Name: Modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione interna di cellule tumorali nellarteria carotide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri come creare un modello murino riproducibile di metastasi cerebrali mediante iniezione intracarotidea di cellule tumorali. Questo metodo consente tumori intracranici consistenti con metastasi sistemiche minime, facilitando lo studio di interventi terapeutici.

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Questa ricerca è stata finanziata dall'Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC), numero di sovvenzione APP1162560. ML è stato finanziato da una borsa di studio di ricerca post-laurea UQ. Vorremmo ringraziare tutti coloro che hanno contribuito con la zootecnia e l'imaging in vivo degli animali. Ringraziamo il Royal Brisbane and Women's Hospital per aver donato aliquote di zirconio per questo studio.

Tutti gli studi sono stati condotti all'interno delle linee guida del Comitato etico animale dell'Università del Queensland (UQCCR / 186 / 19) e del Codice australiano per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici.
1. Preparazione di cellule tumorali per iniezione
NOTA: In questo studio, è stata utilizzata la linea cellulare di cancro al seno umano, BT-474 (BT474). BT474 è stato coltivato in un terreno di coltura completo comprendente RPMI 1640 terreno integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di insulina. Le celle sono state mantenute in un incubatore a 37 ° C con il 5% di anidride carbonica nell'atmosfera dell'aria. Autenticare la linea cellulare tramite tandem satellitare ripete il test35, confermare l'espressione della proteina reporter (ad esempio, luciferasi) se presente, e verificare l'infezione da micoplasma.
<ol><li>Seminare cellule tumorali BT474 ad una densità di semina di 2,0 x 106 cellule in un matraccio T75 utilizzando 10 ml di terreno di coltura e coltura di crescita completi (a 37 °C con 5% di CO2) fino al 70%-80% di confluenza prima dell'iniezione.</li>
	<li>Il giorno dell'iniezione, scartare i terreni di crescita e lavare il monostrato cellulare con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) due volte.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di reagente di dissociazione per colture cellulari preriscaldato (vedere Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 5 minuti o fino a quando le cellule non si sono staccate. Dopo 5 minuti, picchiettare delicatamente il pallone per favorire il distacco della cellula.</li>
	<li>Aggiungere 5 ml di terreno di coltura completo contenente il 10% di siero fetale bovino per estinguere l'attività del reagente di dissociazione.</li>
	<li>Risospendere delicatamente le cellule mediante pipettaggio per ridurre i grumi cellulari.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL e centrifugare a 180 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza calcio e magnesio per ridurre al minimo l'aggregazione cellulare.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 180 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Decantare il surnatante per rimuovere il siero residuo/reagente di dissociazione e risospendere il pellet cellulare in 3 mL di HBSS.</li>
	<li>Posizionare un filtro cellulare da 100 μm su un tubo conico fresco da 50 mL e passare la sospensione cellulare per rimuovere i grumi cellulari. NOTA: Una sospensione a singola cellula è essenziale per ridurre al minimo l'occlusione dei vasi sanguigni e il rischio di ictus durante l'iniezione.</li>
	<li>Calcola il numero di cellule vitali utilizzando l'esclusione di Trypan Blue e un emocitometro con metodi standard.</li>
	<li>Diluire la sospensione cellulare con HBSS ad una concentrazione cellulare di 2,5 x 106 cellule/ml.</li>
	<li>Tenere il tubo orizzontale sul ghiaccio e scuotere delicatamente il tubo periodicamente per ridurre al minimo l'aggregazione. La sospensione cellulare può essere conservata su ghiaccio per un massimo di 6 ore. NOTA: il dondolio è stato fatto manualmente, ma questo può anche essere fatto usando uno shaker a basso numero di giri.</li>
</ol>2. Preparazione del mouse per la procedura
NOTA: In questo studio, sono stati utilizzati topi scid NOD di 4-5 settimane. Introdurre alimenti di recupero a dieta morbida (ad esempio, gel dietetico, idrogel, purè di topo) ai topi 3 giorni prima della procedura per incoraggiare l'alimentazione dopo la procedura.
<ol><li>Strumenti chirurgici per autoclave. Spruzzare e pulire l'area chirurgica e l'apparecchiatura con disinfettante per superfici, seguito da etanolo al 70%.</li>
	<li>Posizionare un tappetino termico animale sotto la scheda chirurgica per prevenire l'ipotermia. Accendere questo 30 minuti prima dell'intervento chirurgico. Spruzzare e pulire la tavola chirurgica con disinfettante per superfici seguito da etanolo al 70%.</li>
	<li>Preparare una gabbia pulita per gli animali e una piastra riscaldante calda per il recupero.</li>
	<li>Indossare dispositivi di protezione individuale puliti (camice, maschera, retina per capelli e guanti). Mantenere la sterilità durante tutta la procedura utilizzando guanti da esame puliti e una tecnica "solo suggerimenti per strumenti".</li>
	<li>Anestetizzare il mouse con una camera anestetica utilizzando isoflurano al 5% con un flusso di ossigeno di 2 L/min fino a quando il mouse perde il riflesso del pedale.</li>
	<li>Estrarre l'animale dalla camera e metterlo in un cono nasale che eroga isoflurano al 2% con un flusso di ossigeno di 2 L/min per la procedura chirurgica rimanente.</li>
	<li>Mouse con pugno all'orecchio per l'identificazione e utilizzare tagliacapelli elettrici per radere la pelliccia dalla regione del collo. Pulire i peli in eccesso dalla pelle esposta usando del nastro adesivo.</li>
	<li>Pesare il mouse per calcolare le dosi di farmaci anestetici e analgesici richiesti. Somministrare buprenorfina e meloxicam rispettivamente a 50 μg/kg e 1 mg/kg tramite iniezione sottocutanea.</li>
	<li>Trasferire il mouse su una tavola chirurgica calda e fissare il cono del naso con del nastro adesivo.</li>
	<li>Applicare lubrificante oculare sugli occhi per prevenire l'essiccazione.</li>
	<li>Fissare delicatamente il mouse agganciando prima i denti incisivi superiori usando un filo fissato alla scheda chirurgica, quindi nastrando le zampe anteriori e posteriori. Questo passaggio estende il corpo e mantiene il collo dritto durante la procedura.</li>
	<li>Eseguire la preparazione preoperatoria della pelle come descritto di seguito.<ol><li>Pulire il collo con antisettico topico (povidone-iodio) per ridurre il carico della microflora cutanea e rimuovere i peli sciolti. Pulire dal centro della pelle, lavorando verso l'esterno per prevenire la ricontaminazione del sito di incisione. Ripetere il processo utilizzando etanolo al 70%. Eseguire tre cicli alternati di iodio ed etanolo per la disinfezione.</li>
		<li>Posare un drappo chirurgico sull'animale. Questo è tagliato e modellato da un pezzo di carta assorbente sterile o sacchetto per autoclave.</li>
	</ol></li>
	<li>Stendere asciugamani di carta sterili o sacchetti per autoclave per strumenti chirurgici.</li>
	<li>Verificare la presenza di riflessi tramite "Pinch test" per garantire un'anestesia sufficiente prima di continuare con la procedura.</li>
</ol>3. Iniezione carotidea interna
NOTA: In questo esperimento, è stata utilizzata una cannula per infusione da 31 G e una configurazione del driver della siringa attivata dal piede per facilitare la procedura di iniezione (Figura supplementare 1). Questa configurazione è facoltativa e l'utente può utilizzare una siringa da insulina da 31 G e saltare i passaggi 3.11 e 3.12. Per preparare la cannula per infusione, tirare e separare la porzione dell'ago dalla porzione di montaggio della siringa di un ago da 31 G usando due paia di morsetti di sutura. Quindi, attaccare la porzione di ago a un'estremità di un tubo per infusione fine di circa 10 cm di lunghezza.
<ol><li>Posizionare il microscopio da dissezione sul mouse.</li>
	<li>Usando le forbici, praticare un'incisione verticale di 15 mm lungo la linea mediana nella regione del collo partendo da 5 mm sotto la mascella fino all'ingresso toracico.</li>
	<li>Utilizzando due paia di pinze angolate, separare la pelle e le ghiandole salivari sottostanti e applicare divaricatori per mantenere esposta la trachea. Il prossimo passo esporrà la guaina carotidea che si trova parallela alla trachea.</li>
	<li>Utilizzando due paia di pinze ad angolo sottile, sezionare senza mezzi termini il muscolo e il tessuto adiposo adiacente alla trachea per esporre la guaina carotide destra. La guaina carotidea è lo strato fibroso che copre l'arteria carotide comune, la vena e il nervo vago, e questo fascio può essere visualizzato dall'arteria carotide comune rosso vivo. In questo studio, l'iniezione è stata eseguita sull'arteria carotide destra.</li>
	<li>Cancellare un segmento dell'arteria carotide comune caudale alla biforcazione carotidea della fascia circostante e separarlo dal nervo vago e dalle vene.</li>
	<li>Isolare e cancellare la biforcazione carotidea (la giunzione che unisce le arterie carotidi esterne e interne) dai nervi e dalla fascia circostanti. Posizionare una pinza fine sotto l'arteria carotide esterna e passare una sutura di seta (spessore 5-0) sotto l'arteria. Annodare e stringere la sutura e tagliare la linea in eccesso. NOTA: Questa legatura (L1) impedirà all'iniezione di transitare attraverso l'arteria carotide esterna.</li>
	<li>Posizionare una pinza fine sotto l'arteria carotide comune e passare una sutura di seta (spessore 5-0) sotto l'arteria. Legare un nodo e stringere la sutura in una posizione prossimale al sito di iniezione proposto. Tagliare la sutura in eccesso lasciando circa 10 mm di linea. NOTA: Questa seconda legatura (L2) limiterà il flusso sanguigno e il sanguinamento dopo l'iniezione. Viene anche usato per posizionare e trattenere l'arteria carotide durante l'iniezione.</li>
	<li>Tagliare e inumidire una striscia di tergicristalli monouso (autoclavati) (vedi Tabella dei materiali) di circa 10 mm x 5 mm. Piegare la striscia in 4 mm x 5 mm, 2-3 mm di spessore, e posizionarla sotto l'arteria carotide nel sito di iniezione proposto. Questo sosterrà la nave durante l'iniezione.</li>
	<li>Sul rostrale comune dell'arteria carotide al sito di iniezione proposto, posizionare una terza legatura (L3) con un nodo allentato. Questo viene stretto solo dopo l'iniezione (al punto 3.16).</li>
	<li>Agitare delicatamente la sospensione cellulare e aspirare 200 μL di sospensione cellulare in una siringa da insulina (con ago da 31 G).</li>
	<li>Caricare la siringa nel driver della siringa collegato a un pedale attivante.</li>
	<li>Attaccare una cannula fine con un ago da 31 G alla siringa e innescare la linea.</li>
	<li>Controllare se l'arteria carotide è ben posizionata e pressurizzata.</li>
	<li>Utilizzando due pinze ad angolo sottile, una delicatamente tesa sull'estremità della prima legatura e l'altra che tiene l'ago da 31 G, inserire lentamente l'ago con smussatura nel lume del vaso sanguigno facendo attenzione a non perforarlo.</li>
	<li>Iniettare lentamente 100 μL di sospensione cellulare (dal punto 1.13) nell'arteria carotide comune a 10 μL/s. Questo fornirà 2,5 x 105 cellule nel vaso sanguigno. L'iniezione di successo viene visualizzata tramite la pulizia del sangue dal vaso sanguigno carotideo.</li>
	<li>Sollevare delicatamente e stringere la legatura sciolta (L3) (dal punto 3.9) immediatamente dopo aver ritirato l'ago per evitare il riflusso e il sanguinamento. Tagliare la sutura in eccesso. NOTA: È normale osservare una piccola quantità di sangue che sgorga dopo il ritiro dell'ago. Tuttavia, non ci deve essere alcun sanguinamento attivo dopo che la terza legatura è stata stretta.</li>
	<li>Rimuovere il pezzo di tergicristalli monouso a basso contenuto di lanugine inumiditi.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta P200, sciacquare la cavità chirurgica due volte con 150-200 μL di acqua sterile o soluzione salina.</li>
	<li>Controllare nuovamente il sanguinamento, quindi rimuovere i divaricatori.</li>
	<li>Riposizionare i tessuti molli, le ghiandole salivari e la pelle sopra l'arteria carotide e la trachea.</li>
	<li>Chiudere lo strato cutaneo dell'incisione utilizzando un supporto per ago da sutura, una pinza e una sutura monofilamento 6/0 assorbibile o non assorbibile in uno schema continuo.</li>
	<li>Eliminare la siringa ad ago della cannula e preparare una nuova configurazione per il mouse successivo. L'uso di una nuova siringa assicurerà che il numero di cellule iniettate in ciascun topo sia coerente. NOTA: le istantanee rappresentative della procedura sono riportate nella figura supplementare 2. Se la nave viene perforata o strappata dall'ago, indicata dalla perdita di iniettare o sanguinamento, la procedura è considerata infruttuosa. Successivamente, l'ago deve essere ritirato e la terza legatura deve essere immediatamente serrata per evitare ulteriori sanguinamenti. Se il sanguinamento è persistente dopo il serraggio della sutura, l'animale deve essere eutanasia con pentobarbital.</li>
</ol>4. Recupero post-iniezione
<ol><li>Iniettare buprenorfina (50 μg/kg) e meloxicam (1 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea come sollievo dal dolore post-chirurgico.</li>
	<li>Spostare l'animale in una gabbia calda e pulita per riprendersi dall'anestesia. È normale che un animale abbia un'attività sottomessa (rannicchiato e inattivo o che si muove lentamente) dopo il risveglio.</li>
	<li>Dopo 30-45 minuti, trasferire i topi in una struttura di detenzione a lungo termine.</li>
	<li>Fornire ai topi una dieta morbida (gel dietetico, idrogel, poltiglia) per almeno una settimana dopo l'intervento chirurgico e controllare quotidianamente lo stato fisico con particolare attenzione ai segni di ictus, infezione, sanguinamento intorno al sito della ferita.</li>
	<li>Due giorni dopo l'intervento, è tipico che l'animale abbia un'attività ridotta, una leggera pelliccia arruffata e abbia perso il 15% del peso corporeo preoperatorio. Somministrare analgesico (meloxicam) ogni giorno per 2-3 giorni post-intervento chirurgico per gestire il dolore e aiutare il recupero.</li>
	<li>Dal giorno 3 in poi, gli animali devono aver riacquistato attività, aumentato la frequenza di alimentazione e toelettatura e riacquistato peso. Eutanasia degli animali con deficit di condizione fisica persistente (dolore, rannicchiamento, inattività, perdita di peso) dopo 4 giorni dall'intervento iniettando pentobarbital di sodio a 200 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale.</li>
	<li>L'attecchimento e la progressione del tumore possono essere monitorati utilizzando l'anestesia e la modalità di imaging di scelta come l'imaging bioluminescente, la risonanza magnetica o la PET / MRI. Il requisito e la capacità di effettuare tale imaging dipenderanno intrinsecamente dagli obiettivi del progetto individuale e dalla struttura all'interno della quale viene intrapresa e, a seconda del tipo di tag del reporter, delle linee cellulari utilizzate, dell'accessibilità delle pertinenti strutture di radiochimica e di imaging nucleare36,37 NOTA: Alcuni animali potrebbero non rispondere bene e sperimentare un ictus nonostante una procedura di successo. Dopo la procedura, gli animali che presentano sintomi di sofferenza neurologica (girare la testa e tirare da un lato, comportamento circolare, rotolare, colpire, perdita della funzione motoria) devono essere immediatamente eutanasiati.</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto, o nella decisione di pubblicare l'articolo.

Le metastasi cerebrali sono un processo complesso di cellule tumorali che si diffondono dal loro sito primario al cervello. Sono disponibili diversi modelli animali che rispecchiano alcune fasi di questo processo a più fasi e ci sono considerazioni fisiologiche e pratiche per la progettazione di studi preclinici sulle metastasi41,42. La maggior parte degli studi pubblicati che studiano l'uso della nanomedicina per il trattamento delle metastasi cerebrali hanno ut...

Le metastasi cerebrali sono un tumore maligno prevalente associato a una prognosi molto sfavorevole 1,2. Lo standard di cura per i pazienti sottoposti a metastasi cerebrali è multimodale, costituito da neurochirurgia, radioterapia cerebrale completa e/o radiochirurgia stereotassica a seconda dello stato di salute generale dei pazienti, del carico di malattia extracranica e del numero e della posizione dei tumori nel cervello 3,4. I pazienti con un massimo di tre lesioni intracraniche sono eleggibili per la resezione chirurgica o la radiochirurgia stereotassica, mentre la radioterapia dell'intero cervello è raccomandata per i pazienti con lesioni multiple per evitare il rischio di infezione correlata alla chirurgia ed edema5. Tuttavia, la radioterapia dell'intero cervello può infliggere danni alle strutture cerebrali radiosensibili, contribuendo alla scarsa qualità della vita6.
La terapia sistemica è un approccio logico alternativo e non invasivo per il trattamento di pazienti con lesioni multiple7. Tuttavia, è meno considerato a causa della nozione di lunga data che le terapie sistemiche hanno scarsa efficacia perché la somministrazione passiva di farmaci citotossici attraverso il flusso sanguigno non può raggiungere livelli terapeutici nel cervello senza il rischio di tossicità pericolosa8. Questo paradigma sta iniziando a cambiare con la terapia sistemica recentemente approvata dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti (tucatinib con trastuzumab e capecitabina indicato per metastasi cerebrali del carcinoma mammario HER2+)9,10,11,12 e l'aggiornamento delle linee guida per il trattamento per includere la considerazione delle opzioni di terapia sistemica per i pazienti con metastasi cerebrali13,14.
In questo contesto, gli sviluppi nel campo della terapia molecolare mirata, dell'immunoterapia e dei sistemi alternativi di somministrazione di farmaci, come un vettore di nanofarmaci mirato, possono potenzialmente superare le sfide del trattamento delle metastasi cerebrali15,16,17,18. Inoltre, sono in fase di studio anche approcci chimici e meccanici per migliorare la somministrazione di farmaci attraverso la permeabilizzazione della barriera cervello-tumore19,20. Per studiare e ottimizzare tali approcci in modo che siano adatti allo scopo, è fondamentale utilizzare modelli preclinici che non solo rispecchino la complessa fisiologia delle metastasi cerebrali, ma consentano anche un'analisi obiettiva della risposta intracranica ai farmaci.
In generale, gli attuali approcci per modellare le metastasi cerebrali in vivo coinvolgono l'iniezione intracardiaca (ventricolo sinistro), endovenosa (di solito vena della coda), intracranica o intracarotidea (arteria carotide comune) di cellule tumorali nei topi 21,22,23,24,25,26,27 . Oltre alle strategie di attecchimento tumorale, i modelli murini geneticamente modificati in cui la formazione del tumore è innescata dalla rimozione dei geni oncosoppressori o dall'attivazione di oncogeni sono utili per la modellazione del tumore. Tuttavia, solo pochi modelli murini geneticamente modificati sono segnalati per produrre tumori secondari e ancora meno che producono in modo affidabile metastasi cerebrali28,29,30.
I metodi di attecchimento come l'iniezione intracardiaca (ventricolo sinistro) e endovenosa (di solito vena della coda) imitano la diffusione sistemica del cancro. Questi modelli producono tipicamente lesioni in più organi (ad esempio, cervello, polmoni, fegato, reni, milza) a seconda del letto capillare che intrappola la maggior parte delle cellule tumorali durante il loro "primo passaggio" circolatorio31. Tuttavia, tassi incoerenti di attecchimento cerebrale richiederanno più animali per raggiungere la dimensione del campione per la potenza statistica desiderata. Il numero di cellule tumorali che alla fine si stabiliscono nel cervello attraverso questi metodi di iniezione intracardiaca e endovenosa è variabile. Quindi, il carico tumorale delle metastasi cerebrali può variare tra gli animali e la differenza di progressione può rendere difficile standardizzare la tempistica sperimentale e l'interpretazione dei risultati. Il carico tumorale extracranico può portare alla mortalità per metastasi non cerebrali, rendendo questi modelli inadatti per valutare l'efficacia intracranica. Le linee cellulari cervello-tropico sono state stabilite utilizzando processi artificiali di selezione clonale per ridurre l'insediamento extracranico, ma i tassi di assunzione sono stati incoerenti e il processo di selezione clonale può ridurre l'eterogeneità normalmente riscontrata nei tumori umani32.
I metodi di attecchimento specifici del cervello come l'iniezione intracranica e intracarotidea consentono una modellazione delle metastasi cerebrali più coerente ed efficiente. Nel metodo intracranico33, le cellule tumorali vengono tipicamente iniettate nella corteccia cerebrale frontale, che genera una crescita tumorale rapida e riproducibile con un basso coinvolgimento sistemico. Mentre la procedura è ben tollerata con bassa mortalità33, le avvertenze sono che si tratta di un approccio relativamente grezzo che introduce rapidamente un bolo (localizzato) di cellule nel cervello e non modella la patogenesi precoce delle metastasi cerebrali. L'ago danneggia la vascolarizzazione del tessuto cerebrale, che quindi causa infiammazione localizzata 5,34. Dall'esperienza, c'è una tendenza per l'iniezione di cellule tumorali al reflusso durante la rimozione dell'ago, portando al coinvolgimento leptomeningeo. In alternativa, il metodo intracarotideo trasporta le cellule nell'arteria carotide comune con microvascolarizzazione cerebrale come primo letto capillare da incontrare, modellando la sopravvivenza in circolazione, stravaso e colonizzazione24. In accordo con altri25, la nostra esperienza con questo metodo ha scoperto che può provocare tumori facciali a causa della consegna involontaria di cellule tumorali attraverso l'arteria carotide esterna ai letti capillari in questi tessuti (dati non pubblicati). È possibile prevenire i tumori facciali legando prima l'arteria carotide esterna prima dell'iniezione comune dell'arteria carotide (Figura 1). Nel resto dell'articolo, questo metodo è indicato come "iniezione interna di arteria carotide". Per esperienza, il metodo di iniezione dell'arteria carotidea interna genera costantemente metastasi cerebrali con pochissimi eventi sistemici e ha avuto successo nel generare modelli di metastasi cerebrali di diversi tumori primari (ad esempio, melanoma, mammella e tumori polmonari) (Figura 1). Gli svantaggi sono che è tecnicamente impegnativo, richiede tempo, invasivo e richiede un'attenta ottimizzazione del numero di celle e una tempistica di monitoraggio. In sintesi, entrambi i metodi di iniezione intracranica e interna dell'arteria carotide producono modelli murini adatti a valutare l'impatto terapeutico sul beneficio di sopravvivenza correlato al tumore cerebrale.
Questo protocollo descrive il metodo di iniezione dell'arteria carotide interna per produrre un modello murino di metastasi cerebrali con quasi nessun coinvolgimento sistemico e quindi adatto per la valutazione preclinica della distribuzione dei farmaci e dell'efficacia delle terapie sperimentali.
<img alt="Diagramma del modello di metastasi del cancro al cervello di topo con configurazione dell'iniezione dell'arteria carotidea; risultati istologici." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64216/64216fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo di iniezione dell'arteria carotide interna per le metastasi cerebrali. L'iniezione interna dell'arteria carotide con legatura esterna dell'arteria carotide può produrre in modo affidabile un modello di metastasi cerebrale da vari tumori primari. In questo protocollo, tre legature sono posizionate sull'arteria carotide (annotate come L1-L3 nella figura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64216/64216fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>100&micro; Filtro cellulare Anello</td><td>Corning</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>30G Ago per microbilancia</td><td>BD</td><td>23748</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina 31G Ultra-Fine II</td><td>BD</td><td>326103</td><td></td></tr><tr><td>Pinza angolata</td><td>Proscitech</td><td>T67A-SS</td><td>A punta fine, angolata senza dentellature, punta da 18 mm, lunghezza 128 mm</td></tr><tr><td>Tappetino</td><td></td><td></td><td></td>termico per animali</tr><tr><td>Antibiotico e antimicotico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Sacche</td><td></td><td></td><td></td>per autoclave</tr><tr><td>BT-474 (HTB-20) linea cellulare per carcinoma mammario</td><td>ATCC</td><td>HTB-20</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (TEMGESIC)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule Countess</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Diet-76A</td><td>ClearH2O</td><td>72-07-5022</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>di dissezione</tr><tr><td>Perforatore</td><td></td><td></td><td></td>per orecchie</tr><tr><td>Tosatrici</td><td></td><td></td><td></td>elettriche</tr><tr><td>Pinze ad angolo fine</td><td>Proscitech</td><td>DEF11063-07</td><td>Angolato 45 gradi, Punta liscia, Larghezza della punta: 0,4 mm, Dimensione della punta: 0,4 x 0,3 mm, lunghezza 9 cm</td></tr><tr><td>Tubo sottile per cannula, Tubo OD (in) 1/32, Tubo ID (in) 1/100in</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06419-00</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution senza calcio e magnesio</td><td>ThermoFisher Scientific 14170120</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>ClearH2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Tergicristalli monouso a bassa lanugine</td><td>Kimberly Clark- Kimwipes</td><td>Z188964</td><td></td></tr><tr><td>Purè di topo chow</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (METACAM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nose cone</td><td></td><td></td><td>Realizzato con un tubo di microfuga</td></tr><tr><td>PAA lubrificante oculare (Carbomer 2mg/g)</td><td>&nbsp; Bausch e lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di iodio povidone</td><td>Betadine</td><td>2505692</td><td></td></tr><tr><td>DPI (guanto, maschera, camice, retina per capelli)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Divaricatori</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in seta 13mm 5-0, P3, 45cm</td><td>Ethicon</td><td>JJ-640G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione fisiologica normale sterile</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TM4469</td><td></td></tr><tr><td>Nastro</td><td></td><td></td><td></td>adesivo</tr><tr><td>Pannello</td><td></td><td></td> chirurgico <td>Un tagliere avvolto con sacchetto autoclavabile.</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Proscitech</td><td>T104</td><td>Dimensioni della punta (LxP): 38x7mm, lunghezza 115mm</td></tr><tr><td>Pinza per sutura/ Pinza Brophy curva</td><td>Proscitech</td><td>T113C</td><td>Curvo, arrotondato punta stretta da 2 mm, con dentellature, lunghezza 165 mm</td></tr><tr><td>Porta ago da sutura (portaago Olsen Hegar)</td><td>Proscitech</td><td>TC1322-180</td><td>lunghezza 190 mm, morsetto a cricchetto</td></tr><tr><td>Cacciasiringa con pedale/ UMP3 Ultra micro pompa</td><td>World Precision Instruments</td> Pallone per colture tissutali <td>UMP3-3</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Thread</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trigene II disinfettante per superfici</td><td>Ceva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue e Cell Counting Camera Vetrini</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express terreno</td> <td>dissocianteThermoFisher Scientific 12605010</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione interna di cellule tumorali nell'arteria carotide

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Le metastasi cerebrali sono una causa di grave morbilità e mortalità nei pazienti oncologici. Gli aspetti critici delle malattie metastatiche, come il complesso microambiente neurale e l'interazione delle cellule stromali, non possono essere completamente replicati con saggi in vitro ; Pertanto, i modelli animali sono fondamentali per studiare e comprendere gli effetti dell'intervento terapeutico. Tuttavia, la maggior parte dei metodi di xenotrapianto di tumori cerebrali non produce metastasi cerebrali in modo coerente in termini di lasso di tempo e carico tumorale. I modelli di metastasi cerebrali generati dall'iniezione intracardiaca di cellule tumorali possono provocare un carico tumorale extracranico non intenzionale e portare a morbilità e mortalità metastatiche non cerebrali. Sebbene l'iniezione intracranica di cellule tumorali possa limitare la formazione di tumori extracranici, ha diversi avvertimenti, come le cellule iniettate spesso formano una singola massa tumorale nel sito di iniezione, un elevato coinvolgimento leptomeningeo e danni alla vascolarizzazione cerebrale durante la penetrazione dell'ago. Questo protocollo descrive un modello murino di metastasi cerebrali generate dall'iniezione interna dell'arteria carotide. Questo metodo produce tumori intracranici in modo coerente senza il coinvolgimento di altri organi, consentendo la valutazione di agenti terapeutici per le metastasi cerebrali.

Confronto tra l'iniezione dell'arteria carotide comune con o senza legatura esterna dell'arteria carotide Quando le cellule tumorali sono state iniettate attraverso l'arteria carotide comune senza prima legare l'arteria carotide esterna24, i tumori facciali sono stati trovati nel 77,8% dei topi trapiantati (n = 7/9 animali). Un esempio di tumore facciale è illustrato nella Figura supplementare 3. Il metodo descritto in questo protocollo previe...

Le metastasi cerebrali sono una causa di grave morbilità e mortalità nei pazienti oncologici. La maggior parte dei modelli murini di metastasi cerebrali sono complicati da metastasi sistemiche che confondono l'analisi della mortalità e dei risultati dell'intervento terapeutico. Presentato qui è un protocollo per l'iniezione carotidea interna di cellule tumorali che produce tumori intracranici coerenti con tumori sistemici minimi.

Modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione interna di cellule tumorali nell'arteria carotide

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Allora perché questo protocollo è significativo? Bene, le metastasi cerebrali sono molto difficili da trattare e questo protocollo produce un modello murino clinicamente rilevante con tumori extracranici minimi. Questa tecnica consente un'analisi obiettiva della distribuzione dei farmaci e della risposta dai tumori intracranici.Il vantaggio principale di questa tecnica è che il modello è altamente riproducibile e le metastasi cerebrali si sviluppano in un tempo relativamente breve dopo l'iniezione. La progressione della malattia è simile tra gli animali, rendendo più facile per i ricercatori standardizzare gli esperimenti, le tempistiche di trattamento e gli endpoint. Il mio consiglio per i principianti è di esercitarsi con la pinza e la siringa mentre guardano attraverso il microscopio a dissezione, familiarizzando con i punti di riferimento anatomici intorno al collo e praticando il protocollo in presenza di un veterinario.Iniziare seminando cellule tumorali BT-474 a una densità di semina di due volte 10 alle sei cellule in un pallone T-75 usando 10 millilitri di terreno di crescita completo e coltura fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 70-80% prima dell'iniezione. Il giorno dell'iniezione, scartare i terreni di crescita e lavare il monostrato cellulare con PBS due volte e aggiungere cinque millilitri di reagente di dissociazione della coltura cellulare preriscaldato. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando le cellule non si sono staccate.Dopo cinque minuti, rimuovere il pallone dall'incubatrice e picchiettarlo delicatamente per favorire il distacco della cellula. Aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura completo contenente il 10% di FBS per estinguere l'attività del reagente di dissociazione. Risospendere delicatamente le cellule nella soluzione mediante pipettaggio per ridurre i grumi di cellule.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri e centrifugare a 180 G per tre minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di HBSSS senza calcio e magnesio per ridurre al minimo l'aggregazione cellulare. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 G per tre minuti a temperatura ambiente Decantare il surnatante per rimuovere il siero residuo o il reagente di dissociazione e risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di HBSS.Posizionare un filtro cellulare da 100 micrometri su un tubo conico fresco da 50 millilitri e passare la sospensione cellulare per rimuovere i grumi cellulari. Calcolare il numero di cellule vitali usando il tripano blu e diluire la sospensione cellulare con HBSS a una concentrazione cellulare di 2,5 volte 10 alle sei cellule per millilitro. Tenere il tubo orizzontale sul ghiaccio e scuotere delicatamente il tubo periodicamente per ridurre al minimo l'aggregazione.La sospensione cellulare può essere conservata sul ghiaccio per un massimo di sei ore. Mouse ear-punch per l'identificazione e utilizzare tagliacapelli elettrici per radere la pelliccia dalla regione del collo. Pulire i peli in eccesso dalla pelle esposta usando del nastro adesivo.Applicare lubrificante oculare sugli occhi per prevenire l'essiccazione. Fissare delicatamente il mouse agganciando i denti incisivi superiori usando un filo fissato alla scheda chirurgica, seguito da un nastro adesivo sulle zampe anteriori e posteriori. Questo passaggio estende il corpo e mantiene il collo dritto durante la procedura.Per la preparazione della pelle preoperatoria, pulire il collo con un antisettico topico come lo iodio povidone per ridurre il carico della microflora cutanea e rimuovere i peli sciolti. Pulire dal centro della pelle, lavorando verso l'esterno per prevenire la ricontaminazione del sito di incisione. Ripetere il processo utilizzando il 70% di etanolo ed eseguire tre cicli alternati di iodio ed etanolo per la disinfezione.Controllare il riflesso tramite il pinch test per garantire la morte dell'anestesia prima di continuare la procedura. Stendere un drappo chirurgico sterile sull'animale. Sotto il microscopio a dissezione, praticare un'incisione verticale di 15 millimetri lungo la linea mediana nella regione del collo del topo usando le forbici, partendo da cinque millimetri sotto la mascella fino all'ingresso toracico.Utilizzando due paia di pinze angolate, separare la pelle e le ghiandole salivari sottostanti e applicare divaricatori per mantenere esposta la trachea. Utilizzando due paia di pinze ad angolo sottile, sezionare senza mezzi termini il muscolo e il tessuto adiposo adiacente alla trachea per esporre la guaina carotide destra. La guaina carotidea è lo strato fibroso che copre l'arteria carotide comune, la vena e il nervo vago, e questo fascio può essere visualizzato dall'arteria carotide comune rosso vivo.Cancellare un segmento dell'arteria carotide comune caudale alla biforcazione carotidea della fascia circostante e separarlo dal nervo vago e dalle vene. Isolare e cancellare la biforcazione carotidea dai nervi e dalla fascia circostanti. Posizionare una pinza fine sotto l'arteria carotide esterna e passare una sutura di seta 5-0 sotto l'arteria.Annodare e stringere la sutura e tagliare la linea in eccesso. Posizionare una pinza fine sotto l'arteria carotide comune e passare una sutura di seta 5-0 sotto l'arteria. Legare un nodo e stringere la sutura in una posizione prossimale al sito di iniezione proposto.Tagliare la sutura in eccesso, lasciando circa 10 millimetri della linea. Tagliare e inumidire una striscia di tergicristalli monouso a basso contenuto di lanugine di circa 10 per 5 millimetri. Piegare la striscia e posizionarla sotto l'arteria carotide nel sito di iniezione proposto.Questo sosterrà la nave durante l'iniezione. Sul rostrale comune dell'arteria carotide al sito di iniezione proposto, posizionare una terza legatura con un nodo sciolto. Questo è stretto solo dopo l'iniezione.Agitare delicatamente la sospensione cellulare e aspirare 200 microlitri di sospensione cellulare in una siringa da insulina con un ago da 31 gauge. Caricare la siringa nel driver della siringa collegato a un pedale attivante. Attaccare una cannula fine con un ago calibro 31 alla siringa e innescare la linea.Controllare se l'arteria carotide è ben posizionata e pressurizzata. Utilizzando due pinze ad angolo fine, una delicatamente tesa sull'estremità della prima legatura e l'altra che tiene l'ago calibro 31, inserire lentamente l'ago con la smussatura nel lume del vaso sanguigno, facendo attenzione a non perforarlo. Iniettare lentamente 100 microlitri di sospensione cellulare preparata in precedenza nell'arteria carotide comune a 10 microlitri al secondo.Questo consegnerà 2,5 volte 10 alle quinte cellule nel vaso sanguigno. L'iniezione di successo può essere visualizzata attraverso la pulizia del sangue dal vaso sanguigno carotideo. Sollevare delicatamente e stringere la legatura sciolta immediatamente dopo aver ritirato l'ago per evitare il riflusso e il sanguinamento.Tagliare le suture in eccesso e rimuovere il pezzo di tergicristalli monouso a basso contenuto di lanugine inumiditi. Utilizzando una pipetta P-200, sciacquare la cavità chirurgica due volte con 150-200 microlitri di acqua sterile o soluzione salina. Dopo aver controllato i sanguinamenti, riposizionare i tessuti molli, le ghiandole salivari e la pelle sopra l'arteria carotide e la trachea.Chiudere lo strato cutaneo dell'incisione utilizzando un portaago da sutura, una pinza e una sutura monofilamento 6-0 riassorbibile o non assorbibile in uno schema continuo. Iniettare 50 microgrammi per chilogrammo di buprenorfina e un milligrammo per chilogrammo di meloxicam tramite iniezione sottocutanea come sollievo dal dolore post-chirurgico. Spostare l'animale in una gabbia calda e pulita per riprendersi dall'anestesia.La lectina è stata iniettata nell'arteria carotide comune dei topi con o senza legatura esterna dell'arteria carotide. Una riduzione della lectina è stata osservata nei tessuti delle guance quando l'arteria carotide esterna è stata legata. I risultati hanno mostrato che la legatura non ha avuto alcun impatto sulla consegna del cervello.La progressione del tumore è stata monitorata utilizzando la linea cellulare di carcinoma mammario amplificata da luciferasi, HER2. Il modello di metastasi cerebrali BT474 ha mostrato un aumento dei segnali bioluminescenti dalla quinta settimana di iniezione carotidea interna e progressivamente è cresciuto successivamente. Dalle settimane cinque a otto, l'intensità del segnale eterogeneo indicava un tumore intracranico con perfusione fluida complessa.La concentrazione di gadolinio all'interno della regione tumorale è aumentata man mano che fuoriusciva dalla circolazione sanguigna nel tessuto tumorale. L'accumulo di nanomedicina e metastasi cerebrali è stato confermato nei topi BT-474 da livelli di nanomedicina più elevati rilevati nella regione tumorale rispetto alle regioni cerebrali non coinvolte. Con il progredire del modello di metastasi cerebrale BT-474, gli animali hanno iniziato a perdere fino al 20% del peso corporeo, rendendo il tempo di sopravvivenza mediano nove settimane dopo l'iniezione.I risultati istologici hanno descritto che i tumori erano localizzati unilateralmente, corrispondendo al sito di iniezione carotidea in cui i tumori apparivano per lo più come masse solide e solitarie. Sacche di spazi vuoti sono state frequentemente osservate e consistevano in cellule necrotiche, mentre escrescenze più piccole erano presenti anche in alcuni animali. La cosa più importante da ricordare quando si tenta il protocollo è preparare e posizionare correttamente l'arteria carotide prima di inserire l'ago, e quindi applicare la giusta tensione durante l'inserimento dell'ago.Questo modello è utile per i ricercatori che esplorano la somministrazione di farmaci al cervello e l'efficacia delle nuove terapie per il trattamento delle metastasi cerebrali.

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Modellazione delle metastasi del tumore cerebrale tramite iniezione di cellule tumorali nell'arteria carotide interna

Un seno cancro al cervello metastasi modello del mouse viene stabilito con ecografia guidata iniezione intracardiaca delle cellule MDA-MB231/Br-GFP. Sviluppo delle metastasi intracraniche multifocali è stato monitorato longitudinalmente utilizzando ad alta risoluzione di 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging guidata intracardiaca iniezione di sviluppare un modello murino di Breast Cancer metastasi cerebrali Seguito da longitudinale MRI

Cervello metastasi è diventato un bisogno medico non soddisfatto urgente come la sua incidenza è aumentata mentre le opzioni terapeutiche sono rimaste palliative. La creazione di modelli animali sperimentali di metastasi cerebrali tramite iniezione arteriosa intracarotidea delle cellule tumorali facilita gli studi meccanicistici della biologia della malattia e la valutazione dei regimi di intervento innovative.

Intracarotidea Cancer Cell iniezione per produrre modelli murini di cervello Metastasi

La modellazione della metastasi cerebrale intracraniciale è complicata dall'incapacità di monitorare le dimensioni del tumore e la risposta al trattamento con metodi precisi e tempestivi. La metodologia presentata accoppia l'iniezione di tumore intracranico con l'analisi della risonanza magnetica, che se combinata, coltiva iniezioni precise e coerenti, un monitoraggio degli animali migliorato e misurazioni accurate del volume tumorale.

Modellazione delle metastasi cerebrali attraverso l'iniezione intracraniciale e la risonanza magnetica

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Questo manoscritto fornisce la procedura dettagliata dell'iniezione intra-iliaca dell'arteria (IIA), una tecnica per fornire cellule tumorali specificamente ai tessuti degli arti posteriori, comprese le ossa, per stabilire metastasi ossee sperimentali. Sebbene inizialmente stabilito con modelli di tumore al seno, questo protocollo può essere facilmente esteso ad altri tipi di cancro.

Intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo Modellazione di microscopico metastasi ossee

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Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Scopri come creare un modello murino riproducibile di metastasi cerebrali mediante iniezione intracarotidea di cellule tumorali. Questo metodo consente tumori intracranici consistenti con metastasi sistemiche minime, facilitando lo studio di interventi terapeutici.

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