo sulla punta dell'ago di microiniezione con pressione graduale.

Fissare i supporti del microiniettore manuale sul micromanipolatore. Preparare una camera di iniezione con tre goccioline. In primo luogo, con 10 microlitri di terreno M2, in secondo luogo, con cinque microlitri di polivinilpirrolidone al 12% in mezzo M2 e in terzo luogo, con cinque microlitri di miscela di crRNA, tracrRNA, proteina Cas9 e la soluzione di DNA del donatore.

Coprire le goccioline con olio minerale e posizionare la camera di iniezione sullo stadio del microscopio invertito. Sotto il microscopio invertito con un ingrandimento di 50x, abbassare la pipetta di microiniezione nella goccia PVP del 12%. Aspirare ed erogare il 12% di PVP per pulire l'interno della punta dell'ago di microiniezione e trasferirlo alla goccia RNPD.

Mettere il microiniettore manuale a pressione negativa. Aspirare la soluzione di RNPD nell'ago di microiniezione e attendere fino a quando non viene aspirato un volume sufficiente. Con un ingrandimento 50x, riempire l'intero interno dell'ago per microiniezione con liquido.

Quindi, interrompere l'assunzione e consentire l'espulsione graduale della soluzione RNPD impostando il microiniettore manuale a pressione positiva. Spostare la punta dell'ago di microiniezione nell'olio. Inserire 50 zigoti nella goccia M2 e abbassare delicatamente la pipetta di tenuta nella stessa goccia.

Trasferire l'ago per microiniezione alla goccia M2 contenente zigoti. Passare a un obiettivo 20x e concentrarsi sulla punta della pipetta di microiniezione. Dopo aver tenuto uno zigote, concentrarsi sul pronucleo spostando il micromanipolatore.

Inserire l'ago per microiniezione nello zigote e avvicinare la punta al pronucleo. Una volta che la punta raggiunge la membrana del pronucleo, applicare l'impulso piezoelettrico per perforare. Quando l'ago per microiniezione perfora il pronucleo, iniettare la soluzione di RNPD e osservare il gonfiore del pronucleo.

Una volta che il pronucleo è completamente gonfiato, estrarre rapidamente l'ago ed eseguire la stessa procedura su entrambi i pronuclei femminili e maschili. Differenziare gli zigoti prima e dopo l'iniezione spostando lo zigote iniettato in un'altra posizione all'interno della goccia M2 e continuare a iniettare tutti gli zigoti presenti nella goccia M2. Dopo l'iniezione, trasferire gli zigoti in un piatto M16 fresco.

Selezionare gli zigoti sopravvissuti 10 minuti dopo l'iniezione. Rimuovere gli zigoti lisati danneggiati dall'iniezione e distribuire gli zigoti sopravvissuti a ciascuna goccia nel piatto M16. Posizionare una piccola quantità di terreno di coltura, alcune bolle d'aria come marcatore e gli zigoti in una pipetta per il trasferimento.

Utilizzando una micro cesoia, praticare un'incisione tra l'ampolla e le fimbrie dell'ovidotto. Introdurre gli zigoti nell'incisione e contemporaneamente confermare che la bolla d'aria è stata introdotta. L'efficienza mediana di produzione di 13 topi knock-in con cassetta genica indipendente è stata del 20,8% con un massimo del 39,5% e un minimo del 7,9% Il tasso di natalità mediano in questa condizione di targeting genico non letale è stato del 34,0% con un massimo del 43,3% e un minimo del 15,9% L'efficienza di produzione mediana dei 10 topi floxed indipendenti è stata del 7,7% con un massimo del 20,7% e un minimo del 2,1% Sebbene le funzioni di diversi geni bersaglio fossero sconosciuto, il tasso di natalità mediano è stato del 30,2% con un massimo del 43,8% e un minimo del 17,3% Il diametro della punta dell'ago per iniezione non deve essere troppo sottile e la pressione dell'iniettore manuale deve essere regolata per garantire che la soluzione nell'ago venga iniettata e che il pronucleo venga lentamente gonfiato.