合成mRNA转染后肿瘤细胞迁移和侵袭的实时定量测量

该协议表明，将感觉信使RNA交易与基于阻抗的细胞迁移和侵袭实时测量相结合，有助于识别刺激肿瘤细胞迁移和侵袭的基因。基于阻抗的实时细胞分析系统能够定量、连续、全面地监测肿瘤细胞在基因表达变化时的迁移。过度表达肿瘤并刺激肿瘤细胞迁移的基因可以被确定为抑制癌症治疗转移的潜在靶点。

首先，将 10 μL 的 10x 反应缓冲液、1.5 μL 的 PNE 1 和 10 μg 的质粒 DNA 加入微量离心管中，用限制性内切酶对质粒 DNA 进行线性化。加入不含核酸酶的水，使反应体积达到100微升。在将反应混合物在 37 摄氏度下孵育过夜之前，通过敲击和旋转将其混合。

再次，在混合并旋转之前，向反应混合物中加入 5 微升 10% SDS 和 1 微升 20 毫克/毫升 RNA 级蛋白酶 K，然后再将其混合并下降。在 50 摄氏度下孵育 30 分钟后，向微量离心管中加入 2 μL 的 10x 转录缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP 和 T7，以及 1 微克线性化 DNA，用于 T7 RNA 聚合酶介导的 RNA 合成。加入无核酸酶的水，使反应体积达到20微升。

离心后，将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 2 小时以进行 RNA 合成。接下来，向下旋转并加入 1 微升 DNA，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟前敲击以去除模板 DNA。通过向反应混合物中加入 10 微升 7.5 摩尔氯化锂，开始 RNA 的氯化锂沉淀。

敲击并旋转后，将反应混合物在零下 20 摄氏度下孵育 30 分钟。盖帽时，将RNA样品在65摄氏度下加热10分钟，然后将其放在冰上冷却。接下来，添加封端反应组分并通过敲击混合。

将反应混合物在 37 摄氏度下旋转并孵育 1 小时。对于poly-A拖尾，将样品旋转并加入poly-A拖尾反应组分。然后敲击、旋转，并将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 2 小时。

对于氯化锂沉淀和合成mRNA的定量，加入50微升7.5摩尔氯化锂并进行氯化锂沉淀。从冰箱中取出等分试样的ECM凝胶原液，并将其放在冰上。通过在微量离心管中将 990 微升 DMEM 与 10 微升 ECM 凝胶混合，将每升 10 毫克 ECM 凝胶稀释至工作浓度。

通过轻柔的移液混合。将 60 微升稀释的 ECM 凝胶加入 CIM 板上室的 16 个孔中的每一个。将CIM板的上腔室与板盖脱开，放在二氧化碳培养箱内的保护性塑料片上约四小时，以形成凝胶层。

对于电穿孔，将一毫升DPBS添加到每个试管中的肿瘤细胞悬液中。轻敲细胞悬液并向下旋转 3 次，持续 10 秒钟。使用微量移液管除去上清液。

向细胞沉淀中加入 110 微升重悬缓冲液 R，以获得 10 微升的 10 万个细胞。将合成的 mRNA 添加到细胞沉淀中，以获得 0.2 至 20 ng/μL 浓度，具体取决于所需的表达水平。通过敲击轻轻混合并重悬细胞沉淀。

接下来，用 1， 350 伏的电穿孔系统电穿孔 10 微升细胞悬液，持续 10 毫秒，每次三个脉冲。完成后，将电穿孔细胞转移到含有 1.1 毫升含有 0.5% FBS 的 DMEM 的新微量离心管中。双击实时细胞分析软件图标打开分析程序。

打开默认实验模式设置选项后，选择用于分别运行三个实验的选项。通过单击数字选项卡打开每个支架。接下来，单击实验注释选项卡。

选择文件夹，然后通过输入实验的名称来保存数据。单击布局选项卡，一次选择四个孔，为每个处理条件设置四重孔。输入示例信息，然后单击应用。

单击计划选项卡，然后添加一个步骤以设置电池阻抗测量的两步模式。然后，单击"应用"以设置第一步。再次单击"添加步骤"，然后输入 10 分钟作为间隔，输入 48 小时作为迁移和入侵的持续时间。

然后，单击"应用"以设置第二步。在细胞阻抗测量前一小时，将含有10%血清或其他化学引诱剂的160微升DMEM加入CIM板下腔室的孔中。组装包含用于侵入的ECM凝胶包被孔的上腔室或用于与下腔室迁移的未包被孔的上室。

对于细胞迁移测定，向CIM板上室的孔中加入50μL低血清培养基。将CIM板和系统的支架放入CO 2培养箱中。单击消息选项卡。

连接正常后，将显示消息，CIM 板已准备好进行实验。在进行实时细胞分析之前，将组装好的 CIM 板在二氧化碳培养箱中预孵育 30 至 60 分钟，以使 CIM 板适应培养条件。对于基线读数，请单击每个底座的开始按钮。

当"另存为"窗口出现时，保存实验文件以执行基线读数。对于细胞就座，从支架上取下 CIM 板并将其放入板支架上的生物安全柜中。然后将含有100,000个细胞的100微升电穿孔细胞添加到CIM板上室的孔中，并将CIM板在室温下置于生物安全柜下30分钟。

通过将完全组装好的CIM板移回相应的支架来测量电池阻抗。通过单击底座开始按钮和绘图选项卡开始第二步的电池阻抗测量。然后单击"全部添加"按钮并选择"平均值"和"标准差"框以实时可视化数据。

使用不同浓度的合成裂纹 1 mRNA 对 U 118 mg 胶质母细胞瘤细胞进行电穿孔，导致转染后一天标记的裂纹蛋白的浓度依赖性增加。每微升 mRNA 0.2 和 2 纳克导致外源性裂纹蛋白的检测不到或适度表达。20 ng/μL mRNA 导致比内源性裂解 1 蛋白更高的表达水平。

细胞迁移试验表明，电穿孔为0.2或2纳克/微升裂纹，一个mRNA对细胞迁移影响不大。然而，用每微升裂纹 20 纳克的 mRNA 进行电穿孔导致细胞迁移的明显刺激，更多的细胞在 2 到 13 小时之间迁移，这表明胶质母细胞瘤细胞迁移是由裂纹蛋白水平的增加刺激的。使用合成裂纹 L mRNA 进行电穿孔，导致标记标记的裂纹 L 蛋白在转染后 1 天出现稳健表达。

随着ECM蛋白浓度的增加，对照细胞的侵袭速度减慢。裂纹L过度表达细胞显示出细胞侵袭的ECM凝胶浓度依赖性降低。对照组和裂纹L在不同ECM凝胶浓度下过表达细胞的比较表明，裂纹L过表达通常刺激细胞通过ECM凝胶层侵袭。

结果还表明，在不同时间点增加ECM凝胶浓度对两种细胞群的影响不同。细胞应快速、温和、完全地重悬于重悬的气泡 R 中，进行电穿孔，因为细胞在重悬气泡 R 中长时间孵育会使细胞不健康。可以分离快速和缓慢迁移的肿瘤细胞，以表征两个细胞群之间的差异。