Name: Quantificazione della caspasi-9 immunocolorata nel tessuto retinico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Scopri un protocollo di immunocolorazione per quantificare la caspasi-9 nel tessuto retinico. Questo metodo consente di analizzare le funzioni apoptotiche e non apoptotiche con microscopia confocale.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 e dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) del National Institutes of Health (NIH), numero di premio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (a CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT), e il Dipartimento della Difesa Esercito/Aeronautica (da DURIP a CMT).

Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.
1. Preparazione del tessuto retinico e criosezione
<ol><li>Eutanasia degli animali mediante somministrazione di anestesia intraperitoneale (ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)), e perfondere i topi sottoposti a RVO (vedi8 per i dettagli) con paraformaldeide al 4% (PFA) usando una pompa peristaltica. NOTA: pizzicare l'animale per confermare la profondità dell'anestesia prima di procedere con l'eutanasia e la perfusione. I dettagli sulla perfusione possono essere trovati in16.</li>
	<li>Raccogliere gli occhi con un'attenta enucleazione con una pinza e mettere il globo in 1 ml di PFA al 4%. Lasciare gli occhi per una notte a 4 °C. Lavare gli occhi tre volte per 10 minuti, aggiungendo 1 mL di 1x PBS e mettendoli nello shaker.</li>
	<li>Immergere gli occhi in 1 ml di saccarosio al 30% per 3 giorni, fino a quando non si depositano sul fondo del tubo, indicando l'assorbimento del saccarosio.</li>
	<li>Riempire gli occhi con un composto a temperatura di taglio ottimale utilizzando una siringa da 30 G, fino a quando l'occhio ha un aspetto arrotondato (circa 50 μL).</li>
	<li>Incorporare gli occhi in un criomold con composto a temperatura di taglio ottimale fino a coprire gli occhi e congelare a -80 °C fino al momento della criosezione.</li>
	<li>Sezione incorporata gli occhi a 20 μm su vetrini usando un criostato.<ol><li>Rimuovere il blocco composto della temperatura di taglio ottimale dal criostampo.</li>
		<li>Posizionalo sul mandrino del criostato aggiungendo un composto di temperatura di taglio ottimale e posizionando il blocco sul mandrino. Lasciarlo all'interno del criostato fino a quando non si congela.</li>
		<li>Procedere a tagliare il blocco a 20 μm fino a quando non si vede il tessuto retinico. NOTA: Questo può essere confermato con un microscopio ottico con ingrandimento 30x (obiettivo 3x, oculari 10x). I tessuti possono essere distinti dai terreni OCT per colore e forma.</li>
		<li>Raccogliere il tessuto retinico in vetrini da microscopio in una serie di quattro sezioni per vetrino. NOTA: Vedere la Figura 1A per il posizionamento suggerito delle sezioni retiniche.</li>
	</ol></li>
	<li>Etichettare le diapositive con un ID che de-identifichi il trattamento e il genotipo.</li>
	<li>Conservare i vetrini a -20 °C fino alla colorazione.</li>
</ol>2. Immunoistochimica
NOTA: Utilizzare tessuto crioconservato fisso per l'immunoistochimica per mantenere la morfologia cellulare. Scegli le sezioni che si trovano a livello delle immagini di tomografia a coerenza ottica (OCT) acquisite in vivo7. Utilizzare le prime due serie di vetrini raccolti dal criostato o sezioni da 150 μm nel tessuto retinico.
<ol><li>Posizionare i vetrini in una camera di scorrimento buia e umida.</li>
	<li>Permeabilizzazione e blocco: lavare le sezioni trasversali retiniche con 300 μL di 1x PBS per 5 minuti per rimuovere l'OCT e scartare dopo.</li>
	<li>Permeabilizzare il tessuto aggiungendo 300 μL di 1x PBS con Triton X-100 allo 0,1% per 2 ore a temperatura ambiente (RT) e scartare dopo.</li>
	<li>Bloccare il tessuto aggiungendo 300 μL di tampone bloccante (10% siero di capra normale (NGS), 1% albumina sierica bovina (BSA) in 1x PBS, filtrato) e lasciare per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Anticorpi primari: diluire gli anticorpi primari nel tampone bloccante. Gli anticorpi primari utilizzati includono anti-cl-caspasi-9 a 1:800, anti-CD31 a 1:50 e anti-caspasi-7-488 (anticorpo marcato direttamente) a 1:150. NOTA: Seguire le raccomandazioni del produttore per la diluizione appropriata degli anticorpi primari.<ol><li>Versare le sezioni tampone bloccanti e applicare 100 μL del cocktail di anticorpi primari sui vetrini retinici.</li>
		<li>Incubare le sezioni trasversali per una notte a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare le sezioni quattro volte per 5 minuti con 300 μL di 1x PBS. NOTA: Se le sezioni di tessuto sono molto fragili, i lavaggi devono essere rimossi utilizzando l'azione capillare applicando un fazzoletto all'angolo del vetrino per evitare di spostare le sezioni retiniche.</li>
	<li>Per evitare l'etichettatura incrociata degli anticorpi primari generati nella stessa specie ospite, completare la colorazione con anticorpi secondari prima di applicare gli anticorpi direttamente marcati.</li>
	<li>Anticorpi secondari: diluire gli anticorpi secondari nel tampone bloccante ad una concentrazione dello 0,1%. Ad esempio, per rilevare anti-cl-caspasi-9, un anticorpo allevato nel coniglio, utilizzare capra-anti-coniglio-568 secondario.<ol><li>Applicare 200 μL del cocktail di anticorpi secondari sulle retine.</li>
		<li>Incubare il tessuto per 2 ore a RT.</li>
		<li>Lavare le sezioni quattro volte per 5 minuti con 300 μL di 1x PBS.</li>
		<li>Colorare i nuclei per 5 minuti con 300 μL di DAPI ad una diluizione dello 0,02%.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare una volta per 5 minuti con 300 μL di 1x PBS.</li>
	<li>Posizionare un coprivetrino sulle sezioni retiniche utilizzando 500 μL di mezzo fluoromount-G, che preserva il segnale fluorescente, e posizionare con attenzione il coprivetrino sulla parte superiore del vetrino, evitando bolle.</li>
</ol>3. Imaging confocale
<ol><li>Acquisire immagini delle sezioni colorate con microscopia confocale.<ol><li>Accendere il microscopio confocale.</li>
		<li>Posizionare la diapositiva sullo stage.</li>
		<li>Regolare la messa a fuoco per vedere chiaramente la sezione retinica. NOTA: Scatta almeno quattro immagini per sezione e un'immagine quattro sezioni per retina. Vedere lo schema di imaging retinico per le aree di imaging suggerite (Figura 1B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione caspasi, vascolare e nucleare dell'immagine utilizzando un microscopio confocale con acquisizione Z-stack, utilizzando un obiettivo 20x o 40x. NOTA: i parametri di imaging e la configurazione del software devono essere costanti per tutte le immagini in un esperimento. L'obiettivo 20x fornisce una panoramica degli strati retinici, che sono ben definiti dalla colorazione nucleare. L'obiettivo 40x fornisce maggiori dettagli cellulari.<ol><li>Impostare i tempi di esposizione e intensità laser appropriati per canale facendo clic su acquisisci impostazioni.</li>
		<li>Impostare lo stack Z per visualizzare l'intera sezione facendo clic su Serie Z e impostare i parametri su e giù per coprire la profondità del tessuto.</li>
	</ol></li>
	<li>Salvare le immagini seguendo l'ID mascherato assegnato durante la criosezione.</li>
</ol>4. Quantificazione dei livelli di caspasi
<ol><li>Trascina i file immagine dei canali 405, 470, 555 e 640 sulla console delle FIJI.</li>
	<li>Fare clic su Immagine > Colore > Unisci canali.</li>
	<li>Assegnare i colori ai file come segue: rosso a 555, verde a 470, grigio a 405, ciano a 640.</li>
	<li>Comprimere lo stack Z facendo clic su Immagine > Stack > Progetto Z.</li>
	<li>Fare clic su Tipo di proiezione: Intensità massima.</li>
	<li>Aprire l'interfaccia Canali facendo clic su Immagine > Strumento Canali colore.</li>
	<li>Apri l'interfaccia Luminosità e contrasto .</li>
	<li>Selezionare i parametri per canale.<ol><li>Vai su Canali e seleziona un canale.</li>
		<li>Posizionare il cursore sopra la cella caspasi espressa e annotare il valore in pixel.</li>
		<li>Posiziona il cursore sopra lo sfondo e annota il valore in pixel.</li>
	</ol></li>
	<li>Parametri di prova<ol><li>Vai all'interfaccia Luminosità e contrasto.</li>
		<li>Fare clic su Seleziona.</li>
		<li>Inserire il valore minimo visualizzato (valore in pixel annotato della cella espressa in caspasi).</li>
		<li>Inserire il valore massimo visualizzato (valore in pixel annotato dello sfondo).</li>
		<li>Fare clic su OK.</li>
	</ol></li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.8-4.9 per tutti i canali.</li>
	<li>Testare i parametri scegliendo immagini casuali da tessuto cieco. NOTA: modificare i parametri di luminosità e contrasto solo se il valore di sfondo non è adeguato per altre immagini.</li>
	<li>Una volta impostati i parametri, aprire i file di immagine e comprimere lo Z-stack.</li>
	<li>Aggiungere i parametri di luminosità e contrasto per il canale caspasi e l'isolectina, canale marcatore vascolare.</li>
	<li>Utilizzare lo strumento puntuale per quantificare il numero di aree vascolari positive utilizzando la colocalizzazione del marcatore vascolare con espressione caspasi come lettura delle aree positive.</li>
	<li>Ripetere il punto 4.14 ma usando Hoechst come marcatore di aree neuronali positive.</li>
	<li>Annotare i valori su un foglio di calcolo per immagine.</li>
	<li>Calcola la media dei valori per sezione.</li>
	<li>Calcola la media dei valori delle sezioni: questa sarà la lettura per occhio.</li>
</ol>5. Conferma genetica della rilevanza della cellula endoteliale caspasi-9
<ol><li>Utilizzare retine ottenute dai topi Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 sottoposti a RVO7.</li>
	<li>Colorare le retine per caspasi-9 (caspasi eliminata), caspasi-7 (caspasi effettrice a valle), marcatori vascolari e DAPI come descritto sopra nel paragrafo 2.</li>
	<li>Immagine e quantificazione come descritto sopra nelle sezioni 3 e 4.</li>
</ol>6. Targeting della caspasi-9 in RVO
<ol><li>Ottenere gli occhi dai topi sottoposti a RVO seguito dall'applicazione dell'inibitore della caspasi-9 Pen1-XBir3 per via topica agli occhi come in7.</li>
	<li>Immunocolorare le retine per la caspasi-7 (una caspasi effettrice a valle), i marcatori vascolari e il DAPI come descritto sopra nel paragrafo 2.</li>
	<li>Immagine e quantificazione come descritto sopra nelle sezioni 3 e 4.</li>
</ol>

<ol><li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+cell+death%2C+inflammation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li>
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<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li>
<li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li>
<li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+in+the+balance%3A+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano i seguenti interessi concorrenti: C.M.T. ha le seguenti domande di brevetto US20200164026, US20190142915 e US20150165061. C.M.T. e S.S. hanno una domanda di brevetto US 20140024597. C.M.T., A.M.P. e M.I.A. hanno una domanda di brevetto US2020058683. C.M.T. e Y.Y.J. hanno una domanda di brevetto WO2018013519. M.I.A e CMT sono elencati come inventori su una domanda di brevetto WO / 2020 / 223212 dagli amministratori della Columbia University nella città di New York. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Le caspasi sono una famiglia multi-membro di proteasi meglio studiata per i loro ruoli nella morte cellulare e nell'infiammazione; Tuttavia, più recentemente sono state scoperte una varietà di funzioni non di morte per alcuni membri della famiglia 4,5. Gran parte della nostra comprensione della funzione delle caspasi deriva dal lavoro sulla coltura cellulare e dai dati inferenziali delle malattie umane. Mentre è apprezzato che vi sia un'induzione, attivazione o i...

Le caspasi sono una famiglia di proteasi che regolano la morte cellulare dello sviluppo, le risposte immunitarie e la morte cellulare aberrante nella malattia 1,2. Mentre è ben noto che i membri della famiglia delle caspasi sono indotti in una varietà di malattie neurodegenerative, capire quale caspasi guida la patologia della malattia è più difficile3. Tali studi richiedono strumenti per identificare, caratterizzare e convalidare la funzione dei singoli membri della famiglia delle caspasi. L'analisi delle singole caspasi rilevanti è importante sia da un punto di vista meccanicistico che terapeutico, poiché la letteratura ha molteplici studi che forniscono prove dei diversi ruoli delle caspasi 4,5. Pertanto, se l'obiettivo è quello di indirizzare una caspasi in una malattia per un beneficio terapeutico, è fondamentale avere un targeting specifico dei membri della famiglia rilevanti. Le tecniche tradizionali per rilevare i livelli di caspasi nei tessuti includono western blotting e approcci enzimatici e fluorometrici 3,6. Tuttavia, nessuna di queste misure consente il rilevamento specifico delle cellule dei livelli di caspasi e, in alcuni scenari, le caspasi scisse spesso non possono essere rilevate dalle tradizionali misure di analisi delle proteine. È noto che le caspasi possono svolgere diversi ruoli apoptotici e non apoptotici nello stesso tessuto7, pertanto è necessaria un'attenta caratterizzazione dei livelli di caspasi cellulo-specifici per una comprensione accurata dei percorsi di sviluppo e malattia.
Questo studio mostra l'attivazione e la funzione delle caspasi in un modello di ipossia neurovascolare-ischemia - occlusione venosa retinica (RVO)7,8. In un tessuto complesso come la retina, ci sono più tipi di cellule che possono essere influenzate dall'ipossia-ischemia indotta nella RVO, comprese le cellule gliali, i neuroni e la vascolarizzazione7. Nella retina del topo adulto, c'è pochissima espressione di caspasi evidente nel tessuto sano, misurata dall'immunoistochimica (IHC)7, ma questo non è il caso durante lo sviluppo9 o nei modelli di malattia retinica10,11. L'IHC è una tecnica ben consolidata nella ricerca biomedica che ha permesso la validazione di bersagli patologici e patologici, l'identificazione di nuovi ruoli attraverso la localizzazione spaziale e la quantificazione delle proteine. Nei casi in cui i prodotti di caspasi scissa non possono essere rilevati mediante western blot o analisi fluorometrica, né la posizione cellulare specifica di caspasi distinte o l'interrogazione delle vie di segnalazione della caspasi attraverso la localizzazione, allora IHC dovrebbe essere utilizzato.
Al fine di determinare le caspasi funzionalmente rilevanti nella RVO, IHC è stato utilizzato con anticorpi convalidati per caspasi e marcatori cellulari. Gli studi precedenti condotti in laboratorio hanno dimostrato che la caspasi-9 è stata rapidamente attivata in un modello di ictus ischemico e inibizione della caspasi-9 con un inibitore altamente specifico protetto dalla disfunzione neuronale e dalla morte12. Poiché la retina fa parte del sistema nervoso centrale (SNC), funge da sistema modello per interrogare e studiare ulteriormente il ruolo della caspasi-9 nelle lesioni neurovascolari13. A tal fine, il modello murino di RVO è stato utilizzato per studiare la posizione e la distribuzione specifiche delle cellule della caspasi-9 e la sua implicazione nel danno neurovascolare. RVO è una causa comune di cecità negli adulti in età lavorativa che deriva da lesioni vascolari14. È stato scoperto che la caspasi-9 era espressa in modo non apoptotico nelle cellule endoteliali, ma non nei neuroni.
Come tessuto, la retina ha il vantaggio di essere visualizzata come un flatmount, che consente l'apprezzamento delle reti vascolari, o come sezioni trasversali, che evidenzia gli strati retinici neuronali. La quantificazione dell'espressione della proteina caspasi nelle sezioni trasversali fornisce il contesto per quanto riguarda quale caspasi è potenzialmente critica nella connettività neuronale retinica e nella funzione di visione identificando la localizzazione delle caspasi nella retina. Dopo l'identificazione e la convalida, il targeting della caspasi di interesse viene ottenuto utilizzando la delezione inducibile cellulo-specifica della caspasi identificata. Per potenziali indagini terapeutiche, la rilevanza delle caspasi di interesse è stata testata utilizzando strumenti specifici per inibire la caspasi attivata. Per la caspasi-9 una cellula comprendeva inibitore altamente selettivo 7,15, Pen1-XBIR3 è stato utilizzato. Per questo rapporto, sono stati utilizzati ceppi C57BL/6J maschili di 2 mesi e ceppo knockout endoteliale inducibile da tamoxifene-9 (iEC Casp9KO) con sfondo C57BL/6J. Questi animali sono stati esposti al modello murino di RVO e C57BL/6J sono stati trattati con l'inibitore selettivo della caspasi-9, Pen1-XBir3. La metodologia descritta può essere applicata ad altri modelli di malattia nei sistemi centrale e periferico 7,15.

<table><tbody><tr><td>anti-Caspasi-7 488</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB-56529AF488</td><td>uso a 1:150</td></tr><tr><td>anti-cl-Caspasi-9</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9505-S</td><td>uso a 1:800</td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>uso a 1:50</td></tr><tr><td>Microscopio a disco rotante confocale</td><td>Biovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI 2.3.0</td><td>open source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluormount G</td><td>Fisher</td><td>50-187-88</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 topi</td><td>generati</td><td></td><td>in laboratorio vedi Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Isolectina (594, 649)</td><td>Vector</td><td>DL-1207</td><td>uso a 1:200</td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di perfusione&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen1-XBir3</td><td>generato</td><td></td><td>in laboratorio vedi Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Prism 9.1</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Fisher</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Vis-a-View 4.0</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione della caspasi-9 immunocolorata nel tessuto retinico

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

La famiglia delle caspasi è nota per mediare molti percorsi cellulari oltre la morte cellulare, tra cui la differenziazione cellulare, il pathfinding assonale e la proliferazione. Dall'identificazione della famiglia delle proteasi di morte cellulare, c'è stata una ricerca di strumenti per identificare ed espandere la funzione di specifici membri della famiglia negli stati di sviluppo, salute e malattia. Tuttavia, molti degli strumenti di caspasi attualmente disponibili in commercio che sono ampiamente utilizzati non sono specifici per la caspasi mirata. In questo rapporto, delineiamo l'approccio che abbiamo utilizzato per identificare, convalidare e indirizzare la caspasi-9 nel sistema nervoso utilizzando un nuovo inibitore e approcci genetici con letture immunoistochimiche. In particolare, abbiamo utilizzato il tessuto neuronale retinico come modello per identificare e convalidare la presenza e la funzione delle caspasi. Questo approccio consente l'interrogazione delle funzioni apoptotiche e non apoptotiche specifiche della caspasi-9 del tipo cellulare e può essere applicato ad altri tessuti complessi e caspasi di interesse. Comprendere le funzioni delle caspasi può aiutare ad ampliare le attuali conoscenze in biologia cellulare e può anche essere vantaggioso per identificare potenziali bersagli terapeutici a causa del loro coinvolgimento nella malattia.

Il protocollo descritto consente all'utente di analizzare e quantificare i livelli di caspasi-9 nel tessuto retinico. Inoltre, presenta strumenti per identificare ulteriormente, convalidare e indirizzare specificamente la caspasi-9 e i substrati a valle. I passaggi riassunti consentono un'analisi quantificabile dei livelli di caspasi e della specificità cellulare nelle fotomicrografie fluorescenti. Tutte le cifre mostrano fotomicrografie rappresentative e quantificazione dei livelli di caspasi indicati nella retina total...

Qui è presentato un protocollo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi.

Quantificazione della caspasi-9 immunocolorata nel tessuto retinico

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Questo protocollo fornisce un metodo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'interrogazione delle funzioni di caspasi-9 apoptotiche e non apoptotiche specifiche del tipo cellulare e può essere applicato ad altri tessuti complessi e caspasi di interesse. Comprendere le funzioni delle caspasi può aiutare ad ampliare le attuali conoscenze in biologia cellulare e può anche essere vantaggioso per identificare potenziali bersagli terapeutici a causa del loro coinvolgimento nella malattia.Inizia a quantificare i livelli di caspasi usando immagini al microscopio confocale di sezioni retiniche colorate. Per fare ciò, trascina i file immagine dei canali 405, 470, 555 e 640 sulla console delle Fiji. Fare clic sulle schede immagine, colore e unisci canali per assegnare colori ai file.Quindi comprimere lo stack Z facendo clic sullo stack di immagini e sul progetto Z. Selezionare il tipo di proiezione come intensità massima. Apri l'interfaccia del canale facendo clic sull'immagine seguita dallo strumento del canale di colore.Quindi, apri l'interfaccia di luminosità e contrasto. Per selezionare i parametri per canale, vai alla scheda del canale e scegli un canale. Posiziona il cursore sopra lo sfondo e annota il valore in pixel.Quindi posizionare il cursore sulla cella caspasi espressa e annotare il valore dei pixel. Per testare i parametri, vai all'interfaccia di luminosità e contrasto e fai clic su Seleziona. Inserire il valore minimo visualizzato o il valore in pixel della cella espressa dalla caspasi.Quindi collegare il valore massimo visualizzato o il valore in pixel di sfondo prima di fare clic su OK. Scegli le immagini casuali dal tessuto in cieco e ripeti la selezione dei parametri per canale per testare i parametri per tutti i canali. Una volta impostati i parametri, aprire i file di immagine e comprimere lo stack Z.Aggiungere i parametri di luminosità e contrasto per il canale caspasi e l'isolectina per il canale marcatore vascolare. Utilizzare lo strumento puntuale e quantificare il numero di aree vascolari positive utilizzando la colocalizzazione del marcatore vascolare con espressione di caspasi come lettura delle aree positive. Quindi, utilizzando i ganci come marcatore di aree neuronali positive, quantificare il numero di aree vascolari positive.Annotare i valori su un foglio di calcolo per immagine e calcolare la media dei valori per sezione. Calcola la media dei valori delle sezioni, che saranno la lettura per occhio. Il protocollo ha identificato la localizzazione cellulare delle caspasi e degli strati retinici neuronali in cui le caspasi sono espresse.La sezione trasversale retinica ha permesso la visualizzazione dei nuclei retinici nello strato gangliare retinico o RGL, strato internucleare o INL, e lo strato nucleare esterno o ONL quando colorato con ganci. Nella sezione trasversale, i vasi sanguigni retinici apparivano scollegati e separati fornendo gli strati plessiformi tra RGL e INL e tra INL e ONL. Le sezioni trasversali retiniche hanno anche identificato la caspasi-9 altamente regolata, un giorno dopo l'occlusione venosa retinica.L'inibizione della caspasi-9 è stata più efficace nel ridurre l'espressione della caspasi-7 neuronale nei topi knockout delle cellule endoteliali che hanno convalidato la rilevanza funzionale della caspasi-9 endoteliale. L'analisi rappresentativa ha mostrato che l'inibizione dell'attività della caspasi-9 bloccava farmacologicamente l'espressione della caspasi-7 dopo l'occlusione venosa retinica. Il successo della tecnica si basa su un'attenta preparazione dei tessuti, nonché sull'IHC e sull'imaging microscopico per garantire coerenza, validità e affidabilità dei dati.Questo metodo potrebbe essere combinato con l'analisi western blotting per il confronto semi-quantitativo della segnalazione delle caspasi. La tecnica ha fornito i passaggi per interrogare l'efficacia di un approccio terapeutico mirato alla caspasi-9 attiva nella RVO. Questo approccio può essere applicato anche ad altri tessuti, incluso il cervello.

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Caspasi-3 L&#39;attività nel ratto amigdala Misurato da Spettrofluorimetria dopo infarto miocardico

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Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

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