Name: Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sullepigenetica del cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri come ottimizzare ATAC-seq per tipi cellulari epiteliali nella ricerca sul cancro. Questo protocollo mappa l'accessibilità della cromatina per identificare elementi regolatori associati alla malattia e sviluppare nuove strategie terapeutiche.

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Riconosciamo con gratitudine la struttura UND Genomics Core per l'eccezionale assistenza tecnica.
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health [P20GM104360 to M.T., P20 GM104360 to A.D.] e dai fondi start-up forniti dalla University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [to M.T.].

1. Preparativi prima di iniziare l'esperimento
<ol><li>Preparare la scorta tampone di lisi. NOTA: il buffer di isolamento nucleare ottimale può essere diverso per ogni tipo di cella. Si consiglia di testare sia il tampone ipotonico utilizzato nell'articolo originale8 che un tampone CSK12,13 per ciascun tipo di cellula utilizzando la colorazione blu tripano.<ol><li>Per preparare il tampone ipotonico (tampone Greenleaf), mescolare 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e 0,1% NP-40.</li>
		<li>Per preparare il tampone CSK, miscelare 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM saccarosio, 3 mM MgCl2 e 0,1% Triton X-100.</li>
	</ol></li>
	<li>Assicurarsi che le condizioni della coltura cellulare siano ottimali; Esaminare le cellule al microscopio ottico per assicurarsi che non ci siano livelli elevati di apoptosi.</li>
	<li>Accendere la centrifuga per farla raggiungere i 4 °C.</li>
</ol>2. Prelievo cellulare
<ol><li>Aspirare il mezzo da una coltura di cellule al <80% di confluenza. Le cellule vengono tipicamente coltivate in un piatto da 35 mm o 60 mm, in base al numero di cellule necessarie, ai trattamenti, ecc.</li>
	<li>Lavare le cellule con 1 mL o 3 mL di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 ml o 1 ml di tripsina e incubare per 2-3 minuti (a seconda dei tipi di cellule). Utilizzare con cautela una pipetta da 1 mL per miscelare bene.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL o 2 mL di supporto alla piastra e mescolare bene. Trasferire in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare le celle in una provetta da 15 ml per 3 minuti a 300 x g. NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle.</li>
	<li>Aspirare il mezzo e risospendere le cellule in 1 mL o 2 mL di terreno. NOTA: È fondamentale preparare una soluzione unicellulare omogenea. Per i tessuti, un omogeneizzatore Dounce può essere utilizzato per omogeneizzare i tessuti e ridurre al minimo i grumi o gli aggregati di grandi cellule. Alcuni tessuti richiedono filtrazione (ad esempio, filtri cellulari) e / o selezione cellulare FACS per isolare le cellule vitali e ottenere una soluzione a singola cellula.</li>
	<li>Contare le celle usando un contatore di celle. NOTA: In questo studio, è stato utilizzato un contatore automatico di celle (Table of Materials).</li>
	<li>Centrifugare il volume cellulare richiesto (ad esempio, un volume contenente 1 x 106 cellule in base alla conta cellulare) a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare contenente 1 x 106 cellule in 1 mL di PBS freddo. NOTA: Se il numero di cellule è inferiore a 1 x 10 6 cellule, diminuire il volume di PBS freddo per preparare la soluzione cellulare alla stessa concentrazione (1 x 106 cellule/ml).</li>
</ol>3. Lisi cellulare
<ol><li>Trasferire 25 μL (= 2,5 x 104 celle) in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 ml. Centrifugare per 5 minuti a 500 x g a 4 °C ed eliminare accuratamente il surnatante NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle. Lasciare circa 3 μL di surnatante per assicurarsi che le cellule non vengano scartate.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL di tampone di lisi e risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato su e giù. Incubare su ghiaccio per 5 minuti</li>
	<li>Centrifugare per 5 minuti a 500 x g a 4 °C ed eliminare con cautela il surnatante. NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle. Lasciare circa 3 μL di surnatante per assicurarsi che le cellule non vengano scartate.</li>
</ol>4. Tagmentazione Tn5
<ol><li>Risospendere immediatamente il pellet in 25 μL di miscela di reazione Tn5. La miscela di reazione Tn5 è la seguente: 12,5 μL di 2x tampone DNA di Tagmentazione (tampone TD), 1,25-5 μL di Tn5 trasposasi e 11,25-7,5 μL di acqua priva di nucleasi. NOTA: La concentrazione standard di Tn5 è di 2,5 μL per 2,5 x 104 cellule.</li>
	<li>Incubare per 30 minuti a 37 °C. NOTA: Mescolare la soluzione ogni 10 minuti.</li>
</ol>5. Purificazione del DNA
NOTA: La purificazione è necessaria prima dell'amplificazione. La purificazione del DNA viene eseguita utilizzando il kit di purificazione MinElute PCR (Table of Materials).
<ol><li>Aggiungere 5 μL di acetato di sodio 3 M (pH 5,2).</li>
	<li>Aggiungere immediatamente 125 μL di Buffer PB e mescolare bene.</li>
	<li>Seguire il protocollo del kit di purificazione PCR a partire dal passaggio 2.<ol><li>Posizionare la colonna di rotazione in un tubo di raccolta da 2 ml.</li>
		<li>Applicare il campione alla colonna di centrifuga e centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT.</li>
		<li>Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta.</li>
		<li>Aggiungere 750 μL di Buffer PE alla colonna di centrifuga e centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT.</li>
		<li>Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta.</li>
		<li>Centrifugare la colonna di centrifuga per 5 minuti per asciugare completamente la membrana.</li>
		<li>Scartare il flusso passante e posizionare la colonna di rotazione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 ml.</li>
		<li>Eluire i frammenti di DNA con 10 μL di Buffer EB.</li>
		<li>Lasciare riposare la colonna per 1 minuto a RT.</li>
		<li>Centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT per eluire il DNA.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Amplificazione PCR
NOTA: l'amplificazione PCR dei DNA trasposti (taggati) è necessaria per il sequenziamento. In questo esempio sono stati utilizzati adattatori del kit Nextera (Table of Materials). I primer utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1.
<ol><li>Impostare la seguente reazione PCR in provette da 200 μL di PCR (50 μL per ciascun campione). La miscela di reazione PCR è la seguente: 10 μL di DNA eluito (fase 5.), 2,5 μL di 25 mM Adapter 1, 2,5 μL di 25 mM Adapter 2, 25 μL di 2x PCR master mix e 10 μL di acqua priva di nucleasi</li>
	<li>Eseguire il programma di amplificazione PCR parte 1 (Tabella 2). NOTA: Per l'amplificazione iniziale, le stesse condizioni vengono utilizzate per tutti i campioni che utilizzano un termociclatore standard.</li>
	<li>QPCR in tempo reale (totale di 14,5 μL per campione)<ol><li>Utilizzando 5 μL del prodotto dall'amplificazione PCR parte 1 (fase 6.2.), impostare la seguente reazione, questa volta includendo SYBR gold e il rilevamento in una macchina PCR in tempo reale.</li>
		<li>Preparare la miscela di reazione PCR come segue: 5 μL di prodotto PCR dalla fase 6.2., 0,75 μL di oro SYBR (1000x diluito), 5 μL di 2x miscela master PCR e 3,75 μL di acqua priva di nucleasi. NOTA: I numeri di ciclo precisi per l'amplificazione della libreria prima di raggiungere la saturazione per ciascun campione sono determinati da qPCR (Tabella 3) per ridurre la distorsione GC e dimensionale nella PCR10. SYBR Gold è stato diluito con acqua priva di nucleasi. Per ottenere la soluzione diluita, 1 μL di SYBR Gold (concentrazione di riserva 10.000x) è stato aggiunto a 999 μL di acqua priva di nucleasi. Il tempo di esecuzione di RT-qPCR menzionato nella Tabella 3 è di circa 60 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinare il numero richiesto di cicli PCR aggiuntivi utilizzando i parametri di esecuzione del passaggio 6.3.<ol><li>Numero di cicli = 1/4 di intensità di fluorescenza massima (satura) (tipicamente 3 o 4 cicli PCR)</li>
	</ol></li>
	<li>Programma di amplificazione PCR parte 2 (volume = 45 μL; Tabella 4): Una volta determinato il numero di ciclo, impostare PCR con cicli aggiuntivi calcolati al punto 6.4.1. Ad esempio, se il numero di cicli calcolato è 3, impostare 3 cicli nel programma seguente. I cicli totali sarebbero 8 (5 nel passo 6.2., più 3 cicli aggiuntivi nel passo 6.5.)</li>
</ol>7. Purificazione delle perline
NOTA: Qui sono state utilizzate perline AMPure XP (Table of Materials).
<ol><li>Ai prodotti PCR amplificati nella fase precedente, aggiungere 150 μL di perline a RT. NOTA: Le perline AMPure fatte in casa14 possono essere utilizzate in questo processo.</li>
	<li>Incubare per 15 minuti a RT.</li>
	<li>Posizionare i tubi su un supporto magnetico per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il surnatante.</li>
	<li>Lavare le perle con 200 μL di etanolo all'80%. NOTA: l'80% di etanolo deve essere preparato fresco.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 7.4.</li>
	<li>Rimuovere completamente l'etanolo.</li>
	<li>Asciugare all'aria i campioni per 10 minuti a RT.</li>
	<li>Risospendere con 50 μL di tampone di eluizione (10 mM Tris-HCL pH 8,0).</li>
	<li>Ripetere la purificazione delle perline (passaggi 7.1.-7.9.) per ridurre ulteriormente la contaminazione del primer.</li>
</ol>8. Concentrazione del DNA e controllo di qualità
<ol><li>Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un kit di quantificazione dell'acido nucleico (Table of Materials).</li>
	<li>Controllare i frammenti di DNA amplificati mediante elettroforesi su gel utilizzando SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% gel di agarosio) o un sistema di elettroforesi automatizzato (ad esempio, TapeStation, bioanalizzatore).</li>
</ol>9. Sequenziamento
<ol><li>Eseguire il sequenziamento ad alta produttività utilizzando i campioni di DNA amplificati12,13. NOTA: i campioni di DNA amplificato sono pronti per il sequenziamento ad alta produttività. Per conservare le informazioni sui frammenti di DNA nucleosomiali, si raccomanda il sequenziamento a estremità accoppiata rispetto al sequenziamento a estremità singola. Entrambe le estremità dei frammenti di DNA indicano dove si lega la trasposasi. Per mappare le regioni aperte della cromatina, 30 milioni di letture/campione sono in genere sufficienti.</li>
</ol>10. Analisi dei dati
<ol><li>Filtraggio dei dati in base alla qualità della chiamata di base: imposta il punteggio medio minimo di qualità di base su 20 (precisione del 99%).</li>
	<li>Rifilatura adattatore: rimuovere le sequenze dell'adattatore utilizzando uno strumento appropriato. NOTA: lo strumento avvolgitore Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) è stato utilizzato per rimuovere le sequenze dell'adattatore. Per le librerie ATAC-seq preparate da Illumina Tn5, la seguente sequenza viene utilizzata come sequenza adattatore: CTGTCTCTTATACACATCT. La lunghezza minima della sequenza per riconoscere la contaminazione dell'adattatore è impostata su 5.</li>
	<li>Mappatura del genoma: mappare le letture al genoma appropriato con Bowtie utilizzando i seguenti parametri "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Di seguito è riportato un esempio di qualità della mappatura delle cellule di carcinoma mammario basale MDA-MB-231: Leggi con almeno un allineamento segnalato: 52,79% Letture che non sono riuscite ad allinearsi: 13,10% Letture con allineamenti soppressi a causa di -m: 34,11%</li>
	<li>Deduplicazione: contrassegnare i duplicati PCR con gli strumenti Picard16.</li>
	<li>Generazione di un file di copertura del genoma per la visualizzazione dei dati: convertire le letture accoppiate deduplicate in frammenti di lettura single-end. Le tracce di copertura del genoma sono ottenute utilizzando genomeCoverageBed da bedtools17.</li>
</ol>

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<li>Bhattacharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+channel+proteins+ORAI3+and+STIM1+mediate+TGF-%CE%B2+induced+Snai1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression.</a> Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).</li>
<li>Schep, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+nucleosome+fingerprints+enable+high-resolution+mapping+of+chromatin+architecture+within+regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions.</a> Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari rilevanti o materiali relativi alla ricerca descritta in questo documento.

ATAC-seq è stato ampiamente utilizzato per mappare regioni di cromatina aperte e attive. La progressione delle cellule tumorali è spesso guidata da alterazioni genetiche e riprogrammazione epigenetica, con conseguente alterazione dell'accessibilità della cromatina e dell'espressione genica. Un esempio di questa riprogrammazione è visto durante la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e il suo processo inverso, la transizione mesenchimale-epiteliale (MET), che sono noti per essere processi chiave di riprogrammazione c...

L'accessibilità della cromatina è un requisito chiave per la regolazione dell'espressione genica su scala genomica1. I cambiamenti nell'accessibilità della cromatina sono frequentemente associati a diversi stati patologici, incluso il cancro 2,3,4. Nel corso degli anni, sono state sviluppate numerose tecniche per consentire ai ricercatori di sondare il paesaggio della cromatina mappando le regioni di accessibilità della cromatina. Alcuni di essi includono DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7 e il focus di questo articolo, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq mappa le regioni accessibili impiegando una caratteristica chiave della DNasi, vale a dire la digestione preferenziale del DNA nudo privo di istoni e altre proteine come i fattori di trascrizione5. FAIRE-seq, simile a ChIP-seq, utilizza la reticolazione e la sonicazione della formaldeide, tranne che non è coinvolta alcuna immunoprecipitazione e le regioni prive di nucleosomi sono isolate mediante estrazione fenolo-cloroformio6. Il metodo MAPit utilizza una metiltransferasi GC per sondare la struttura della cromatinaalla risoluzione 7 della singola molecola. ATAC-seq si basa sulla trasposasi iperattiva, Tn58. La trasposasi Tn5 si lega preferenzialmente alle regioni aperte della cromatina e inserisce adattatori di sequenziamento in regioni accessibili. Tn5 opera attraverso un meccanismo "taglia e incolla" mediato dal DNA, in base al quale la trasposasi precaricata con adattatori si lega ai siti aperti della cromatina, taglia il DNA e lega gli adattatori8. Le regioni legate a Tn5 vengono recuperate mediante amplificazione PCR utilizzando primer che ricottura a questi adattatori. FAIRE-seq e DNase-seq richiedono una grande quantità di materiale di partenza (~ 100.000 celle a 225.000 celle) e una fase di preparazione della libreria separata prima del sequenziamento9. D'altra parte, il protocollo ATAC-seq è relativamente semplice e richiede un piccolo numero di cellule (<50.000 cellule)10. A differenza delle tecniche FAIRE-seq e DNase-seq, la preparazione della libreria di sequenziamento di ATAC-seq è relativamente semplice, poiché il campione di DNA isolato viene già taggato con gli adattatori di sequenziamento da Tn5. Pertanto, è necessaria solo la fase di amplificazione PCR con primer appropriati per completare la preparazione della libreria e non è necessario eseguire le fasi di elaborazione precedenti come la riparazione finale e la legatura dell'adattatore, risparmiando così tempo11. In secondo luogo, ATAC-seq evita la necessità di conversione, clonazione e amplificazione del bisolfito con primer specifici per regione richiesti per MAPit7. Grazie a questi vantaggi, ATAC-seq è diventato un metodo estremamente popolare per definire regioni di cromatina aperte. Sebbene il metodo ATAC-seq sia semplice, più passaggi richiedono l'ottimizzazione per ottenere dati di alta qualità e riproducibili. Questo manoscritto discute le procedure di ottimizzazione per la preparazione della libreria ATAC-seq standard, evidenziando in particolare tre parametri: (1) composizione del tampone di lisi, (2) concentrazione di Tn5 trasposasi e (3) numero di cellule. Inoltre, questo documento fornisce dati di esempio dalle condizioni di ottimizzazione utilizzando cellule epiteliali aderenti sia cancerose che non cancerose.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Natural</td></tr><tr><td>10 &micro; L XL TipOne punte</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>Filtrato e a bassa ritenzione</td></tr><tr><td>100 &; L XL TipOne Punte RPT</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td>Filtrate e a bassa ritenzione</td></tr><tr><td>100 &; L XL TipOne tips</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840</td><td>Filtrato e a bassa ritenzione. Provette</td></tr><tr><td>da centrifuga coniche da 15 mL</td> smussate <td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>20 &; L TipOne Punte RPT</td><td>USA Scientific</td><td>1183-1810</td><td>Filtrate e a bassa ritenzione</td></tr><tr><td>200 &; L TipOne Punte RPT</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td> Provette da centrifuga da 50 ml <td>filtrate e a bassa ritenzione</td></tr><tr><td>Fisherbrand</td><td></td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>YBP136010</td><td>Grado di analisi genetica</td></tr><tr><td>Tutte le linee cellulari utilizzate in questo studio sono ottenute da ATCC</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364658</td><td>SX2415</td></tr><tr><td>Perline AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Kit di purificazione</td></tr> delle <tr><td>perline CellDrop Cell Counter</td><td>DeNovix</td><td>CellDrop FL</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>BioUltra, anidro, &ge; 99% (titolazione)</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 100%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC615100020</td><td>Anidro; Fisher Scientific - Prodotti per la sterilizzazione Decon Labs</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino - Testato TET R</td><td>& D Systems</td><td>S10350</td><td>Triplo 0.1 &micro; m filtrato</td></tr><tr><td>Gibco DMEM 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td>[+] 4,5 g/L D-glucosio; [+] L-glutammina; [-] Piruvato di sodio</td></tr><tr><td>Gibco PBS 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Gibco Tripsina-EDTA 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>(0,25%), rosso fenolo</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>IBI Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glicina MilliporeSigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Qubit Fluorimetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MilliporeSigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Kit di purificazione del</td><td>DNA</td><td>Qiagen</td><td>28004</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>IBI Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>BioXtra, &ge; 98% (acidimetrico), pellet (anidro)</td></tr><tr><td>NEBNext ad alta fedeltà 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>Nextera Kit di preparazione del campione di DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td>2x TD e Tn5 Transposase</td></tr><tr><td>NP - 40 (IGEPAL CA-630)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I8896</td><td>per la biologia molecolare</td></tr><tr><td>PCR Sistema di rilevamento</td><td>BioRad</td><td>1855484</td><td>Sistema in tempo reale CFX384. C1000 Touch Termociclatore</td></tr><tr><td>TUBI</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1851</td><td>Certificato BioPerformance, adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen; Kit di quantificazione degli acidi nucleici</td></tr><tr><td>Quibit Provette per saggi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>MilliporeSigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Homemade-pH</td><td></td> <td>5.2</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>IBI Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix, 1,25 mL</td><td>BioRad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclatore</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure 0,2 mL PCR 8 provette Strisce</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td>TempPlate in polipropilene naturale senza flessione</td></tr><tr><td>TempPlate 384-WELL PCR PLATE</td><td>USA Scientific</td><td>1438-4700</td><td>Tacca singola. Polipropilene naturale</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>MilliporeSigma</td><td>648311</td><td>ULTROL Grade</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>IBI Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit</td><td>Illumina</td><td>PE-121-1003</td><td>accoppiato</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>BioXtra, liquido viscoso</td></tr><tr><td>Acqua</td><td>MilliporeSigma</td><td>W3500</td><td>filtrato sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari</td></tr></tbody></table>

ottimizzazione atac-seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

Il test per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) sonda l'accessibilità dell'acido desossiribonucleico (DNA) utilizzando la trasposasi Tn5 iperattiva. Tn5 taglia e lega gli adattatori per il sequenziamento ad alta produttività all'interno di regioni di cromatina accessibili. Nelle cellule eucariotiche, il DNA genomico è impacchettato in cromatina, un complesso di DNA, istoni e altre proteine, che funge da barriera fisica al meccanismo trascrizionale. In risposta a segnali estrinseci, i fattori di trascrizione reclutano complessi di rimodellamento della cromatina per consentire l'accesso al meccanismo trascrizionale per l'attivazione genica. Pertanto, l'identificazione delle regioni aperte della cromatina è utile quando si monitorano le attività del potenziatore e del promotore genico durante eventi biologici come la progressione del cancro. Poiché questo protocollo è facile da usare e ha un basso requisito di input cellulare, ATAC-seq è stato ampiamente adottato per definire regioni aperte della cromatina in vari tipi di cellule, comprese le cellule tumorali. Per una corretta acquisizione dei dati, è necessario considerare diversi parametri durante la preparazione delle librerie ATAC-seq. Tra questi, la scelta del tampone di lisi cellulare, la titolazione dell'enzima Tn5 e il volume iniziale delle cellule sono cruciali per la preparazione della libreria ATAC-seq nelle cellule tumorali. L'ottimizzazione è essenziale per generare dati di alta qualità. Qui, forniamo una descrizione dettagliata dei metodi di ottimizzazione ATAC-seq per i tipi di cellule epiteliali.

Per ottenere dati ATAC-seq di successo e di alta qualità, è importante ottimizzare le condizioni sperimentali. La preparazione della libreria ATAC-seq può essere suddivisa nelle cinque fasi principali (Figura 1), vale a dire lisi cellulare, tagmentazione (frammentazione e inserimento dell'adattatore da parte di Tn5), purificazione del DNA genomico, amplificazione PCR e analisi dei dati. Come processo iniziale, il tampone di lisi cellulare (isolamento nucleare) deve essere prima ottimizzato p...

ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.

Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

ATAC-seq ci consente di identificare lo stato delle regioni aperte della cromatina nel genoma, che è spesso alterato negli stati di malattia rispetto alla condizione normale. Meno input cellulare, un protocollo semplificato di digestione Tn5, seguito dall'isolamento del DNA frammentato e dalla preparazione della libreria mediante amplificazione PCR e tempi sperimentali più brevi la rendono una tecnica più vantaggiosa. Il confronto del paesaggio epigenetico alterato da ATAC-seq tra condizioni normali e patologiche può far luce sugli elementi regolatori della cromatina associati alla malattia ed essere utile per la progettazione di nuove strategie terapeutiche.Questa tecnica è facile da eseguire, in quanto non include passaggi sperimentali critici. Per ottenere risultati ATAC-seq di successo, sono necessari solo un paio di passaggi di standardizzazione. Per iniziare, trasferire 25 microlitri da una sospensione cellulare contenente un milione di cellule per millilitro in PBS a un tubo di microcentrifuga da 1,7 millilitri e centrifugare a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Scartare con attenzione il surnatante e aggiungere 25 microlitri di tampone di lisi. Risospendere le cellule facendo pipettare delicatamente su e giù e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare con cura il surnatante.Risospendere immediatamente il pellet in 25 microlitri di miscela di reazione Tn5 e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Mescolare la soluzione ogni 10 minuti. Aggiungere cinque microlitri di acetato di sodio a 3 molari e 125 microlitri di tampone PB alla soluzione di DNA marcata Tn5.Mescolare bene. Quindi, posizionare la colonna di rotazione in un tubo di raccolta da 2 millilitri e applicare il campione alla colonna di rotazione. Centrifugare a 17, 900 g per un minuto a temperatura ambiente e scartare il flusso attraverso.Aggiungere il buffer PE alla colonna e ruotare la colonna. Riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta e centrifugarla per cinque minuti per asciugare completamente la membrana. Scartare il flusso e posizionare la colonna di rotazione in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,7 millilitri.Eluire i frammenti di DNA con 10 microlitri di tampone EB e lasciare riposare la colonna per un minuto a temperatura ambiente. Quindi centrifugare a 17.900 G per un minuto a temperatura ambiente per eluire il DNA. Impostare la reazione PCR in provette PCR da 200 microlitri ed eseguire il programma di amplificazione PCR parte uno.Per la QPCR in tempo reale, preparare la miscela di reazione PCR aggiungendo cinque microlitri di prodotto PCR, 0,75 microlitri di SYBR Gold 1.000 volte diluito, cinque microlitri di 2X PCR Master Mix e 3,75 microlitri di acqua priva di nucleasi. Determinare il numero richiesto di cicli PCR aggiuntivi utilizzando i parametri di esecuzione. Una volta determinato il numero del ciclo, impostare le PCR con i cicli aggiuntivi calcolati in precedenza.Ai prodotti PCR amplificati, aggiungere 150 microlitri di perline e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per cinque minuti e rimuovere con attenzione il surnatante. Lavare le perle con 200 microlitri di etanolo all'80% e rimuovere il surnatante.Rimuovere completamente l'etanolo e asciugare all'aria i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, risospendere con 50 microlitri di tampone di eluizione. Posizionare il tubo su un supporto magnetico, quindi trasferire l'eluato in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri.Un confronto dell'efficienza della lisi cellulare usando il blu di tripano è mostrato qui. Le cellule NMuMG sono state trattate con un tampone ipotonico e tampone CSK e colorate con blu tripano. Una maggiore efficienza di lisi cellulare è stata osservata nelle cellule trattate con CSK.Le librerie ATAC-seq sono state preparate da cellule di cancro al seno MDA-MB-231. Dopo l'amplificazione della PCR, i prodotti PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio 0,5X TBE, 1,5% prima e dopo la purificazione delle perline. I primer vengono per lo più rimossi dalla purificazione iniziale delle perline.Sono inoltre indicati i pattern delle bande di DNA da 1X TAE 1% elettroforesi su gel di agarosio e un'elettroforesi automatizzata. SYBR Gold è stato utilizzato per visualizzare i frammenti di DNA mostrati qui. Una traccia del browser del genoma che mostra il locus ERS1 è presentata qui.La copertura del genoma dei dati ATAC-seq nelle cellule T47D è mostrata in questa immagine. Sono stati utilizzati primer di una precedente pubblicazione e le loro regioni target sono evidenziate in giallo. Qui è mostrato un grafico a barre che illustra l'arricchimento dell'amplicone del primer nelle librerie ATAC-seq.Le librerie ATAC-seq sono state preparate dal buffer ipotonico o da un buffer CSK. L'immagine rappresentativa mostra la visualizzazione del browser del genoma per l'ottimizzazione ATAC-seq. I dati ATAC-seq della condizione di input di 25.000 cellule hanno mostrato il più alto arricchimento di frammenti privi di nucleosomi, mentre la condizione di input di 100.000 cellule ha presentato il DNA mononucleosomiale più alto.Qui vengono presentate le tracce del browser del genoma che mostrano i dati ATAC-seq di diversi numeri di cella. L'analisi delle annotazioni di picco HOMER è rappresentata in questa immagine rappresentativa. HOMER ha classificato ogni picco come un promotore prossimale o distale picco.Il numero di input cellulare scelto del tampone di lisi cellulare e la concentrazione dell'enzima Tn5 dipendente dal tipo di cellula sono il parametro più critico che deve essere standardizzato. Tn5 fuso con la proteina A nella tecnica cut-and-tack è ampiamente utilizzato per identificare il sito di legame del DNA per una proteina di interesse utilizzando anticorpi specifici per quella proteina di interesse.

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Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing "prossima generazione". Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.

Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

Analisi per Transposase-accessibile della cromatina accoppiato con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo di genoma per scoprire accessibile della cromatina. Questo è un protocollo di ATAC-seq passo dopo passo, da molecolari all'analisi computazionale del finale, ottimizzato per i linfociti umani (Th1/Th2). Questo protocollo può essere adottato da ricercatori senza precedente esperienza nei metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Protocolli dettagliati per l'introduzione di un enzima derivati dal Spalato-TET2 (sidro) nelle cellule di mammiferi per chimica viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetici sono presentati.

Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un test per transposase-accessibile della cromatina (ATAC-seq) la sequenziazione su linfociti CD4 + umani. Il protocollo è stato modificato per ridurre al minimo la contaminazione letture di DNA mitocondriale dal 50% al 3% attraverso l'introduzione di un nuovo buffer di lisi.

ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

Qui, gli autori mostrano l'utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.

Analisi multiplexata dell'espressione genica retinica e dell'accessibilità alla cromatina utilizzando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Presentiamo un protocollo per il dosaggio della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) specificamente sugli adipociti utilizzando la selezione del nucleo con tessuti adiposi isolati da topi reporter transgenici con marcatura a fluorescenza nucleare.

ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

Questo manoscritto delinea un protocollo per la preparazione di una libreria ATAC-seq di neutrofili da midollo osseo murino, con l'obiettivo di garantire una vitalità ottimale dei neutrofili e un'elevata qualità della libreria. Offre istruzioni dettagliate sulla preparazione del BMC, lo smistamento immunomagnetico e la costruzione di librerie, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i neofiti dello studio dei neutrofili.

Libreria ATAC-Seq Preparazione di neutrofili derivati dal midollo osseo murino

Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq rapido e semplice da implementare nel verme intero Caenorhabditis elegans a stadio L4 utilizzando solo 30 μL di pellet di verme.

Profilazione dell'accessibilità della cromatina in larve intere di Caenorhabditis elegans L4

Scopri come ottimizzare ATAC-seq per tipi cellulari epiteliali nella ricerca sul cancro. Questo protocollo mappa l'accessibilità della cromatina per identificare elementi regolatori associati alla malattia e sviluppare nuove strategie terapeutiche.

Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

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