Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

La produzione di topi geneticamente modificati e l'analisi del loro fenotipo ci consente di comprendere in dettaglio specifiche funzioni geniche, in vivo. Numerosi risultati importanti sono stati scoperti utilizzando modelli animali geneticamente modificati. Il metodo che descriviamo qui consente al DNA lungo di impiantare cellule staminali con un'efficienza accettabile senza selezione di farmaci.

La tecnica è vantaggiosa non solo per le scienze della vita di base, ma i risultati saranno implementati anche nelle scienze applicate come la scienza medica e la scienza animale. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Chihiro Emori, un assistente professore, e il Dr.Manabu Ozawa, un professore associato del mio laboratorio. Dopo aver preparato il fibroblasto embrionale di topo, preparare il piatto di coltura cellulare rivestito di gelatina come descritto nel manoscritto e incubarlo per due ore in un'incubatrice umida.

Rimuovere la soluzione di gelatina, lavare il piatto due volte con PBS e conservarlo a temperatura ambiente fino all'uso. Scongelare mitoticamente lo stock di MEF congelato inattivato utilizzando un bagno d'acqua temperato a 37 gradi Celsius per un minuto. Un giorno prima della semina ESC, posizionare il MEF su un piatto da 60 millimetri ricoperto di gelatina.

Scongelare un tubo di riserva ESC congelato come mostrato in precedenza e posizionare una volta da 10 a quinti ESC su un piatto da 60 millimetri contenente MEF pre-seminato. Quindi, aggiungere quattro millilitri di terreno di coltura ESC e incubare il piatto fino a quando l'ESC raggiunge il 50-70% di confluenza. Dopo aver lavato l'ESC coltivato con quattro millilitri di PBS, digerirli con 800 microlitri di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25% per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Una volta che la tripsina è inattivata con un millilitro di ESCM, aggiungere un millilitro di ESCM fresco alle cellule, trasferire il mezzo in un tubo e pellettare le cellule mediante centrifugazione a 280 G per cinque minuti. Dopo aver risospeso le cellule in un millilitro di ESCM fresco, contare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di cellule con colorazione blu tripano. Dopo aver trasferito una volta 10 al quinto ESC in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e averli lavati tre volte con PBS mediante centrifugazione, risospendere il pellet ESC in 12 microlitri di miscela di DNA Cas9 RNP e mescolare bene mediante pipettaggio delicato per evitare gorgogliamenti.

Quindi, servire l'ESC sospeso per l'elettroporazione. Successivamente, coltivare le ESC elettroporate in un piatto da 60 millimetri contenente quattro millilitri di ECSM con MEF inattivato mitoticamente e continuare a cambiare il terreno ogni giorno. Da tre a cinque giorni dopo l'elettroporazione, lavare gli ESC con quattro millilitri di PBS, quindi digerirli con 800 microlitri di tripsina EDTA allo 0,25% e coltivare in un incubatore umido.

Successivamente, aggiungere due millilitri di ESCM per fermare la digestione della tripsina. Una volta che la miscela di cellule è pellettizzata, risospendere il pellet in un millilitro di ESCM fresco e contare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di cellule con colorazione blu tripano. Far passare gli ESC una volta 10 alla terza cella per piatto da 60 millimetri contenente ESCM e MEF di alimentazione.

Assicurati di cambiare il mezzo fino a quando la colonia non si riprende. Da cinque a sette giorni dopo il primo passaggio, una volta aspirato l'ESCM dal piatto di coltura ESC, aggiungere quattro millilitri di PBS. Utilizzando una pipetta da 20 microlitri, prelevare singole colonie ESC con cinque microlitri di PBS sotto uno stereomicroscopio.

Porre le singole colonie in un pozzetto di una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti contenente 15 microlitri di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25%. Dopo aver incubato la piastra a 96 pozzetti, interrompere la digestione della tripsina aggiungendo 80 microlitri di ESCM e dissociando le colonie di ESC in singole cellule mediante pipettaggio. Per la genotipizzazione PCR, trasferire 40 microlitri di sospensione ESC in una piastra rivestita di gelatina, senza alimentatore, a 96 pozzetti contenente 50 microlitri di ESCM per pozzetto.

Per realizzare lo stock ESC congelato, trasferire i restanti 60 microlitri di sospensione ESC in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti rivestita di gelatina contenente 500 microlitri di ESCM e MEF di alimentazione. Immagazzinare i singoli cloni ESC coltivati nella piastra a 24 pozzetti fino a raggiungere il 60-80% di confluenza e recuperare i singoli cloni ESC mediante tripsinizzazione, come dimostrato in precedenza. Dopo aver ottenuto il pellet cellulare mediante centrifugazione, risospendere il mezzo di congelamento cellulare da 500 microlitri per congelare le cellule a meno 80 gradi Celsius.

Per la genotipizzazione PCR, i cloni ESC di coltura come dimostrato in precedenza e rimuovere ESCM da ciascun pozzetto mediante aspirazione prima di lavarlo con 100 microlitri di PBS due volte. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi contenente proteinasi K e mescolare bene. Ora trasferisci il lisato ESC in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e tienilo in una camera termica a 65 gradi Celsius per almeno un'ora.

Una volta che il DNA genomico è stato sciolto in 20 microlitri di acqua priva di DNasi, determinare la purezza e la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Dopo aver eseguito la PCR genomica utilizzando set di primer specifici per il locus per amplificare la regione target, controllare la sequenza e scegliere i cloni ESC con le sequenze knock-in desiderate. Dopo l'accoppiamento delle femmine trattate con l'ormone con i maschi ICR e la raccolta dell'ovidotto, posizionare gli ovidotti raccolti in gocce di FHM e recuperare gli embrioni a due o quattro cellule lavando l'ovidotto con FHM usando un ago di lavaggio inserito nell'infundibulum.

Lavare gli embrioni raccolti spostandoli in diverse gocce fresche di FHM usando una pipetta orale. Coltura gli embrioni in 50 microlitri di gocce KSOM su un piatto di coltura cellulare di 35 millimetri coperto di olio minerale come dimostrato in precedenza per un giorno fino al raggiungimento dello stadio di otto cellule o morula. Preparare pipette di vetro per contenere gli embrioni e l'iniezione di ESC utilizzando un estrattore e una microforgiatura.

Dopo aver integrato una pipetta contenente FHM in un supporto capillare collegato a un microiniettore, posizionarla sul lato sinistro del micromanipolatore. Collegare una pipetta di iniezione a un altro microiniettore e posizionarla sul lato destro. Allineare le due pipette direttamente nel campo visivo del microscopio.

Fai gocce da cinque microlitri di polivinilpirrolidone al 12% e gocce da cinque microlitri di FHM sullo stesso coperchio di un piatto da 60 millimetri, fianco a fianco. Coprire le gocce con olio minerale. Trasferire gli embrioni in cinque microlitri di goccia di FHM e aggiungere da uno a cinque microlitri della sospensione ESC alla goccia di FHM contenente embrioni.

Una volta lavata la pipetta per iniezione con polivinilpirrolidone, spostare la pipetta per iniezione sulla goccia contenente gli embrioni e le ESC. Scegliete tre doppiette ESC individuali che hanno appena terminato la loro divisione cellulare nella pipetta di iniezione. Utilizzando la pipetta di mantenimento, tenere un embrione a otto cellule o allo stadio di morula che ha completato la compattazione mediante aspirazione e praticare un foro nella zona pellucida con un impulso piezoelettrico.

Espellere l'ESC a sei cellule all'interno della zona pellucida ed estrarre la pipetta dagli embrioni. Lavare delicatamente gli embrioni iniettati con ESC con diverse gocce di KSOM usando una pipetta orale e incubarli in una nuova goccia di KSOM da 50 microlitri ricoperta di olio minerale, come dimostrato in precedenza, fino a quando gli embrioni non si sono sviluppati fino allo stadio di blastocisti. Si ottiene un amplicone PCR di dimensioni specifiche per il bersaglio knock-in e 9 cloni su 22 hanno mostrato una banda specifica per knock-in.

Questi risultati sono efficienti e riproducibili per il knock-in genico senza alcuna selezione di farmaci. Raccogliere la dimensione ottimale delle colonie ESC è abbastanza importante per questa procedura. Evita di selezionare colonie troppo grandi o troppo piccole.

L'editing diretto del genoma mediato da CRISPR Cas9 utilizzando uno zigote sarebbe applicabile per la creazione di topi knockout genici semplici. Questo protocollo di targeting genico ESC mediato da CRISPR Cas9 facilita la produzione di vari topi geneticamente modificati per analisi future nelle scienze della vita.