Name: Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Scopri la tecnica CRISPR-Cas9 per modifiche precise nel gene ZKCNH6A di Danio rerio. Questo metodo consente di modellare varianti associate alla sindrome del QT lungo e valutare fenotipi cardiaci in vivo.

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Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research Project (T.W.C.) e dalle sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery (T.W.C.).

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

L'ingegneria di precisi edit genetici utilizzando CRISPR-Cas9 è messa in discussione dalle basse efficienze dei meccanismi HDR e dal loro rilevamento efficiente. Qui, viene descritto un approccio di sostituzione dell'esone a due sgRNA basato su CRISPR-Cas9 che produce modifiche precise nel pesce zebra con rilevamento visivo diretto di modifiche positive. L'efficacia di questo approccio è dimostrata generando modifiche precise nel gene zkcnh6a . Questo articolo mostra come la funzione cardiaca nelle larve di zebr...

Le strategie di editing genetico basate su CRISPR in modelli animali consentono lo studio di malattie, sviluppo e tossicologia geneticamente ereditabili a livello dell'intero organismo 1,2,3. I pesci zebra forniscono un modello potente che è più vicino in numerosi aspetti fisiologici agli esseri umani rispetto ai modelli cellulari murini o derivati dall'uomo4. Una vasta gamma di strumenti e strategie genetiche sono stati utilizzati nel pesce zebra sia per lo screening genetico in avanti5 che per lo screening genetico inverso6. La mappatura genetica completa e l'annotazione nel pesce zebra hanno facilitato gli approcci di modifica genetica come tecnica primaria per progettare knockout genici mirati (KO) e knock-in precisi (KI)7.
Nonostante ciò, la generazione di modifiche KI precise nel pesce zebra è limitata dalle basse efficienze e dalla difficoltà di un rilevamento accurato. Sebbene le nucleasi effettrici simili al fattore di trascrizione (TALEN) siano state utilizzate con successo e ottimizzate per i KI8, CRISPR fornisce una migliore strategia di modifica genetica con un targeting più semplice degli sgRNA. Numerosi studi hanno utilizzato CRISPR per generare KI precisi nel pesce zebra 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, sebbene queste modifiche generate attraverso la riparazione diretta dall'omologia mediata da CRISPR (HDR) tendano ad essere inefficienti con un basso successo intrinseco Tassi che richiedono la genotipizzazione come schermo primario 9,10,14,21. Ciò dimostra la necessità di un efficiente sistema KI CRISPR nel pesce zebra, nonché di un sistema affidabile ad alto rendimento per rilevare modifiche precise.
L'obiettivo di questo studio era quello di descrivere una piattaforma per generare un preciso gene cardiaco KI nei cuori di zebrafish con un rilevamento semplice e ad alto rendimento delle modifiche riuscite. Viene descritto un approccio di sostituzione dell'esone a due sgRNA basato su CRISPR-Cas9, basato su un approccio TALEN8. Questo approccio prevede l'escissione della sequenza bersaglio utilizzando due guide di sgRNA e la sostituzione con una sequenza modello esogena che contiene il KI di interesse e un gene reporter intronico geneticamente codificato (Figura 1). L'integrazione di un reporter fluorescente geneticamente codificato all'interno della sequenza intronica del gene bersaglio consente l'individuazione efficiente di modifiche positive. Viene quindi descritta una piattaforma di fenotipizzazione per valutare la funzione elettrica cardiaca nelle larve di zebrafish per la caratterizzazione non invasiva delle varianti genetiche associate alla LQTS ereditaria, una malattia elettrica cardiaca che predispone gli individui alla morte cardiaca improvvisa.
Questi approcci miglioreranno l'accesso e l'uso delle modifiche del gene KI del pesce zebra per modellare le malattie ereditarie e affrontare questioni biologiche e fisiologiche, come la mappatura dei modelli di espressione genica e la regolazione dello sviluppo. Poiché i cuori di zebrafish sono più simili alle caratteristiche elettrofisiologiche cardiache umane rispetto ai modelli murini, possono essere particolarmente interessanti come sistema geneticamente trattabile per la modellazione di malattie cardiache 7,22,23.

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Infrastructure</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>Istituto</td><td></td><td></td>europeo di bioinformatica</tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>Open Source (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 25 mm</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 Telecamera</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5415C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel EZNA Kit di trascrizione</td><td>Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7</td><td>Incubatore Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000</td> Kit di minipreparazione <td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage Kit di trascrizione mMachine T7 Ultra</td><td>Spettrofotometro</td> Invitrogen <td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000</td><td>Kit</td> di purificazione Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A Picoinjector</td><td>Apparecchio Harvard PowerPac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore di base</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Steroscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini Sub Cell GT Sistema di elettroforesi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec Zebrafish Housing Sistema</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sintesi genica</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequenziamento</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&beta; Cellule competenti</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PCR Buffer</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Miscela di nucleotidi</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI Endonucleasi con tampone</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI Endonucleasi con tampone</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 Plasmide (XL1 Blue bacterial agar stab)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI Endonucleasi con tampone</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII Endonucleasi con tampone</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 Plasmide (XL1 Blu pugnalata di agar batterica)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaina)</td><td>Plasmide Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 (DH5&alfa; pugnalata di agar batterico)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI Endonucleasi con tampone</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalI Endonucleasi con tampone</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligasi con tampone</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimerasi</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE Tampone</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris cloridrato</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI Endonucleasi con tampone</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RICETTE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td>Fornitore</td> di <td>componenti</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di ricottura (pH 7,5-8,0)</td><td>10 mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 Media (pH 7,2)</td><td>5 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,17 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM MgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>tampone per iniezione (pH 7,5)</td><td>20 mM HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

modifiche precise mediate da crispr-cas9 nei cuori di zebrafish

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) in modelli animali consentono una precisa manipolazione genetica per lo studio dei fenomeni fisiologici. I pesci zebra sono stati utilizzati come modello genetico efficace per studiare numerose domande relative alla malattia ereditaria, allo sviluppo e alla tossicologia a livello di intero organo e organismo. Grazie al genoma del pesce zebra ben annotato e mappato, sono stati sviluppati numerosi strumenti per l'editing genetico. Tuttavia, l'efficacia della generazione e la facilità di rilevare modifiche precise utilizzando CRISPR è un fattore limitante. Qui è descritto un approccio knock-in basato su CRISPR-Cas9 con la semplice rilevazione di modifiche precise in un gene responsabile della ripolarizzazione cardiaca e associato al disturbo elettrico, la sindrome del QT lungo (LQTS). Questo approccio a due RNA a guida singola (sgRNA) asporta e sostituisce la sequenza bersaglio e collega un gene reporter geneticamente codificato. L'utilità di questo approccio è dimostrata descrivendo misure fenotipiche non invasive della funzione elettrica cardiaca in larve di zebrafish wild-type e geneticamente modificate. Questo approccio consente lo studio efficiente delle varianti associate alla malattia in un intero organismo. Inoltre, questa strategia offre possibilità per l'inserimento di sequenze esogene di scelta, come geni reporter, ortologhi o editor di geni.

L'uso di successo di questo approccio CRISPR di sostituzione dell'esone a due sgRNA è evidenziato dall'introduzione e dalla semplice rilevazione di una modifica precisa per ingegnerizzare la variante associata a LQTS, R56Q, nel gene zkcnh6a nel pesce zebra. La Figura 6 mostra una larva rappresentativa di 3 dpf iniettate allo stadio embrionale unicellulare con componenti CRISPR come descritto sopra. La Figura 6A mostra la presenza dell'espressione genica...

Questo protocollo descrive un approccio per facilitare modifiche precise knock-in negli embrioni di zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Viene presentata una pipeline di fenotipizzazione per dimostrare l'applicabilità di queste tecniche per modellare una variante genetica associata alla sindrome del QT lungo.

Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

Il nostro protocollo fornisce una pipeline sia per l'integrazione precisa che per il semplice rilevamento visivo delle modifiche CRISPR, nonché un esempio di fenotipizzazione post-edit. Il vantaggio principale di questo approccio è la facilità di rilevamento delle modifiche CRISPR, che consente un'identificazione efficiente e semplificata delle modifiche riuscite. Questo approccio consente una semplice generazione e caratterizzazione delle varianti associate alla malattia nel pesce zebra.Qui, stiamo esaminando la sindrome del QT lungo. Gli studi di follow-up sulle terapie farmaceutiche sono quindi possibili da esplorare. Inizia progettando due guide sgRNA per asportare la sequenza del sito bersaglio knock-in identificando l'ortologo zebrafish per il gene di interesse.Utilizzare Ensembl per individuare il sito target all'interno della sequenza genica di interesse, inclusa la sequenza di fiancheggiamento di due kilobasi utilizzata per creare il modello. Utilizzare uno strumento software di progettazione come CRISPOR e selezionare le specie di Danio rerio e l'enzima Cas. Per l'approccio a due sgRNA, scegliere uno sgRNA prima dell'esone bersaglio e un secondo sgRNA all'interno dell'introne immediatamente a valle.Assicurarsi che gli sgRNA selezionati abbiano un'elevata specificità e un basso legame off-target previsto. Utilizza le classifiche CRISPOR per identificare le guide con un'associazione off-target minima. Ora identifica i potenziali siti off-target più probabili per la genotipizzazione del sequenziamento Sanger basata su PCR.Dopo aver selezionato i due sgRNA, ottenere il complemento inverso per ciascuno, due oligo complementari che precedono la mutazione e due oligo complementari a valle della mutazione. Aggiungi siti di restrizione compatibili su ciascun oligo per incorporare la guida nel plasmide di scelta. Per l'integrazione delle sequenze guida selezionate nel plasmide DR274, creare una sporgenza utilizzando un sito di restrizione BSA1 a cinque primi e progettare i siti di riconoscimento BSA1 alle cinque estremità prime delle guide.Successivamente, progettare il modello esogeno per l'HDR nel pesce zebra scegliendo due frammenti di sequenza che affiancheranno il gene reporter YFP venoso M ospitato nel plasmide PKHR5. Dividere il modello in due segmenti per inserirlo su entrambi i lati del gene reporter YFP venoso M. Assicurati che il sito diviso sia in un introne per evitare di tagliare la sequenza di codifica.Incorporare tutte le modifiche richieste menzionate nel manoscritto per facilitare la clonazione nel plasmide PKHR5. Iniettare gli embrioni nella fase unicellulare a circa 40 minuti dopo la fecondazione. Dopo tre giorni di fecondazione, anestetizzare la larva di zebrafish trasferendola in una capsula di Petri da 25 millimetri contenente lo 0,3% di MS222 fino a quando non perdono il riflesso autoraddrizzante.Una volta anestetizzata, trasferire la larva nel pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Utilizzando un microscopio in grado di rilevare GFP o YFP, eseguire lo screening per la fluorescenza genica reporter negli occhi della larva. Dopo aver catturato le immagini della larva, documentare la presenza o l'assenza dell'espressione genica del reporter.Per confermare l'editing genetico HDR accurato e preciso, eseguire la genotipizzazione anestetizzando prima la larva tre giorni dopo la fecondazione come dimostrato in precedenza e isolando il DNA genomico dalla clip della coda utilizzando il metodo hotshot. Aggiungere la clip di coda asportata a 15 microlitri di idrossido di sodio 25 millimolare e incubarlo a 95 gradi Celsius per 20 minuti, quindi neutralizzare con 1,5 microlitri di acido cloridrico tris. Centrifugare a 13.800 volte G per 30 secondi e conservare il surnatante contenente il DNA genomico estratto.Recuperare la larva nei media E3 e restituirla al sistema di alloggiamento se sono previsti ulteriori studi. Utilizzando il DNA genomico estratto come modello, eseguire il sequenziamento Sanger basato sulla PCR di siti on-target e potenziali off-target. Assicurarsi che il disegno del primer on-target catturi il sito di mutazione e il sito di legame dell'sgRNA più vicino.Progettare un primer di sequenziamento separato per rilevare la transizione dal braccio di omologia inserito e dal gene bersaglio per confermare l'integrazione nel gene di interesse. Progetta primer per sequenziare i primi tre potenziali siti off-target. Compilare genotipizzazione on e off-target, frequenza cardiaca, dimensioni pericardiche, fenotipizzazione ECG e dati genetici reporter identificabili per ciascun pesce zebra.L'espressione genica del reporter venoso YFP M è stata osservata nelle isole, agendo come un reporter positivo dell'integrazione del modello di successo. I pesci positivi al gene reporter sono risultati avere la modifica precisa G2A che introduce la variante R56Q in ZKCNH6A. Qui viene mostrata la misurazione delle dimensioni pericardiche come rapporto della zona degli occhi.Una tendenza di bradicardia con aumento dell'edema pericardico associato ai disturbi della ripolarizzazione cardiaca nei pesci zebra è stata osservata nelle larve modificate dal gene R56Q. La registrazione ECG da un cuore di larva di zebrafish tre giorni dopo la fecondazione è mostrata qui. L'aspetto più importante di questo approccio è la progettazione delle guide, come spesso accade nelle procedure CRISPR.Guide efficaci sono essenziali per modifiche CRISPR di successo. È possibile seguire metodi CRISPR alternativi che consentono una maggiore precisione o altre funzionalità. Inoltre, possono essere inseriti geni di grandi dimensioni come un complesso di editing primario che fornisce un sistema di editing inducibile in vivo.

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Manipolazioni transgeniche e la modifica del genoma sono fondamentali per il collaudo funzionale i ruoli dei geni ed elementi -regulatory cis. Ecco una dettagliata protocollo microiniezione per la generazione di modifiche genomiche (compresi costrutti Tol2-mediate fluorescenti giornalista transgene, Talens, e CRISPRs) è presentato per il pesce modello emergente, il Spinarello.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

Un protocollo di microiniezione semplice ed efficiente per l'editing di gene in embrioni di pesce gatto della manica usando il sistema CRISPR/Cas9 è presentato. In questo protocollo, guida RNA e proteina Cas9 erano microiniettati in tuorlo di embrioni di topo. Questo protocollo è stato convalidato battendo fuori due geni immuno-correlati di pesce gatto della manica.

Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

L'editing genomico mirato nel sistema modello Danio rerio (pesce zebra) notevolmente è stata facilitata dall'emergere di approcci basati su CRISPR. Qui, descriviamo un protocollo semplificato, robusto per la generazione e l'identificazione degli alleli di assurdità CRISPR-derivato che incorpora l'analisi di mobilità dell'eteroduplex e identificazione delle mutazioni mediante sequenziamento di nuova generazione.

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l'indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F0 indotte da Cas9.

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l'editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Lo sviluppo precoce dipende dai prodotti ereditari materni e il ruolo di molti di questi prodotti è attualmente sconosciuto. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza CRISPR-Cas9 per identificare i fenotipi di effetti materni in una singola generazione.

Determinare il ruolo dei geni espressi per via materna nello sviluppo precoce con i crispanti materni

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

Questo protocollo descrive come eseguire un efficiente editing della base adenina senza limitazioni PAM per costruire un modello preciso di malattia del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e.

Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e

Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di mutanti materni che accoppia una linea di knock-in stabile zpc:cas9 con la consegna mediata da Tol2 di cassette di espressione di sgRNA.

Generazione di mutanti materni utilizzando zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

Scopri la tecnica CRISPR-Cas9 per modifiche precise nel gene ZKCNH6A di Danio rerio. Questo metodo consente di modellare varianti associate alla sindrome del QT lungo e valutare fenotipi cardiaci in vivo.

Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish

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