Un approccio di imaging intravitale fluorescente per studiare le dinamiche di segnalazione del calcio indotte dal carico negli osteociti di topo

Questo protocollo fornisce un modo per osservare gli osteociti incorporati in vivo, rappresentando un importante progresso nello studio della meccanobiologia ossea. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di osservare eventi a livello cellulare e molecolare negli osteociti in vivo, mantenendo la loro disposizione spaziale 3D nativa, il flusso sanguigno e le condizioni endocrine e superando i limiti tipicamente imposti dalla sperimentazione cellulare in vitro. Questa tecnica è progettata per la ricerca scientifica di base nei modelli murini. Non si estendono ancora alla terapia o alla diagnosi, ma offrono l'opportunità di intuizioni che definiscono la prossima generazione di trattamenti ossei.

[Narratore] Per iniziare, praticare un'incisione con bisturi attraverso il derma tra il secondo e il terzo metatarso, partendo dall'estremità distale e progredendo prossimalmente lungo la lunghezza delle ossa. Usando una pinza, aprire il sito chirurgico tirando la pelle verso i bordi mediali o laterali. Resecare i tendini estensori usando le forbici Vannas dritte per esporre il terzo metatarso. Inserire il perno del fulcro centrale del dispositivo di carico metatarsale nel piccolo spazio all'estremità distale dove il terzo metatarso incontra la falange prossimale. Quindi spostare il perno prossimalmente fino a quando non si appoggia all'asta centrale del terzo metatarso. Prestare particolare attenzione a garantire un'interfaccia diretta tra l'osso e il perno, escludendo qualsiasi muscolo e fascia. Tenere la caviglia con una pinza e mettere il piede nel bagno d'acqua riempito DPBS. Fissare la zampa in posizione con la staffa di carico e collegare la staffa alla disposizione delle celle di carico dell'attuatore. Raccogliere con cautela la configurazione del dispositivo di caricamento con il mouse e posizionarla sulla piattaforma del microscopio. Inizia con l'obiettivo a basso ingrandimento in modalità epifluorescenza per localizzare e centrare la diafisi media dell'osso. Dopo aver individuato una regione di interesse, passare a un ingrandimento dell'obiettivo a immersione in acqua più elevato e passare l'ottica a due fotoni. Impostare la densità dei pixel utilizzando le impostazioni di controllo dell'area Galvo/Risonanza. Per evitare lo sbiancamento delle foto, ridurre la potenza utilizzando l'opzione di controllo dell'alimentazione e aumentare l'amplificazione PMT nelle impostazioni di controllo dello scanner Galvo/Resonance. Identificare la superficie dell'osso in modalità a due fotoni cercando l'autofluorescenza fibrosa del periostio nel canale verde che utilizza un filtro passa banda centrato a 525 nanometri. Se si verifica un movimento visibile dell'osso durante il caricamento, selezionare una regione di interesse diversa lungo le direzioni Y o Z per assicurarsi che si trovi direttamente sopra il perno del fulcro centrale. Se il movimento persiste, regolare manualmente la posizione chirurgica del perno sotto il terzo metatarso. Condurre l'imaging Z stack con caricamento secondo il disegno sperimentale per registrare gli eventi di segnalazione morfometrica, quindi l'imaging della serie T con caricamento per registrare gli eventi di segnalazione indotti dal carico dinamico. Qui è mostrata un'immagine a singolo piano a due fotoni di osteociti metatarsali che esprimono GCaMp6f in vivo. L'espressione endogena dei costrutti reporter di calcio fornisce un bersaglio fluorescente senza necessità di incubazione. In questa figura viene presentata la proiezione 3D Z di osteociti in vivo catturati con la microscopia a due fotoni. Il taglio trasversale nel piano XY e un taglio sagittale mostrano la profondità della pila Z. L'immagine rappresentativa mostra un esempio di andamento temporale del segnale fluorescente GCaMp6f da un osteocita incorporato. A riposo, si manifestano fluttuazioni rumorose di basso livello. Con il carico, le fluttuazioni del calcio aumentano di entità e regolarità, spesso verificandosi di pari passo con il carico applicato.

Questo metodo apre la strada ai ricercatori per rispondere a domande funzionali riguardanti la meccanobiologia degli osteociti in vivo che in precedenza erano possibili solo in vitro o ex vivo.