Larve di pesce zebra come modello per valutare potenziali radiosensibilizzanti o protettori

Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati per utilizzare gli embrioni di zebrafish per esperimenti di screening basati sulle radiazioni e alcuni approcci osservazionali per valutare il trattamento di diversi farmaci e radiazioni. Questo aiuterà i lettori a impostare uno screening farmacologico ad alto rendimento che preveda l'esposizione ai raggi X utilizzando embrioni di zebrafish, che guiderà nella valutazione della radiotossicità e dell'efficacia dei diversi farmaci utilizzati. Questa procedura può essere utilizzata per lo screening e la convalida o la valutazione di diversi farmaci come potenziali radiosensibilizzanti o protettori, che possono essere ulteriormente esplorati o utilizzati nel campo della radioterapia o della radiobiologia del cancro.

Per iniziare, monitora gli embrioni in crescita al microscopio da dissezione. Identificare lo stadio corretto e rimuovere eventuali embrioni morti o malati. Assicurarsi che l'adeguata stadiazione dell'embrione sia la radiazione e che le dosi di farmaco vengano somministrate in una particolare fase di gastrulazione.

Prima di iniziare l'esperimento, distribuire accuratamente gli embrioni sani nelle piastre sperimentali con l'aiuto di una pipetta Pasteur. Per ogni gruppo sperimentale, prelevare da 15 a 20 embrioni. Durante l'impostazione di un esperimento sulle radiazioni, includere un gruppo di controllo non irradiato e un gruppo di sole radiazioni.

Distribuire gli embrioni in una piastra a pozzetti se gli schermi antiradiazioni possono coprire e proteggere i pozzetti extra dalle radiazioni mentre gli altri pozzetti sono esposti a una particolare dose di radiazioni. In caso contrario, utilizzare piastre o dischi individuali per vedere gli embrioni per dose di radiazioni. Accendere l'irradiatore a raggi X e avviare l'inizializzazione e il riscaldamento della macchina.

Posizionare la piastra sperimentale sotto l'irradiatore all'interno della macchina al centro, assicurandosi che la piastra sia direttamente sotto la sorgente di raggi X. E poi impostare la dose e iniziare la radiografia. Al termine dell'irradiazione, estrarre le piastre, chiudere il programma della macchina, spegnere la macchina e controllare le piastre al microscopio subito dopo la radiazione.

Prelevare gli embrioni morti e registrarne il numero dopo averli valutati al microscopio da dissezione. Rimettere le piastre nell'incubatrice a 28.5 gradi Celsius. Raccogliere dati a intervalli di tempo predeterminati dopo l'emissione della radiazione.

Registrare tutte le possibili osservazioni come la sopravvivenza, l'efficienza della schiusa, lo stadio di sviluppo, il conteggio dei battiti cardiaci, la curvatura del corpo e della coda, l'edema pericardico e l'estensione del sacco vitellino, la microcefalia, lo sviluppo della vescica natatoria, la motilità o l'attività generale, eccetera. Per acquisire immagini, scegliere embrioni rappresentativi su un vetrino pulito. Controllare gli embrioni al microscopio, orientarli in una direzione particolare.

La curva di sopravvivenza per gli embrioni irradiati a sei ore dopo la fecondazione ha mostrato che nel gruppo di controllo e negli embrioni esposti a 2 grigi e 5 grigi, non c'è stata una morte significativa negli embrioni. Il conteggio dei battiti cardiaci al minuto ha suggerito che la frequenza cardiaca è diminuita enormemente con l'aumento delle dosi di radiazioni a raggi X. Nel gruppo di controllo ad ogni intervallo di 24 ore, la frequenza cardiaca è stata osservata aumentare.

Si sospetta una grave deformazione cardiovascolare negli embrioni esposti a radiazioni 15 grigie e 20 grigie quando il battito cardiaco è diminuito enormemente. Diversi difetti fenotipici e di sviluppo sono rappresentati e valutati per gli embrioni esposti a dosi variabili di radiazioni in diversi momenti. Sono state effettuate anche osservazioni morfologiche per la flessione della colonna vertebrale o della coda, malformazione della testa e microcefalia, difetti di sviluppo, edema pericardico, deformità del sacco vitellino, deformità della vescica natatoria e cambiamenti nella struttura dell'occhio Per il protocollo che abbiamo dimostrato, la scelta di embrioni sani, il corretto posizionamento degli embrioni nell'irradiatore e la corretta valutazione delle anomalie crociate sono la chiave di questa procedura.