Name: Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Scopri come quantificare le interazioni tra vettori farmacologici e cellule in vitro mediante citometria a flusso. Questo metodo fornisce dati quantitativi essenziali per l'ottimizzazione dei sistemi di drug delivery.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; GNT1149990), il Centro australiano per la ricerca sull'HIV e la virologia dell'epatite (ACH2), nonché un dono della tenuta di Réjane Louise Langlois. F.C. riconosce l'assegnazione di una borsa di ricerca principale senior del National Health and Medical Research Council (NHMRC) (GNT1135806). La Figura 1 e la Figura 2 sono state create con BioRender.com.

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<li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li>
<li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La caratterizzazione delle interazioni tra vettori di farmaci e cellule sta diventando sempre più importante nello sviluppo di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. In particolare, per consentire la valutazione razionale e il confronto di vari costrutti di portatori, è fondamentale quantificare in modo assoluto le prestazioni di detto vettore per interagire con cellule target e off-target. Questo protocollo descrive una metodologia a due flussi che consente a qualsiasi ricercatore che lavora con un vettore di far...

La progettazione di costrutti di somministrazione di farmaci che mostrano un comportamento specifico e progettato a seconda del tipo di cellula che incontrano ha attirato un notevole interesse di ricerca. I potenziali costrutti di somministrazione di farmaci o "vettori" includono formulazioni lipidiche, inorganici nano-coltivati, assemblaggi polimerici, vescicole extracellulari, cellule batteriche funzionalizzate o virus modificati. Tutti questi possono mostrare specificità di organi, tessuti o cellule a causa di proprietà fisiche, proprietà superficiali o funzionalizzazioni chimiche ingegnerizzate come l'attacco anticorpale 1,2.
Un passo quasi onnipresente nella valutazione del vettore in vitro è quello di incubare le cellule con una sospensione contenente detto vettore caricato di farmaco. Dopo l'incubazione, le prestazioni del vettore vengono misurate tramite una lettura funzionale delle prestazioni del carico di droga, ad esempio l'efficienza di trasfezione o la tossicità. Le letture funzionali sono utili, in quanto sono una misura a valle dell'efficacia del vettore. Tuttavia, per costrutti di somministrazione di farmaci più complessi, è sempre più importante andare oltre le letture funzionali e quantificare separatamente il grado di interazione del vettore con la cellula di interesse. Ci sono alcune ragioni per questo.
In primo luogo, c'è un crescente interesse nella scoperta (e nel miglioramento iterativo) di tecnologie di trasporto "piattaforma", che possono trasportare una varietà di merci. Ad esempio, le nanoparticelle lipidiche (LNP) progettate per incapsulare l'RNA possono scambiare una sequenza di RNA con un'altra con pochi avvertimenti3. Pertanto, per migliorare iterativamente la tecnologia del vettore, è fondamentale quantificarne le prestazioni indipendentemente dalla funzionalità del carico. In secondo luogo, le letture funzionali potrebbero non essere semplici per il carico di interesse, compromettendo la capacità di iterare e valutare rapidamente le formulazioni del vettore. Mentre si potrebbe eseguire l'ottimizzazione in vitro utilizzando un modello di carico con una semplice lettura funzionale (ad esempio, fluorescenza), la modifica del carico può cambiare la risposta biologica a un vettore4 e può, quindi, non produrre risultati rappresentativi. In terzo luogo, molti portatori sono progettati per interagire ed essere assorbiti da un tipo di cellula specifico. Tale capacità di targeting di un vettore può e deve essere differenziata dalle prestazioni del suo targeting terapeutico del carico di carico. Per continuare l'esempio LNP, un carico di RNA potrebbe essere estremamente potente, ma se l'LNP non è in grado di legarsi alla cellula, essere internalizzato e rilasciare l'RNA, non si osserverà alcun effetto funzionale a valle. Questo può essere un problema in particolare per i portatori destinati a colpire tipi di cellule difficili da trasfettare, come le cellule T5. Al contrario, un LNP potrebbe colpire in modo estremamente efficace, ma il carico di RNA potrebbe non funzionare. Un test a valle che si limiti a misurare la funzionalità del carico non sarà in grado di distinguere tra queste due situazioni, complicando così lo sviluppo e l'ottimizzazione dei sistemi di somministrazione di farmaci carrier.
In questo lavoro, viene discusso come quantificare assolutamente l'associazione del vettore. Associazione è un termine che si riferisce al grado di interazione misurato sperimentalmente tra un vettore e una cellula. L'associazione non distingue tra legame di membrana e internalizzazione: un vettore può essere associato perché è legato alla superficie cellulare o perché la cellula l'ha interiorizzata. L'associazione è comunemente misurata come parte degli esperimenti di incubazione del vettore cellulare. Storicamente, l'associazione è stata riportata sia in unità fluorescenti arbitrarie (tipicamente "intensità di fluorescenza mediana" o MFI) o come "associazione percentuale", metriche le cui limitazioni sono state precedentemente discusse6. In breve, queste misurazioni non sono comparabili tra esperimenti, laboratori e vettori di farmaci a causa delle differenze nei protocolli sperimentali, nelle impostazioni del citometro a flusso e nelle intensità di etichettatura dei diversi vettori. Sono stati fatti sforzi per superare il primo calibrando il citometro, convertendo così la misura relativa delle IFM in una misura assolutamente quantitativa della fluorescenza7. Tuttavia, questo metodo non tiene conto della variabilità dell'intensità di etichettatura dei vari vettori e, quindi, non consente il confronto razionale delle varie prestazioni del vettore in una cella target di scelta8.
Qui, come convertire praticamente da unità fluorescenti relative e arbitrarie alla metrica quantitativa assoluta del "numero di portatori per cella" è dimostrato eseguendo un piccolo numero di ulteriori esperimenti di caratterizzazione. Se si desidera un'altra metrica di concentrazione del vettore (ad esempio, massa portante per cella o volume portante per cella), è semplice convertire da portatori per cella, a condizione che sia stata eseguita la caratterizzazione del vettore. Per brevità e per evitare il gergo, la parola "vettore" è usata all'interno di questo lavoro per riferirsi al vasto assortimento di costrutti di somministrazione di farmaci. Queste tecniche di quantificazione sono ugualmente applicabili, sia applicate a una particella d'oro nano-ingegnerizzata o a un batterio bio-ingegnerizzato.
Alcuni fatti consentono la conversione da unità fluorescenti arbitrarie a vettori per cella. In primo luogo, l'intensità di fluorescenza misurata è proporzionale alla concentrazione di un fluoroforo9 (o di un vettore marcato con fluorescenza), supponendo che la fluorescenza rientri nei limiti di rilevazione dello strumento e che le impostazioni della strumentazione siano le stesse. Pertanto, se la fluorescenza di un vettore e la fluorescenza di un campione sono note, si può determinare quanti portatori sono presenti in quel campione se tutte le misurazioni sono state eseguite nelle stesse impostazioni e condizioni. Tuttavia, soprattutto per i vettori più piccoli, potrebbe non essere possibile misurare la fluorescenza del vettore, l'autofluorescenza cellulare e la fluorescenza associata alle cellule sullo stesso strumento con le stesse impostazioni. In questo caso, esiste un secondo requisito per rendere possibile la conversione tra fluorescenza misurata su uno strumento e fluorescenza misurata su un altro. Per fare ciò, è possibile stabilire una curva standard della concentrazione di fluorofori per misurare l'intensità della fluorescenza su entrambi gli strumenti, sfruttando lo standard MESF (Molecules of Equivalent Solubili Fluorochrome)9. Ciò consente quindi la misurazione della fluorescenza del vettore in massa su un non citometro, una misurazione che può essere eseguita su portatori di qualsiasi dimensione o caratteristica. Quando tale quantificazione di massa viene effettuata su una sospensione portante di concentrazione nota, il numero di portatori per cellula di un campione può, ancora una volta, essere calcolato.
Mentre questo lavoro dimostra il processo per misurare l'associazione dei portatori (come determinato dall'intensità di fluorescenza misurata), un protocollo analogo potrebbe essere eseguito per altre misure di interazione cellula-vettore (ad esempio, un protocollo sperimentale che differenzia i portatori internalizzati e legati alla membrana). Inoltre, questo protocollo sarebbe in gran parte lo stesso se l'associazione fosse misurata attraverso un saggio non fluorescente (ad esempio, attraverso la citometria di massa).

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A20347</td><td>colorante a pH stabile utilizzato per etichettare portatori PMASH a 633 nm da 150 nm, 235 nm o 633 nm; esempio di buon colorante da utilizzare negli studi di associazione cellula-portatore</td></tr><tr><td>Apogee A50 Microflow</td><td>Apogee</td><td></td><td>Citometro a flusso sensibile in grado di rilevare piccoli portatori per il conteggio</td></tr><tr><td>Citometro a flusso CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Citometro a flusso sensibile in grado di rilevare piccoli vettori per il conteggio e leggere per gli esperimenti finali di barriera cellulare</td></tr><tr><td>Software FCS Express</td><td>De Novo Software</td><td></td><td>utilizzato per analizzare i dati della citometria a flusso, ovvero eseguire il gating e derivare i valori mediani di intensità della fluorescenza delle popolazioni scelte. Le alternative includono FlowJo, OMIQ, Python</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO</td><td>Tecan Lifesciences</td><td></td><td>Strumento standard per la lettura di micropiastre utilizzato per le misure di fluorescenza di massa di vettori in soluzione</td></tr><tr><td>LSRFortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citometro a flusso meno sensibile, ma più generalmente disponibile per i ricercatori. Può essere utilizzato per leggere l'esperimento finale del vettore cellulare</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Instrument utilizzato per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle</td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Software utilizzato per rappresentare graficamente e calcolare curve standard. Le alternative includono Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python e molti altri,</td></tr><tr><td>kit MESF quantistici, Alexa Fluor 647</td>, <td>Bangs Laboratories</td><td>647</td>, <td>perle di quantificazione assoluta per citometria a flusso. Utilizzato per convertire le intensità di fluorescenza misurate in massa su un lettore di micropiastre in intensità di fluorescenza misurate su un citometro a flusso utilizzando lo standard MESF</td></tr></tbody></table>

quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

Una componente importante della progettazione di sistemi di somministrazione di farmaci riguarda come amplificare o attenuare le interazioni con specifici tipi di cellule. Ad esempio, un chemioterapico potrebbe essere funzionalizzato con un anticorpo per migliorare il legame alle cellule tumorali ("targeting") o funzionalizzato con glicole polietilenico per aiutare a eludere il riconoscimento delle cellule immunitarie ("stealth"). Anche a livello cellulare, ottimizzare il legame e l'assorbimento di un vettore di farmaci è un problema di progettazione biologica complesso. Pertanto, è importante separare la forza con cui un nuovo vettore interagisce con una cella dall'efficacia funzionale del carico di un vettore una volta consegnato a quella cella.
Per continuare l'esempio chemioterapico, "quanto bene si lega a una cellula tumorale" è un problema separato da "quanto bene uccide una cellula tumorale". I saggi quantitativi in vitro per questi ultimi sono ben consolidati e di solito si basano sulla misurazione della vitalità. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche pubblicate sulle interazioni cellula-vettore è qualitativa o semiquantitativa. Generalmente, queste misurazioni si basano sull'etichettatura fluorescente del vettore e, di conseguenza, riportano interazioni con le cellule in unità relative o arbitrarie. Tuttavia, questo lavoro può essere standardizzato ed essere reso assolutamente quantitativo con un piccolo numero di esperimenti di caratterizzazione. Tale quantificazione assoluta è preziosa, in quanto facilita confronti razionali, inter- e intra-classe di vari sistemi di somministrazione di farmaci: nanoparticelle, microparticelle, virus, coniugati anticorpo-farmaco, cellule terapeutiche ingegnerizzate o vescicole extracellulari.
Inoltre, la quantificazione è un prerequisito per successive meta-analisi o approcci di modellazione in silico . In questo articolo vengono presentate le guide video e un albero decisionale su come ottenere la quantificazione in vitro per i sistemi di somministrazione di farmaci carrier, che tengono conto delle differenze nelle dimensioni del vettore e nella modalità di etichettatura. Inoltre, vengono discusse ulteriori considerazioni per la valutazione quantitativa dei sistemi avanzati di somministrazione di farmaci. Questo è destinato a servire come una risorsa preziosa per migliorare la valutazione razionale e la progettazione per la prossima generazione di medicina.

Come discusso in precedenza, diversi tipi di vettori di farmaci richiedono l'uso di tecniche diverse per la quantificazione assoluta dell'associazione cellula-vettore. Ad esempio, le particelle del guscio centrale di poli(acido metacrilico) (PMASH) stabilizzate con disolfuro a 633 nm sono abbastanza grandi e dense per il rilevamento utilizzando un citometro a flusso sensibile. Come tali, queste particelle sono state etichettate in modo fluorescente, quindi controllate e contate utilizzando la diffusione della ...

Viene dimostrato un flusso di lavoro per la quantificazione assoluta delle interazioni farmaco-cellula trasportatrice utilizzando la citometria a flusso per consentire una migliore valutazione razionale di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. Questo flusso di lavoro è applicabile ai vettori di droga di qualsiasi tipo.

Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

Questo protocollo fornisce dati quantitativi su come i sistemi carrier interagiscono con le cellule. I dati quantitativi sono fondamentali per l'ingegneria e l'ottimizzazione. Ci permette di passare da domande biologiche sì o no, a quante domande.Questa tecnica è utile per convertire i risultati delle prestazioni precliniche dei vettori di farmaci, che erano qualitativi, in risultati quantitativi. E questo funziona anche quando si caratterizza il vettore su un sistema diverso da quello che si caratterizzano le cellule. Possono essere necessarie alcune iterazioni per trovare la diluizione ottimale del vettore che rientra negli intervalli lineari o quantitativi del lato nano.Prenditi il tuo tempo per trovare le giuste condizioni. Per iniziare, montare la cella di flusso sul modulo laser. Lavare lentamente la cella di flusso alla velocità di 0,1 millilitri al secondo con un millilitro di acqua distillata.Se si formano bolle all'interno della cella di flusso, ritrarre parzialmente la sospensione per unire la bolla con l'interfaccia aria-liquido prima di procedere. Quindi bloccare l'intero modulo laser in posizione all'interno dello strumento. Avviare la fotocamera all'incirca a metà del lavaggio.Assicurati di confermare che i detriti del vettore siano stati lavati. Selezionare acquisizione per aprire la scheda delle impostazioni di acquisizione e fare clic su Avvia fotocamera. Guida il sistema con un millilitro d'aria.Se sullo schermo sono visibili supporti statici, pulire la cella di flusso seguendo le istruzioni del produttore. Preparare i vettori per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, assicurandosi che i vettori siano ben sospesi tramite sonicazione o vortice, a seconda del sistema di trasporto coinvolto. Diluire i supporti in acqua per preparare almeno da 0,6 a un millilitro di ciascun campione con una concentrazione di supporto compresa tra 1x10 e 1x10 al nono supporto per millilitro.Estrarre il modulo laser e posizionarlo in posizione verticale. Far cadere il primo campione di supporto in una siringa da un millilitro e collegare la siringa all'ingresso del tubo. Quindi caricare con attenzione il campione nella cella di flusso.Se si formano bolle all'interno della cella di flusso, ritrarre parzialmente la sospensione per unire la bolla con l'interfaccia aria-liquido prima di procedere. Assicurarsi che l'intera cella di flusso sia piena di liquido, quindi mettere in pausa il caricamento. Regolare la messa a fuoco della fotocamera, se necessario, per visualizzare i singoli operatori.Effettuare regolazioni grossolane della messa a fuoco con la manopola rotante sul lato destro dello strumento. Effettua regolazioni più precise selezionando la scheda hardware. Modificare la messa a fuoco regolando il cursore di messa a fuoco.Per assicurarti che non ci sia sovrasaturazione, seleziona il livello ottimale della fotocamera regolando il cursore all'interno della scheda di acquisizione. Se lo strumento è dotato di questo accessorio, caricare la siringa contenente il campione di supporto nella pompa della siringa. Nella scheda SOP, selezionare la misurazione standard per acquisire cinque acquisizioni di 30 secondi ciascuna.Immettere il nome del file di base e, se lo si desidera, aggiungere ulteriori informazioni di esempio facendo clic sul pulsante avanzato che aprirà un dialogo modale con varie scelte. Premi crea ed esegui script e attendi che appaia un pop-up che chiede di anticipare il campione. Se si utilizza la pompa a siringa, selezionare la scheda hardware e quindi la scheda pompa a siringa.Impostare la velocità di infusione desiderata e premere l'infusione. Se non si utilizza la pompa a siringa, far avanzare manualmente il campione. Nella finestra popup, selezionare OK per avviare l'acquisizione.Dopo ciascuna delle cinque acquisizioni, quando riappare il pop-up del campione avanzato, verificare che il campione si stia ancora muovendo attraverso la cella di flusso. Quindi selezionare OK per procedere con l'acquisizione successiva. Nella scheda processo, regolare il dispositivo di scorrimento della soglia di rilevamento tra quattro e otto per identificare correttamente i vettori distinti visibili sullo schermo.È possibile regolare il guadagno dello schermo per facilitare la visualizzazione, non influirà sull'analisi a valle. Nel popup, premere OK per avviare l'analisi di tracciamento. Monitorare l'avanzamento dell'analisi facendo clic sulla scheda Analisi in una singola analisi.Una volta terminata l'analisi, cerca che venga visualizzata una richiesta di impostazioni di esportazione. Verifica che il riepilogo dell'esperimento include PDF e include sia selezionato. Selezionare qualsiasi altro formato di esportazione desiderato.Nella sezione dei risultati dell'esportazione dei dati PDF, per garantire che la concentrazione misurata sia affidabile, verificare che la concentrazione del supporto misurato sia compresa tra 1x10 e il settimo e 1x10 al nono supporto per millilitro e verificare la presenza di eventuali messaggi di errore o messaggi di cautela sotto il risultato della misurazione della concentrazione. Ripetere la procedura due o più volte con diluizioni diverse dal materiale e assicurarsi che la concentrazione di ciascun campione rientri nell'intervallo lineare dello strumento. Calcolare la concentrazione del portatore come descritto nel manoscritto testuale.Preparare la soluzione di fluorocromo coniugato libero o anticorpo come descritto nel manoscritto testuale. Calcolare la concentrazione della soluzione madre dalla concentrazione, dal peso molecolare e dal numero di Avogadro come mostrato nell'equazione. Quindi eseguire una diluizione seriale del colorante nel diluente portante per generare campioni di curva standard.Quindi aggiungere il campione di supporto alla piastra di misurazione e misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre. Generare la curva standard come descritto nel testo manuscritto. Calcolare l'intensità assoluta di fluorescenza per vettore dividendo la fluorescenza di massa per la concentrazione del vettore.Impostare il citometro a flusso per l'esperimento finale della cella portante determinando le impostazioni ottimali della tensione PMT nei canali pertinenti. Eseguire un campione di controllo negativo in cui le cellule non sono incubate con vettori per determinare la fluorescenza di fondo. Preparare e risospendere le sfere di quantificazione della citometria a flusso.Utilizzare lo stesso buffer utilizzato per i campioni di celle. Se le popolazioni di perline sono fornite separatamente, tirarle insieme. Eseguire il cordone di quantificazione della citometria a flusso e i campioni di cellule portatrici per determinare l'intensità della fluorescenza per cellula.Eseguire le sfere di quantificazione del citometro a flusso per generare una curva standard, convertendo l'intensità fluorescente assoluta in MFI. Utilizzare questo per calcolare l'IFM teorico dei vettori come descritto nel manoscritto di testo. Eseguire i campioni del vettore cellulare per determinare l'intensità fluorescente per cella di ciascun campione.Infine, calcolare il numero di vettori per cella per ciascun campione sottraendo la fluorescenza di fondo dalla fluorescenza misurata del campione e quindi dividendo per la fluorescenza per particella. Per le particelle del guscio del nucleo di acido polimetacrilico a 633 nanometri, la concentrazione e l'intensità fluorescente per vettore sono state quantificate direttamente utilizzando il flusso citometrico. Al contrario, le nanoparticelle di ossido di ferro super paramagnetico a 100 nanometri erano troppo piccole per essere rilevate individualmente e sono state analizzate utilizzando il flusso di massa.Le perle di quantificazione etichettate sono state utilizzate per più giorni per generare curve standard su un citometro a flusso. La correlazione tra l'IFM misurata e il valore MESF delle sfere di quantificazione era lineare e sostanzialmente simile tra le date misurate. Gli esperimenti con cellule HeLa marcate fluorescenti con capsule di acido polimetacrilico a 235 nanometri da zero a 24 ore hanno mostrato un aumento dell'MFI nel tempo, indicando che le capsule si stavano associando alle cellule HeLa.La differenza nella risposta cellulare apparente ai portatori era netta, a seconda della quantificazione relativa o assoluta. La quantificazione assoluta era indipendente dall'intensità dell'etichettatura e quindi più comparabile. Queste tecniche sono la base per un'analisi e un confronto più approfonditi delle prestazioni delle particelle.Siamo entusiasti di utilizzare queste tecniche per parametrizzare modelli matematici che ci permetteranno di caratterizzare le prestazioni delle particelle indipendentemente da qualsiasi particolare esperimento.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Bioimmagini metodi utilizzati per valutare biodistribuzione delle cellule di nanoparticelle sono applicabili per il monitoraggio terapeutico e diagnostico di composti nanoformulated. I metodi descritti nel presente documento sono sensibili e specifici, quando valutati da coregistrazione istologici. Le metodologie di fornire un percorso traslazionale da roditore a applicazioni sull'uomo.

Bioimmagini registrato di Nanomateriali per il monitoraggio diagnostico e terapeutico

Microdisegni adesivo che normalizzano architettura cellulare può essere utilizzato per aumentare la sensibilità nella rilevazione degli effetti dei farmaci, migliorare la riproducibilità e semplificare l'acquisizione automatica delle immagini e analisi. Tale tecnologia andrà a beneficio della droga / siRNA test di screening, eseguite su supporti convenzionali coltura cellulare e quindi soffrono di un eccessivo cellula-cellula variabilità.

Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

Molte applicazioni terapeutiche richiedono un trasporto sicuro ed efficiente dei vettori della droga e dei loro carichi attraverso le barriere cellulari nel corpo. Questo articolo descrive un adattamento di metodi consolidati per valutare il tasso e il meccanismo di trasporto di nanocarriers droga (NCS) attraverso le barriere cellulari, come il tratto gastrointestinale (GI) epitelio.

Modelli e metodi per valutare il trasporto di Drug Delivery Systems attraverso le barriere cellulari

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere la preparazione e la caratterizzazione di farmaci fisicamente intrappolati e scarsamente solubili in acqua in sistemi di somministrazione di farmaci micellari composti da copolimeri a blocchi anfifilici.

Preparazione e caratterizzazione di individuale e Multi-droga Loaded Fisicamente intrappolate polimerici Micelle

Le nanoparticelle stanno emergendo sistemi di drug delivery come promettenti per una vasta gamma di indicazioni. Qui, descriviamo un metodo semplice ma potente per la produzione di nanoparticelle di seta con reverse engineering di seta Bombyx mori. Queste nanoparticelle di seta possono essere facilmente caricati con un carico utile terapeutica e successivamente esplorato per le applicazioni di consegna della droga.

Fabbricazione e consegna della droga Applicazioni di seta nanoparticelle

La scarsa comprensione delle prestazioni in vivo delle nanomedicine ostacola la loro traduzione clinica. Qui sono descritte le procedure per valutare il comportamento in vivo dei nanofarmaci antitumorali a livello sistemico, tissutale, di singola cellula e subcellulare in topi immunocompetenti portatori di tumore. Questo approccio può aiutare i ricercatori a identificare promettenti nanofarmaci antitumorali per la traduzione clinica.

Una procedura completa per valutare il<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestazioni del Cancro nanomedicina

Formazione immagine della vivere-cella è un potente strumento per la visualizzazione di processi dinamici. L'esame delle cellule fisse fornisce solo immagini statiche, che possono portare a interpretazioni erronee e confusione circa il processo. Questo lavoro presenta un metodo per studiare l'assorbimento, rilascio di farmaci e localizzazione intracellulare di nanoparticelle liposomiale in cellule viventi.

Utilizzo In Vitro cellule vive di Imaging per esplorare chemioterapici consegnato da nanoparticelle di basata sui lipidi

Questo protocollo descrive un processo analitico efficiente e conveniente di estrazione del campione e determinazione simultanea di più farmaci, doxorubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e un metabolita DOX cardio-tossici, doxorubicinolo (DOXol), nel biologico campioni da un modello di tumore al seno preclinici trattati con nanoparticelle formulazioni della combinazione sinergica di farmaci.

Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

Qui, presentiamo metodi dettagliati per la preparazione e la valutazione del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo.

Preparazione, caratteristiche, tossicità e valutazione dell'efficacia del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo

Introduciamo quattro metodi per valutare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate utilizzando tecniche in vitro . Questi metodi possono essere adattati per studiare le interazioni di diverse nanoparticelle e superfici nanostrutturate con una vasta gamma di specie microbiche.

Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate in vitro

Scopri come quantificare le interazioni tra vettori farmacologici e cellule in vitro mediante citometria a flusso. Questo metodo fornisce dati quantitativi essenziali per l'ottimizzazione dei sistemi di drug delivery.

Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina (Video) | JoVE Journal

Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

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