Name: Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Scopri come tracciare le cellule T in vivo mediante luciferasi per valutare l'efficacia antitumorale degli anticorpi bispecifici. Questo metodo non invasivo consente il monitoraggio longitudinale nel tempo.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Vladimir Ponomarev per aver condiviso i costrutti di luciferasi utilizzati negli esperimenti descritti nella sezione dei risultati rappresentativi di questo articolo.

Le seguenti procedure sono state valutate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Memorial Sloan Kettering.
1. Trasfezione di cellule 293T con luciferasi e prelievo di surnatante virale
<ol><li>Coltura di cellule 293T<ol><li>Preparare i terreni aggiungendo quanto segue a un litro di DMEM ciascuno: 110 ml di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 11 ml di penicillina-streptomicina.</li>
		<li>Scongelare 5 x 106 293T e trasferirle in un matraccio T175 con i mezzi preparati come descritto sopra.</li>
		<li>Dividere le celle 293T 1:10 ogni 3 giorni per 6 giorni. Non permettere alle cellule di diventare più del 90% confluenti.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasfezione di cellule 293T NOTA: Le seguenti quantità di reagenti sono calcolate per trasfettare un matraccio T175 di cellule 293T. Regolare di conseguenza se devono essere trasdotti più palloni.<ol><li>Trasferire 1,5 mL di fluido in ciascuna delle due provette da 50 mL utilizzando una pipetta. A una provetta, aggiungere 10 μg di plasmide VSV-G, 20 μg di Gag/pol e 20 μg di plasmide luciferasi, pomodoro rosso coleottero click beetle (CBR-TDR) e mescolare. All'altra provetta, aggiungere 100 μL di reagente di trasfezione in vitro del DNA e mescolare. Incubare entrambi i tubi a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti. NOTA: Tutti i plasmidi descritti in questo manoscritto sono stati forniti dal Dr. Vladimir Ponomarev.</li>
		<li>Trasferire il mezzo contenente il reagente di trasfezione in vitro del DNA goccia a goccia sulla provetta contenente i plasmidi del DNA (oltre circa 30 s) e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare a RT per 20 min.</li>
		<li>Durante questa incubazione di 20 minuti, staccare le cellule 293T aggiungendo 5-10 ml di tripsina allo 0,05%. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere 10 ml di fluido e centrifugare a 800 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 1,5 ml di supporto.</li>
		<li>Aggiungere i terreni contenenti il reagente di trasfezione in vitro del DNA e i plasmidi del DNA alle cellule 293T e incubare a 37 °C per 30 minuti.</li>
		<li>Trasferire in un matraccio T175 e aggiungere 18 mL di supporto. Incubare a 37 °C durante la notte.</li>
		<li>Il giorno dopo, aspirare con cura il supporto con una pipetta di vetro senza staccare le celle. Sostituire con 18 mL di terreno fresco. Incubare a 37 °C durante la notte in un'incubatrice.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta di supernatante virale<ol><li>Rimuovere il surnatante virale usando una pipetta messa sul ghiaccio. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti per pellettare le cellule e i detriti. NOTA: Se il pellet cellulare è grande, le cellule sono state probabilmente interrotte dal pallone quando il surnatante è stato rimosso. Queste celle possono essere nuovamente placcate in un nuovo pallone con terreni freschi.</li>
		<li>Filtrare il surnatante virale utilizzando un filtro da 0,22 μm.</li>
		<li>Utilizzare immediatamente il surnatante virale. Conservalo su ghiaccio o a 4 °C per un massimo di 24 ore o congelalo a -80 ° C per una conservazione a lungo termine.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Espansione e trasduzione di cellule T umane attivate con luciferasi
<ol><li>Attivazione di cellule T umane in vitro
	<ol><li>Lavare le perle aggiungendo 10 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in un tubo sterile da 15 ml, aggiungendo perline (una perla per due cellule T), mettendo in un rack magnetico per 2 minuti e aspirando il PBS.</li>
		<li>Preparare i terreni come descritto al punto 1.1.1, quindi aggiungere IL-2 ad una concentrazione finale di 30 UI/ml e aggiungere le perle lavate. Crea 2,5 ml di media per ogni due milioni di cellule T da attivare.</li>
		<li>Contare le cellule T (appena purificate o precedentemente purificate, congelate, scongelate e lavate) utilizzando un emocitometro e una macchia blu tripano. Aggiungere le cellule T al mezzo preparato al punto 2.1.2 e capovolgere delicatamente il tubo per miscelare. Le cellule T si espanderanno almeno 20 volte a seconda della fonte e della salute generale delle cellule. Determinare il numero di cellule T da attivare calcolando il numero necessario per trattare i topi e dividendo per 20. Qui, sono state utilizzate 20 x 106 cellule T per topo sulla base di esperimenti preliminari.</li>
		<li>Piastra 2,5 ml di terreno contenente due milioni di cellule T, perline e IL-2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Coltura a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO2 .</li>
		<li>Esaminare le cellule T al microscopio 20x ogni giorno per i prossimi 3 giorni per determinare quando trasdurre con luciferasi. Le cellule sono pronte quando si aggregano e impoveriscono il supporto, trasformandolo da rosso / rosa ad arancione chiaro.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di piastre retronectina NOTA: La retronectina viene utilizzata per rivestire le piastre utilizzate nella trasduzione in quanto migliora la trasduzione genica15.<ol><li>Aggiungere 2 mL di 20 μg/mL di retronectina in PBS in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti non trattata. Incubare per 2 ore a RT o 1 ora a 37 °C. È necessario un pozzetto rivestito di retronectina per ogni due milioni di cellule T da trasdurre.</li>
		<li>Aspirare la retronectina senza graffiare il fondo della piastra.</li>
		<li>Aggiungere 3 ml di BSA al 2% in PBS (filtrato sterile) per pozzetto nella piastra a 6 pozzetti. Incubare per 30 minuti a RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Spinoculazione<ol><li>Aspirare il BSA senza graffiare il fondo della piastra.</li>
		<li>Lavare i pozzetti una volta con 3 ml di PBS per pozzetto. Continuare o sostituire con PBS fresco e lasciare la piastra coperta a 4 °C per una notte.</li>
		<li>Aggiungere 2 ml di surnatante virale CBR-TDR luciferasi (raccolto nella fase 1.3) per pozzetto.</li>
		<li>Centrifugare a 1.240 x g per 90 minuti a 32 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasduzione<ol><li>Conta le cellule T.</li>
		<li>Aspirare il surnatante virale senza graffiare il fondo del piatto.</li>
		<li>Placcare due milioni di cellule T per pozzetto in 6 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 30 UI/mL di IL-2 umana.</li>
		<li>Esaminare le cellule T ogni giorno. Le cellule T sono pronte per essere espanse quando sono quasi confluenti, di solito dopo 2 giorni.</li>
		<li>Quando le cellule sono quasi confluenti, lavarle delicatamente dal fondo della piastra usando una pipetta e trasferire ciascun pozzetto in un matraccio T75 separato. Aggiungere 9 mL di supporto per un totale di 15 mL di supporto per pallone.</li>
		<li>Il giorno successivo, aggiungere altri 15 ml di supporto. Le cellule dovrebbero essere pronte per l'iniezione nei topi il giorno dopo questa aggiunta di media. Confermare la corretta trasduzione eseguendo la citometria a flusso (il costrutto di luciferasi contiene un fluoroforo di pomodoro TD visibile nel canale PE)16.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Attecchimento di cellule T trasdotte dalla luciferasi in topi immunocompromessi
<ol><li>Preparare e contare le cellule T per l'iniezione.<ol><li>Rimuovere le cellule T dai palloni e contare. Le cellule sono pronte per l'iniezione quando si sono espanse 20x-30x, di solito entro il giorno 7 dopo l'attivazione.</li>
		<li>Centrifugare le cellule T a 800 x g per 5 minuti. Risospendere in 2 ml di supporto e rimuovere le perline utilizzando un rack magnetico.</li>
		<li>Per gli esperimenti in cui le cellule T saranno iniettate separatamente dagli anticorpi bispecifici, contare le cellule T e risospendere in modo che la concentrazione finale sia di 20 milioni di cellule T per 100 μL di mezzo. Andare al passaggio 3.2. Per gli esperimenti che utilizzano cellule T armate ex vivo (EAT), andare al punto 3.1.4.</li>
		<li>Per gli esperimenti che utilizzano cellule T armate ex vivo , contare le cellule T e separarle in singoli tubi da 1,5 ml per ciascun gruppo, con 20 milioni di cellule per topo. Ad esempio, se ci sono tre gruppi di cinque topi ciascuno, preparare tre tubi da 1,5 ml con 100 milioni di cellule T ciascuno.</li>
		<li>Centrifugare i tubi da 1,5 mL a 800 x g per 5 minuti. Rimuovere accuratamente il supporto senza disturbare il pellet di cellule T. Risospendere in non più di 50 μL di terreno contenente gli anticorpi bispecifici. Incubare a RT per 30 min. NOTA: Ai fini degli esperimenti condotti in questo studio, sono stati utilizzati anticorpi bispecifici proprietari IgG-[L]-scFv che coinvolgono le cellule T generati in laboratorio. Per l'armamento delle cellule T, utilizzare 5 μg di anticorpi per 20 x 106 cellule T. Potrebbero essere utilizzati anche anticorpi bispecifici disponibili in commercio.</li>
		<li>Lavare via gli anticorpi in eccesso aggiungendo 1.450 μL di fluido a ciascuna provetta. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti, aspirare accuratamente il fluido e risospendere ad una concentrazione di 20 milioni di cellule T armate per 100 μL di media.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione e attecchimento nei topi<ol><li>Anestetizzare i topi in una camera che fornisce il 3,5% (v/v) di isoflurano inalato in 1 L/min di ossigeno. I topi sono completamente anestetizzati quando il riflesso di ritiro del pedale dell'arto posteriore è scomparso. NOTA: Fornire supporto termico durante tutta la procedura.</li>
		<li>Utilizzando un ago da 26 G, iniettare 20 milioni di cellule T in 100 μL di terreno retroorbitalmente per topo.</li>
		<li>Somministrare 1.000 U ricombinante IL-2 per via sottocutanea per sostenere la sopravvivenza delle cellule T in vivo.</li>
		<li>Somministrare gli anticorpi bispecifici retroorbitalmente (nell'occhio non utilizzati per l'iniezione di cellule T) o intraperitonealmente. Consentire ai topi di riprendersi dall'anestesia e tornare alle loro gabbie. NOTA: Ancora una volta, qui, sono stati utilizzati anticorpi proprietari generati in laboratorio, ma potrebbero essere utilizzati anticorpi disponibili in commercio. Negli esperimenti qui, sono stati somministrati 0,3-10 μg di anticorpi per topo per dose. Gli anticorpi sono stati somministrati due volte a settimana per 3-4 settimane.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imaging in vivo di topi innestati con cellule T trasdotte da luciferasi
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito il giorno dell'imaging, che non è necessariamente lo stesso giorno in cui le cellule T e / o gli anticorpi vengono somministrati ai topi. Tipicamente, eseguiamo l'imaging 24 ore dopo la somministrazione delle cellule T trasdotte dalla luciferasi.
<ol><li>Preparazione di D-luciferina<ol><li>Sciogliere 1 g di D-luciferina in 33,3 mL di PBS sterile (concentrazione finale: 30 mg/ml).</li>
		<li>Aliquot la D-luciferina disciolta in provette da microcentrifuga da 33 x 1,5 mL e mantenere le provette a -20 °C.</li>
		<li>Il giorno dell'imaging, scongelare aliquote sufficienti di 30 mg / mL di D-luciferina per il numero di animali da fotografare. Un tubo è sufficiente per 10 animali. NOTA: Ricongelare la D-luciferina rimanente dopo l'uso. La D-luciferina è stabile per almeno cinque cicli di congelamento/scongelamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Somministrazione di D-luciferina ai topi NOTA: Prima di somministrare D-luciferina ai topi, aprire il software di imaging e inizializzare il sistema. La fotocamera può richiedere diversi minuti per raffreddarsi, e questo dovrebbe essere fatto prima che i topi vengano iniettati con D-luciferina per garantire che l'imaging possa avvenire 5 minuti dopo la somministrazione del substrato.<ol><li>Anestetizzare fino a cinque topi in una camera che forniscono il 3,5% (v/v) di isoflurano inalato in 1 L/min di ossigeno. I topi sono completamente anestetizzati quando il riflesso di ritiro del pedale dell'arto posteriore è scomparso.</li>
		<li>Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, somministrare 100 μL di 30 mg/mL di D-luciferina per topo (3 mg per topo) mediante iniezione retroorbitale con un ago da 26 G. Immagina questo gruppo di topi prima di somministrare D-luciferina al gruppo successivo. Posizionare il gruppo successivo di topi nella camera di isoflurano da anestetizzare mentre viene visualizzata l'immagine del gruppo precedente.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging delle cellule T trasdotte dalla luciferasi<ol><li>Spostare i topi anestetizzati nella camera a tenuta di luce dell'imager e continuare a somministrare isoflurano al 3% a 0,5 L/min. Posizionare i topi sui fianchi in modo tale che il fianco che porta lo xenotrapianto sia rivolto verso la fotocamera. Prendi un'altra serie di immagini con i topi in posizione supina per valutare la presenza di cellule T nei polmoni.</li>
		<li>Utilizzando il Pannello di controllo acquisizione, selezionate Luminescente, Fotografia e Sovrapposizione. Impostare il tempo di esposizione su auto, il binning su medio e F/Stop su 1. Acquisire immagini. Dopo la prima immagine, impostare il tempo di esposizione in modo che corrisponda a quello calcolato automaticamente per la prima immagine in modo che le immagini successive possano essere confrontate direttamente. Può essere utile acquisire immagini con più tempi di esposizione per determinare il tempo di esposizione ottimale per ottenere il segnale più luminoso senza saturazione di pixel.</li>
		<li>Rimuovere i topi dall'isoflurano, tornare alle loro gabbie e osservare fino a quando non sono svegli e deambulanti.</li>
		<li>Ripetere i passaggi dal passaggio 4.2.1 fino a quando non è stata creata la visualizzazione di tutti i gruppi.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

NKC riferisce di aver ricevuto borse di ricerca commerciali da Y-mAbs Therapeutics. NKC è l'inventore e proprietario di brevetti rilasciati concessi in licenza da MSK a Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand e Abpro-labs. MSK e NKC hanno interessi finanziari in Y-mAbs. NKC riferisce di aver ricevuto stock option da Eureka Therapeutics. HFG e MEC non hanno divulgazioni pertinenti.

Mentre il T-BsAb blinatumomab è stato approvato per le neoplasie ematologiche CD19-positive, l'implementazione di successo di T-BsAbs nei tumori solidi si è dimostrata molto più difficile. Catumaxomab, un T-BsAb diretto contro la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EPCAM), è stato approvato per il trattamento dell'ascite maligna in pazienti con cancro ovarico, ma la produzione del farmaco è stata successivamente interrotta per motivi commerciali19. Nessun altro T-BsAbs è stato approvato...

Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono anticorpi ingegnerizzati utilizzati per fornire specificità artificiale alle cellule T policlonali coinvolgendo le cellule T attraverso un braccio legante e un antigene tumorale attraverso un altro braccio legante. Questa tecnologia è stata applicata con successo ai tumori ematologici (CD19-targeting blinatumomab1), e numerosi T-BsAb sono in fase di sviluppo preclinico e clinico per una varietà di tumori solidi così come2. I T-BsAb coinvolgono le cellule T policlonali in modo indipendente dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), e quindi anche i tumori che sottoregolano gli antigeni dei leucociti umani (HLA) sono suscettibili a questo tipo di terapia 3,4. I T-BsAb sono stati sviluppati in dozzine di formati diversi, con differenze nella valenza e nella disposizione spaziale delle cellule T e dei bracci leganti il tumore, le distanze interdomini e l'inclusione di un dominio Fc, che influenza l'emivita e può indurre funzioni effettrici se presente5. Precedenti lavori nel nostro laboratorio hanno dimostrato che questi fattori influenzano significativamente l'efficacia antitumorale di T-BsAbs, con differenze fino a 1.000 volte nella potenza6. Attraverso questo lavoro, abbiamo identificato il formato IgG-[L]-scFv come la piattaforma ideale per T-BsAbs (vedere la sezione Risultati rappresentativi per maggiori dettagli sui formati T-BsAb) e abbiamo applicato questa piattaforma a target tra cui GD2 (neuroblastoma), HER2 (cancro al seno e osteosarcoma), GPA33 (cancro del colon-retto), STEAP1 (sarcoma di Ewing), CD19 (tumori maligni delle cellule B) e CD33 (tumori maligni delle cellule B)7, 8,9,10,11,12,13.
Una delle principali sfide per implementare con successo la terapia T-BsAb nei tumori solidi è superare un microambiente tumorale immunosoppressivo (TME) per guidare il traffico di cellule T verso i tumori14. I fattori che influenzano l'efficacia di T-BsAb sopra descritti hanno un impatto significativo sulla capacità di T-BsAbs di indurre efficacemente l'homing delle cellule T ai tumori, ma questo effetto è difficile da valutare in un sistema in vivo in tempo reale. Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata dell'uso delle cellule T trasdotte dalla luciferasi negli studi preclinici di T-BsAbs per valutare il traffico di cellule T verso vari tessuti in modelli murini immunocompromessi sperimentali durante il trattamento. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un mezzo per valutare l'infiltrazione delle cellule T nei tumori e in altri tessuti, nonché una visione in tempo reale della cinetica e della persistenza delle cellule T, senza la necessità di sacrificare animali durante il trattamento. Per il crescente numero di ricercatori che si concentrano sulle immunoterapie cellulari, la capacità di tracciare le cellule T in vivo in modelli animali preclinici è fondamentale. Miriamo a fornire una descrizione completa e dettagliata del metodo che abbiamo impiegato per tracciare le cellule T trasdotte dalla luciferasi per consentire ad altri ricercatori di replicare facilmente questa tecnica.

<table><tbody><tr><td>293T cellule</td>, <td>ATCC</td>, <td>CRL-11268</td><td></td></tr>, <tr><td>BSA</td>, <td>Sigma, Aldrich,</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>, perline CD3/CD28</td>, <td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11161D</td><td></td></tr><tr><td>, D-luciferina, sale di potassio</td>, <td>Goldbio</td>, <td>LUCK-1G</td><td></td>,</tr><tr><td>DMEM</td>, <td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>reagente di trasfezione in vitro del DNA (polyjet)</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>plasmide Gag/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>plasmide Addgene</td><td>11150-DNA.cg</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Streptomicina</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 umana ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Retronectina</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G plasmide</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio del traffico di cellule t indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule t umane trasdotte dalla luciferasi

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono in varie fasi di sviluppo preclinico e test clinici per i tumori solidi. Fattori come la valenza, la disposizione spaziale, la distanza interdominio e le mutazioni Fc influenzano l'efficacia antitumorale di queste terapie, comunemente influenzando l'homing delle cellule T nei tumori, che rimane una grande sfida. Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane attivate con luciferasi, consentendo il tracciamento in vivo delle cellule T durante gli studi di terapia T-BsAb. La capacità di T-BsAbs di reindirizzare le cellule T ai tumori può essere valutata quantitativamente in più punti temporali durante il trattamento, consentendo ai ricercatori di correlare l'efficacia antitumorale di T-BsAbs e altri interventi con la persistenza delle cellule T nei tumori. Questo metodo allevia la necessità di sacrificare gli animali durante il trattamento per valutare istologicamente l'infiltrazione delle cellule T e può essere ripetuto in più punti temporali per determinare la cinetica del traffico di cellule T durante e dopo il trattamento.

Come descritto nella fase 4.3, i topi possono essere orientati in diverse posizioni durante l'imaging per valutare la presenza di cellule T in diversi tessuti. Il posizionamento supino consente la valutazione delle cellule T nei polmoni, che è comune nei primi punti temporali dopo l'iniezione. Il posizionamento laterale con lo xenotrapianto sottocutaneo rivolto verso l'alto viene utilizzato per valutare al meglio il traffico di cellule T verso il tumore. Topi femmina C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug<...

Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane con luciferasi per facilitare il monitoraggio in vivo del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici ai tumori in studi per valutare l'efficacia antitumorale e il meccanismo degli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T.

Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Questo metodo consente agli utenti di tracciare facilmente le cellule T in vivo per valutare la cinetica dell'homing e monitorare la persistenza delle cellule T. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere ripetuta in più punti temporali sullo stesso animale senza richiedere sacrifici nella citometria a flusso o nell'immunoistochimica. Questa tecnica potrebbe essere modificata per tracciare anche altri tipi di cellule immunitarie.Per coltivare le cellule 293T, preparare un litro di DMEM aggiungendo 110 millilitri di siero bovino fetale inattivato dal calore e 11 millilitri di streptomicina penicillina. Scongelare cinque volte 10 fino alla sesta cella 293T e trasferirle in un matraccio T175 contenente DMEM. Dividere le cellule da una a 10 ogni tre giorni per sei giorni prima che le cellule diventino più del 90% confluenti.Per la trasfezione, trasferire 1,5 millilitri di supporto in due tubi da 50 millilitri utilizzando una pipetta. A un tubo, aggiungere 10 microgrammi di plasmide VSVG, 20 microgrammi di gag pol e 20 microgrammi di click beetle red TDtomato o CBRTDR luciferasi plasmide e mescolare. Aggiungere 100 microlitri di reagente di trasfezione in vitro del DNA in un'altra provetta e mescolare.Incubare entrambi i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti. Trasferire il mezzo contenente il reagente di trasfezione in vitro del DNA goccia a goccia sulla provetta contenente i plasmidi del DNA e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.Durante l'incubazione, staccare le cellule 293T aggiungendo da cinque a 10 millilitri di tripsina allo 0,05%. Una volta staccate le cellule, aggiungere 10 millilitri di terreno e centrifugare a 800 G per cinque minuti. Risospendere le celle in 1,5 millilitri di supporto.Aggiungere i mezzi contenenti il reagente di trasfezione in vitro del DNA e i plasmidi del DNA alle cellule 293T e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione in un matraccio T175. Aggiungere 18 millilitri di supporto e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, aspirare con cura il supporto con una pipetta di vetro senza staccare le celle e sostituirlo con 18 millilitri di mezzi freschi. Ancora una volta, incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, rimuovere il surnatante virale usando una pipetta messa su ghiaccio e centrifugare a 800 G per cinque minuti per pellettare le cellule e i detriti.Filtrare il surnatante virale utilizzando un filtro da 0,22 micron e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio. Per l'attivazione in vitro di cellule T umane, aggiungere 10 millilitri di PBS contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina o BSA e due EDTA millimolari a un tubo sterile da 15 millilitri. Quindi per lavare le perline, aggiungere perline in un tubo e posizionare il tubo in un rack magnetico.Dopo due minuti, rimuovere il PBS dal tubo. Dopo aver preparato DMEM, aggiungere perline lavate e interleuchina-2 o IL-2 a una concentrazione finale di 30 unità internazionali per millilitro. Contare le cellule T usando un emocitometro e una colorazione blu di Trypan.Dopo il conteggio, aggiungere il numero desiderato di cellule T al mezzo e capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Piastra 2,5 millilitri di terreno contenente due milioni di cellule T, perline e IL-2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Coltura a 37 gradi Celsius in anidride carbonica umidificata al 5%.Esaminare le cellule T sotto un obiettivo 20X ogni giorno per tre giorni per determinare quando trasdurre con luciferasi. Successivamente, per preparare una piastra RetroNectin, aggiungere due millilitri di 20 microgrammi per millilitro di RetroNectin in PBS a un pozzetto di una piastra a sei pozzetti non trattata e incubare per due ore a temperatura ambiente. Aspirare il RetroNectin senza graffiare il fondo della piastra e aggiungere tre millilitri di 2% BSA in PBS per pozzetto nella piastra a sei pozzetti.Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, per la spinoculazione, aspirare la BSA e lavare i pozzetti una volta con tre millilitri di PBS. Continuare o sostituire con PBS fresco e lasciare la piastra coperta a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di supernatante virale CBRTDR luciferasi per pozzetto e centrifugare a 1.240 G per 90 minuti a 32 gradi Celsius. Per la trasduzione, dopo aver contato le cellule T, aspirare il surnatante virale e placcare due milioni di cellule T per pozzetto in sei millilitri di DMEM contenente 30 unità internazionali per millilitro di IL-2 umano. Esaminare le cellule T per due giorni.Quando le cellule sono quasi confluenti, lavarle delicatamente dal fondo della piastra usando una pipetta e trasferire ciascun pozzetto in un matraccio T75 separato. Aggiungere nove millilitri di supporto per un volume totale di 15 millilitri per pallone. Il giorno successivo, aggiungere 15 millilitri di mezzi e confermare la trasduzione corretta eseguendo la citometria a flusso.Dopo aver anestetizzato il topo, utilizzando un ago calibro 26, iniettare 20 milioni di cellule T in 100 microlitri di terreno retroorbitalmente. Somministrare 1.000 unità di IL-2 ricombinante per via sottocutanea per supportare la sopravvivenza delle cellule T in vivo. Quindi somministrare l'anticorpo bispecifico retroorbitalmente o intraperitonealmente.Per l'imaging in vivo, somministrare 100 microlitri di tre milligrammi di D-luciferina mediante iniezione retroorbitale con un ago calibro 26 in un topo anestetizzato. Per acquisire immagini, posizionare il mouse nella camera a tenuta di luce dell'imager in modo che il fianco che porta lo xenotrapianto sia rivolto verso la fotocamera. Utilizzando il pannello di controllo dell'acquisizione, selezionare luminescente, fotografia e sovrapposizione.Imposta il tempo di esposizione su auto, il binning su medio e f-stop su uno e acquisisci immagini. Dopo la prima immagine, impostare il tempo di esposizione in modo che corrisponda a quello calcolato automaticamente per la prima immagine in modo che le immagini successive possano essere confrontate direttamente. Prendi un'altra serie di immagini con il topo supino per valutare la presenza di cellule T nei polmoni.Le cellule T armate trafficavano verso il tumore più velocemente delle cellule T disarmate, lasciando i polmoni due giorni prima. La quantificazione dell'infiltrazione delle cellule T nei tumori nel tempo è stata misurata mediante bioluminescenza ed espressa come stormi totali o radianza per pixel integrato sul contorno tumorale. Il traffico delle cellule T potrebbe essere monitorato per 28 giorni dopo l'iniezione delle cellule T trasdotte dalla luciferasi, consentendo di tracciare l'homing e la persistenza delle cellule T durante il trattamento.Viene mostrato il traffico di cellule T in xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario umano HER2 positivo in topi DKO. Il trattamento con l'anticorpo bispecifico HER2 con FC non silenziata non ha avuto alcun effetto sulla crescita tumorale rispetto a un anticorpo bispecifico controllato. Al contrario, il trattamento con l'anticorpo bispecifico HER2 contenente la mutazione N297A da solo o in combinazione con una mutazione K322A è stato in grado di arrestare completamente la crescita tumorale.Per i gruppi con mutazioni silenzianti, il segnale di luminescenza delle cellule T ha raggiunto un picco più elevato il terzo giorno dopo l'iniezione e persisteva a un livello più elevato rispetto all'anticorpo bispecifico controllato e all'anticorpo bispecifico HER2 non silenziato. I topi portatori di xenotrapianti derivati da pazienti affetti da neuroblastoma hanno dimostrato che la deplezione dei macrofagi positivi a Ly6C ha aumentato significativamente l'homing delle cellule T nei tumori, con conseguente diminuzione della crescita tumorale e sopravvivenza prolungata. L'effetto era più pronunciato negli xenotrapianti derivati da pazienti affetti da osteosarcoma.Tra gli anticorpi bispecifici mirati all'antigene tumorale STEAP1, il formato IGGL SCFV ha determinato un'infiltrazione di cellule T significativamente maggiore il sesto giorno dopo la prima dose di cellule T che è persistita per tutta la durata del trattamento. Tali osservazioni non sono state previste da saggi di citotossicità in vitro. Dopo aver monitorato le cellule T in vivo, gli utenti possono ancora eseguire l'immunoistochimica per determinare più specificamente dove si trovano le cellule T all'interno del tumore o di altri tessuti normali.

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Cancer Research

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Murine trapianto di midollo osseo è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi immunologici che regolano graft-versus-host disease negli esseri umani. La capacità di monitorare il traffico delle cellule T...

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Questo video dimostra un metodo per tracciare il traffico di cellule T indotte da anticorpi bispecifici ai tumori in un modello murino. Le cellule T effettrici trasdotte dalla luciferasi vengono iniettate in un topo con uno xenotrapianto di cellule tumorali sottocutanee. Vengono quindi introdotti anticorpi bispecifici, legandosi alle cellule T e alle cellule tumorali. La localizzazione delle cellule T viene tracciata utilizzando l'imaging bioluminescente, con l'entità del segnale che indica...

Una tecnica in vivo per tracciare il traffico di cellule T indotte da anticorpi bispecifici nei tumori

Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l'utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l'attivazione delle cellule T.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Descriviamo un protocollo per monitorare la mobilità radiale delle cellule immunitarie non aderenti in vitro utilizzando un collettore/apparato di vetrini per sedimentazione cellulare. La migrazione cellulare viene tracciata su monostrati di cellule tumorali o su proteine della matrice extracellulare. L'esame al microscopio ottico e a fluorescenza consente di osservare la mobilità cellulare e la funzionalità citotossica.

Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

Seguendo la preparazione di un anticorpo monoclonale 64 Cu-modificata legandosi ad un recettore delle cellule T transgenico murino, cellule T sono radiomarcato in vivo, analizzati per la vitalità, funzionalità, stabilità etichettatura e apoptosi e adoptively trasferite in topi con una cannula ipersensibilità di tipo ritardato reazione per l'imaging non invasiva mediante tomografia a emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT).

Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione e la sperimentazione pre-clinica di cellule CD19 auto T murine di trasduzione retrovirale e l'utilizzazione come terapia contro il linfoma della B-cellula di A20 syngeneic stabilita nei topi BALB/c con o senza lymphodepleting pre-condizionamento.

Un modello di linfoma della B-cellula Syngeneic del topo per la valutazione pre-clinica delle cellule di T di CD19 auto

Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento primario delle cellule T murine e la microscopia time-lapse della migrazione delle cellule T in specifiche condizioni ambientali con analisi quantitativa.

Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie

Presentiamo protocolli migliorati per la trasduzione retrovirale dei recettori del traffico e l'homing competitivo per studiare il posizionamento dei linfociti specifici per organo e microambiente mediati dal recettore. Questo metodo offre preziose informazioni sui meccanismi di traffico delle cellule immunitarie e ha potenziali applicazioni nella futura ricerca di base e terapeutica.

Trasduzione retrovirale efficiente e homing competitivo per lo studio della localizzazione delle cellule T mediata da GPCR in diversi microambienti tissutali

Scopri come tracciare le cellule T in vivo mediante luciferasi per valutare l'efficacia antitumorale degli anticorpi bispecifici. Questo metodo non invasivo consente il monitoraggio longitudinale nel tempo.

Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi

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