Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

Questo protocollo fornisce dati quantitativi su come i sistemi carrier interagiscono con le cellule. I dati quantitativi sono fondamentali per l'ingegneria e l'ottimizzazione. Ci permette di passare da domande biologiche sì o no, a quante domande.

Questa tecnica è utile per convertire i risultati delle prestazioni precliniche dei vettori di farmaci, che erano qualitativi, in risultati quantitativi. E questo funziona anche quando si caratterizza il vettore su un sistema diverso da quello che si caratterizzano le cellule. Possono essere necessarie alcune iterazioni per trovare la diluizione ottimale del vettore che rientra negli intervalli lineari o quantitativi del lato nano.

Prenditi il tuo tempo per trovare le giuste condizioni. Per iniziare, montare la cella di flusso sul modulo laser. Lavare lentamente la cella di flusso alla velocità di 0,1 millilitri al secondo con un millilitro di acqua distillata.

Se si formano bolle all'interno della cella di flusso, ritrarre parzialmente la sospensione per unire la bolla con l'interfaccia aria-liquido prima di procedere. Quindi bloccare l'intero modulo laser in posizione all'interno dello strumento. Avviare la fotocamera all'incirca a metà del lavaggio.

Assicurati di confermare che i detriti del vettore siano stati lavati. Selezionare acquisizione per aprire la scheda delle impostazioni di acquisizione e fare clic su Avvia fotocamera. Guida il sistema con un millilitro d'aria.

Se sullo schermo sono visibili supporti statici, pulire la cella di flusso seguendo le istruzioni del produttore. Preparare i vettori per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, assicurandosi che i vettori siano ben sospesi tramite sonicazione o vortice, a seconda del sistema di trasporto coinvolto. Diluire i supporti in acqua per preparare almeno da 0,6 a un millilitro di ciascun campione con una concentrazione di supporto compresa tra 1x10 e 1x10 al nono supporto per millilitro.

Estrarre il modulo laser e posizionarlo in posizione verticale. Far cadere il primo campione di supporto in una siringa da un millilitro e collegare la siringa all'ingresso del tubo. Quindi caricare con attenzione il campione nella cella di flusso.

Se si formano bolle all'interno della cella di flusso, ritrarre parzialmente la sospensione per unire la bolla con l'interfaccia aria-liquido prima di procedere. Assicurarsi che l'intera cella di flusso sia piena di liquido, quindi mettere in pausa il caricamento. Regolare la messa a fuoco della fotocamera, se necessario, per visualizzare i singoli operatori.

Effettuare regolazioni grossolane della messa a fuoco con la manopola rotante sul lato destro dello strumento. Effettua regolazioni più precise selezionando la scheda hardware. Modificare la messa a fuoco regolando il cursore di messa a fuoco.

Per assicurarti che non ci sia sovrasaturazione, seleziona il livello ottimale della fotocamera regolando il cursore all'interno della scheda di acquisizione. Se lo strumento è dotato di questo accessorio, caricare la siringa contenente il campione di supporto nella pompa della siringa. Nella scheda SOP, selezionare la misurazione standard per acquisire cinque acquisizioni di 30 secondi ciascuna.

Immettere il nome del file di base e, se lo si desidera, aggiungere ulteriori informazioni di esempio facendo clic sul pulsante avanzato che aprirà un dialogo modale con varie scelte. Premi crea ed esegui script e attendi che appaia un pop-up che chiede di anticipare il campione. Se si utilizza la pompa a siringa, selezionare la scheda hardware e quindi la scheda pompa a siringa.

Impostare la velocità di infusione desiderata e premere l'infusione. Se non si utilizza la pompa a siringa, far avanzare manualmente il campione. Nella finestra popup, selezionare OK per avviare l'acquisizione.

Dopo ciascuna delle cinque acquisizioni, quando riappare il pop-up del campione avanzato, verificare che il campione si stia ancora muovendo attraverso la cella di flusso. Quindi selezionare OK per procedere con l'acquisizione successiva. Nella scheda processo, regolare il dispositivo di scorrimento della soglia di rilevamento tra quattro e otto per identificare correttamente i vettori distinti visibili sullo schermo.

È possibile regolare il guadagno dello schermo per facilitare la visualizzazione, non influirà sull'analisi a valle. Nel popup, premere OK per avviare l'analisi di tracciamento. Monitorare l'avanzamento dell'analisi facendo clic sulla scheda Analisi in una singola analisi.

Una volta terminata l'analisi, cerca che venga visualizzata una richiesta di impostazioni di esportazione. Verifica che il riepilogo dell'esperimento include PDF e include sia selezionato. Selezionare qualsiasi altro formato di esportazione desiderato.

Nella sezione dei risultati dell'esportazione dei dati PDF, per garantire che la concentrazione misurata sia affidabile, verificare che la concentrazione del supporto misurato sia compresa tra 1x10 e il settimo e 1x10 al nono supporto per millilitro e verificare la presenza di eventuali messaggi di errore o messaggi di cautela sotto il risultato della misurazione della concentrazione. Ripetere la procedura due o più volte con diluizioni diverse dal materiale e assicurarsi che la concentrazione di ciascun campione rientri nell'intervallo lineare dello strumento. Calcolare la concentrazione del portatore come descritto nel manoscritto testuale.

Preparare la soluzione di fluorocromo coniugato libero o anticorpo come descritto nel manoscritto testuale. Calcolare la concentrazione della soluzione madre dalla concentrazione, dal peso molecolare e dal numero di Avogadro come mostrato nell'equazione. Quindi eseguire una diluizione seriale del colorante nel diluente portante per generare campioni di curva standard.

Quindi aggiungere il campione di supporto alla piastra di misurazione e misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre. Generare la curva standard come descritto nel testo manuscritto. Calcolare l'intensità assoluta di fluorescenza per vettore dividendo la fluorescenza di massa per la concentrazione del vettore.

Impostare il citometro a flusso per l'esperimento finale della cella portante determinando le impostazioni ottimali della tensione PMT nei canali pertinenti. Eseguire un campione di controllo negativo in cui le cellule non sono incubate con vettori per determinare la fluorescenza di fondo. Preparare e risospendere le sfere di quantificazione della citometria a flusso.

Utilizzare lo stesso buffer utilizzato per i campioni di celle. Se le popolazioni di perline sono fornite separatamente, tirarle insieme. Eseguire il cordone di quantificazione della citometria a flusso e i campioni di cellule portatrici per determinare l'intensità della fluorescenza per cellula.

Eseguire le sfere di quantificazione del citometro a flusso per generare una curva standard, convertendo l'intensità fluorescente assoluta in MFI. Utilizzare questo per calcolare l'IFM teorico dei vettori come descritto nel manoscritto di testo. Eseguire i campioni del vettore cellulare per determinare l'intensità fluorescente per cella di ciascun campione.

Infine, calcolare il numero di vettori per cella per ciascun campione sottraendo la fluorescenza di fondo dalla fluorescenza misurata del campione e quindi dividendo per la fluorescenza per particella. Per le particelle del guscio del nucleo di acido polimetacrilico a 633 nanometri, la concentrazione e l'intensità fluorescente per vettore sono state quantificate direttamente utilizzando il flusso citometrico. Al contrario, le nanoparticelle di ossido di ferro super paramagnetico a 100 nanometri erano troppo piccole per essere rilevate individualmente e sono state analizzate utilizzando il flusso di massa.

Le perle di quantificazione etichettate sono state utilizzate per più giorni per generare curve standard su un citometro a flusso. La correlazione tra l'IFM misurata e il valore MESF delle sfere di quantificazione era lineare e sostanzialmente simile tra le date misurate. Gli esperimenti con cellule HeLa marcate fluorescenti con capsule di acido polimetacrilico a 235 nanometri da zero a 24 ore hanno mostrato un aumento dell'MFI nel tempo, indicando che le capsule si stavano associando alle cellule HeLa.

La differenza nella risposta cellulare apparente ai portatori era netta, a seconda della quantificazione relativa o assoluta. La quantificazione assoluta era indipendente dall'intensità dell'etichettatura e quindi più comparabile. Queste tecniche sono la base per un'analisi e un confronto più approfonditi delle prestazioni delle particelle.

Siamo entusiasti di utilizzare queste tecniche per parametrizzare modelli matematici che ci permetteranno di caratterizzare le prestazioni delle particelle indipendentemente da qualsiasi particolare esperimento.