Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro
30 giugno 2022
ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.
ATAC-seq ci consente di identificare lo stato delle regioni aperte della cromatina nel genoma, che è spesso alterato negli stati di malattia rispetto alla condizione normale. Meno input cellulare, un protocollo semplificato di digestione Tn5, seguito dall'isolamento del DNA frammentato e dalla preparazione della libreria mediante amplificazione PCR e tempi sperimentali più brevi la rendono una tecnica più vantaggiosa. Il confronto del paesaggio epigenetico alterato da ATAC-seq tra condizioni normali e patologiche può far luce sugli elementi regolatori della cromatina associati alla malattia ed essere utile per la progettazione di nuove strategie terapeutiche.
Questa tecnica è facile da eseguire, in quanto non include passaggi sperimentali critici. Per ottenere risultati ATAC-seq di successo, sono necessari solo un paio di passaggi di standardizzazione. Per iniziare, trasferire 25 microlitri da una sospensione cellulare contenente un milione di cellule per millilitro in PBS a un tubo di microcentrifuga da 1,7 millilitri e centrifugare a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare con attenzione il surnatante e aggiungere 25 microlitri di tampone di lisi. Risospendere le cellule facendo pipettare delicatamente su e giù e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare con cura il surnatante.
Risospendere immediatamente il pellet in 25 microlitri di miscela di reazione Tn5 e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Mescolare la soluzione ogni 10 minuti. Aggiungere cinque microlitri di acetato di sodio a 3 molari e 125 microlitri di tampone PB alla soluzione di DNA marcata Tn5.
Mescolare bene. Quindi, posizionare la colonna di rotazione in un tubo di raccolta da 2 millilitri e applicare il campione alla colonna di rotazione. Centrifugare a 17, 900 g per un minuto a temperatura ambiente e scartare il flusso attraverso.
Aggiungere il buffer PE alla colonna e ruotare la colonna. Riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta e centrifugarla per cinque minuti per asciugare completamente la membrana. Scartare il flusso e posizionare la colonna di rotazione in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,7 millilitri.
Eluire i frammenti di DNA con 10 microlitri di tampone EB e lasciare riposare la colonna per un minuto a temperatura ambiente. Quindi centrifugare a 17.900 G per un minuto a temperatura ambiente per eluire il DNA. Impostare la reazione PCR in provette PCR da 200 microlitri ed eseguire il programma di amplificazione PCR parte uno.
Per la QPCR in tempo reale, preparare la miscela di reazione PCR aggiungendo cinque microlitri di prodotto PCR, 0,75 microlitri di SYBR Gold 1.000 volte diluito, cinque microlitri di 2X PCR Master Mix e 3,75 microlitri di acqua priva di nucleasi. Determinare il numero richiesto di cicli PCR aggiuntivi utilizzando i parametri di esecuzione. Una volta determinato il numero del ciclo, impostare le PCR con i cicli aggiuntivi calcolati in precedenza.
Ai prodotti PCR amplificati, aggiungere 150 microlitri di perline e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per cinque minuti e rimuovere con attenzione il surnatante. Lavare le perle con 200 microlitri di etanolo all'80% e rimuovere il surnatante.
Rimuovere completamente l'etanolo e asciugare all'aria i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, risospendere con 50 microlitri di tampone di eluizione. Posizionare il tubo su un supporto magnetico, quindi trasferire l'eluato in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri.
Un confronto dell'efficienza della lisi cellulare usando il blu di tripano è mostrato qui. Le cellule NMuMG sono state trattate con un tampone ipotonico e tampone CSK e colorate con blu tripano. Una maggiore efficienza di lisi cellulare è stata osservata nelle cellule trattate con CSK.
Le librerie ATAC-seq sono state preparate da cellule di cancro al seno MDA-MB-231. Dopo l'amplificazione della PCR, i prodotti PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio 0,5X TBE, 1,5% prima e dopo la purificazione delle perline. I primer vengono per lo più rimossi dalla purificazione iniziale delle perline.
Sono inoltre indicati i pattern delle bande di DNA da 1X TAE 1% elettroforesi su gel di agarosio e un'elettroforesi automatizzata. SYBR Gold è stato utilizzato per visualizzare i frammenti di DNA mostrati qui. Una traccia del browser del genoma che mostra il locus ERS1 è presentata qui.
La copertura del genoma dei dati ATAC-seq nelle cellule T47D è mostrata in questa immagine. Sono stati utilizzati primer di una precedente pubblicazione e le loro regioni target sono evidenziate in giallo. Qui è mostrato un grafico a barre che illustra l'arricchimento dell'amplicone del primer nelle librerie ATAC-seq.
Le librerie ATAC-seq sono state preparate dal buffer ipotonico o da un buffer CSK. L'immagine rappresentativa mostra la visualizzazione del browser del genoma per l'ottimizzazione ATAC-seq. I dati ATAC-seq della condizione di input di 25.000 cellule hanno mostrato il più alto arricchimento di frammenti privi di nucleosomi, mentre la condizione di input di 100.000 cellule ha presentato il DNA mononucleosomiale più alto.
Qui vengono presentate le tracce del browser del genoma che mostrano i dati ATAC-seq di diversi numeri di cella. L'analisi delle annotazioni di picco HOMER è rappresentata in questa immagine rappresentativa. HOMER ha classificato ogni picco come un promotore prossimale o distale picco.
Il numero di input cellulare scelto del tampone di lisi cellulare e la concentrazione dell'enzima Tn5 dipendente dal tipo di cellula sono il parametro più critico che deve essere standardizzato. Tn5 fuso con la proteina A nella tecnica cut-and-tack è ampiamente utilizzato per identificare il sito di legame del DNA per una proteina di interesse utilizzando anticorpi specifici per quella proteina di interesse.
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Panoramica
ATAC-seq è una potente tecnica di sequenziamento del DNA che mappa i cambiamenti di accessibilità della cromatina, in particolare nelle cellule tumorali. Questo protocollo fornisce procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, migliorando la nostra comprensione dei meccanismi della malattia.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Genomica
- Biologia del cancro
Sfondo
- ATAC-seq identifica regioni di cromatina aperta nel genoma.
- L'accessibilità della cromatina è spesso alterata negli stati di malattia.
- La tecnica richiede meno cellule e semplifica il processo sperimentale.
- Aiuta a comprendere gli elementi regolatori della cromatina associati alle malattie.
Obiettivo dello studio
- Ottimizzare ATAC-seq per i tipi di cellule epiteliali.
- Confrontare i paesaggi epigenetici tra condizioni normali e di malattia.
- Facilitare la progettazione di nuove strategie terapeutiche.
Metodi utilizzati
- Trasferimento della sospensione cellulare in tubi microcentrifuga.
- Centrifugazione a 500 G per cinque minuti a 4°C.
- Digestione Tn5 per la frammentazione del DNA.
- Amplificazione PCR per la preparazione della libreria.
Risultati principali
- Identificazione con successo dei cambiamenti di accessibilità della cromatina.
- Dimostrazione dei vantaggi di ATAC-seq rispetto ai metodi tradizionali.
- Intuizioni sugli elementi regolatori della cromatina associati alle malattie.
- Le fasi di standardizzazione portano a risultati affidabili.
Conclusioni
- ATAC-seq è una tecnica facile da usare per studiare la dinamica della cromatina.
- Fornisce preziose intuizioni sulla biologia del cancro.
- Le procedure di ottimizzazione migliorano l'applicabilità della tecnica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
ATAC-seq optimization enables high-resolution mapping of chromatin accessibility in cancer cells, directly informing target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery pipelines. Standardized protocols for cell lysis, enzyme titration, and input volume ensure reproducible, quantitative data critical for early-stage decision-making. This workflow supports portfolio triage by clarifying epigenetic regulatory elements linked to disease progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin accessibility changes associated with oncogenic transformation.
- Supports functional validation of regulatory elements and enhancer activity in cancer models.
- Provides mechanistic insight for de-risking target hypotheses in epigenetic drug discovery.
- Facilitates prioritization of candidate targets based on disease-relevant chromatin states.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, low-input protocols suitable for diverse cancer cell types.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of chromatin accessibility for assay development.
- Enables robust comparison of epigenetic states across experimental conditions.
- Prepares validated libraries for downstream sequencing and high-throughput analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin accessibility profiles with disease progression and biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic targets.
- Provides data for risk-adjusted advancement of candidate therapeutics targeting chromatin regulators.
- Enhances predictive confidence in translational models by mapping regulatory element activity.
Pipeline & Workflow Integration
ATAC-seq optimization is positioned at the interface of early discovery and lead identification, enabling robust hypothesis testing and pathway clarification in cancer epigenetics.
- Discovery Biology: Quantifies chromatin accessibility to clarify regulatory mechanisms and validate disease-relevant targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-resolution readouts for comparative analysis of chromatin states and peak annotation.
- Translational Research: Links open chromatin regions to disease biomarkers and therapeutic response predictors.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse cancer models and epigenetic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protocols for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by clarifying epigenetic drivers.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets and therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology and next-generation sequencing workflows.
- Demands access to high-quality reagents, Tn5 enzyme, and sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of cell lysis, enzyme titration, and input volume.
- Must be adapted for specific cancer cell types and experimental conditions.
- Optimization of critical parameters is essential for high-quality, interpretable data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Cell Lysis and Tn5 Tagmentation
1:52
DNA Purification
2:57
PCR Amplification
3:43
Beads Purification
4:26
Results: Comparison of TSS Enrichment Scores and Differential Peaks Obtained Using Optimized Cell‐Lysis Buffers, Cell Number Input, and Tn5 Concentration of ATAC‐Seq Libraries
6:33
Conclusion
