Name: Un modello murino di instabilità articolare del complesso caviglia-sottoastragalico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Scopri un modello murino di instabilità articolare del complesso caviglia-sottoastragalico mediante sezione dei legamenti. Questo metodo consente di studiare meccanismi patologici e strategie terapeutiche per patologie del piede.

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Questo studio è stato sostenuto dal programma di borse di studio del governo provinciale di Jiangsu e dal programma accademico prioritario di sviluppo degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu (PAPD).

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Soochow University.
1. Procedure chirurgiche
<ol><li>Dividere 21 topi maschi C57BL/6 di 6 settimane in tre gruppi: il gruppo del legamento cervicale trasverso e del legamento peroneo-astragalico anteriore, il gruppo del legamento cervicale trasverso e del legamento deltoideo e il gruppo della chirurgia fittizia. Assicurarsi che tutti i topi siano stati allevati in un ambiente che soddisfi specifici standard di assenza di agenti patogeni (SPF).</li>
	<li>Acclimatare i topi al nuovo ambiente di allevamento (un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore e una temperatura e umidità costanti rispettivamente di 18-22 °C e 40%-70%) per 2 settimane prima dell'esperimento. Sottoponi i topi a un allenamento per l'equilibrio e l'andatura, passando da un'estremità di una trave di equilibrio o di un tubo a forma di U all'altra estremità senza fermarsi, 1 settimana prima dell'esperimento.</li>
	<li>All'età di 8 settimane, anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano bagnando un batuffolo di cotone con 2 ml di isoflurano e mettendolo in un contenitore ermetico per la completa volatilizzazione. Monitorare l'attività del topo e continuare l'inalazione fino a quando l'attività del topo non si è ridotta in modo significativo. Determinare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei topi per osservare le loro reazioni. Inalare l'isoflurano vaporizzato (2%) attraverso una maschera facciale per mantenere l'anestesia nei topi durante le operazioni successive. Utilizzare un unguento per gli occhi veterinario durante l'anestesia per evitare che gli occhi si secchino.</li>
	<li>Dopo l'anestesia, rimuovere i peli sull'articolazione della caviglia degli arti posteriori destri del topo con un rasoio e disinfettare la pelle esposta tre volte alternando cicli di batuffoli di cotone allo iodio e batuffoli di cotone imbevuti di alcol. Somministrare 5 mg/kg di carprofene per iniezione sottocutanea. Trasferire il topo nella sala operatoria dell'animale di microchirurgia utilizzando un tampone chirurgico sterile.</li>
	<li>Per il gruppo legamento cervicale trasverso e legamento peroneo-astragalico anteriore (CL + ATFL), eseguire un'incisione longitudinale obliqua verso il basso di 7 mm con un bisturi sulla pelle sopra l'articolazione della caviglia destra e sondare con una microscopica pinza diritta davanti all'articolazione della caviglia.</li>
	<li>Assicurarsi dell'esposizione dell'ATFL al bordo inferiore del corpo astragalico e del perone dopo il sondaggio e tagliarlo delicatamente con un bisturi. Separare i tendini del perone lungo e corto e i tendini estensori lunghi delle dita, esporre il CL e tagliarlo con un bisturi.</li>
	<li>Per il gruppo CL trasverso + legamento deltoide (DL), praticare un'incisione verticale di 8 mm sulla pelle mediale dell'articolazione della caviglia destra e separare bruscamente il DL dal malleolo mediale per tagliarlo definitivamente. Quindi, tagliare il CL come descritto al punto 1.5.</li>
	<li>Per il gruppo sham (gruppo di finta chirurgia), eseguire un intervento chirurgico fittizio sull'articolazione della caviglia destra ma non tagliare alcun legamento.</li>
	<li>Sciacquare l'incisione con soluzione fisiologica normale sterile e suturarla con filo di nylon chirurgico 5-0. Infine, disinfettare l'incisione suturata con un batuffolo di cotone iodico.</li>
	<li>Tenere il topo sotto osservazione fino a quando non è in grado di mantenere il decubito sternale e sorvegliarlo fino a quando non è completamente cosciente. Disinfettare l'incisione della caviglia due volte al giorno con un batuffolo di cotone allo iodio e somministrare carprofene (5 mg/kg, iniezione sottocutanea), una volta al giorno per 1 settimana. Alzati da solo dopo l'operazione e presta molta attenzione alle condizioni postoperatorie del topo.</li>
	<li>Due settimane dopo l'intervento chirurgico e quando il gonfiore dell'articolazione della caviglia si è ridotto, iniziare ad allenare i topi nella macchina per la fatica rotante del mouse per 1 ora al giorno.</li>
</ol>2. Test del fascio di equilibrio
<ol><li>Fissare una trave circolare in legno con una lunghezza di 1 m e un diametro di 20 mm, inclinata di 15° a un'estremità, con una clip per treppiede fotografico e posizionare l'altra estremità su un piano di lavoro collegato a una cassetta chiusa.</li>
	<li>Eseguire l'allenamento del fascio di equilibrio 1 settimana prima dell'intervento chirurgico per assicurarsi che i topi si muovano agevolmente da un'estremità all'altra del raggio. Si consideri che un topo ha superato il test quando passa attraverso il raggio due volte in 60 s senza fermarsi.</li>
	<li>Eseguire due prove consecutive per ogni topo e spruzzare il bilanciere con alcol al 75% dopo ogni prova per evitare che l'odore residuo del topo precedente influisca sul topo successivo.</li>
	<li>Eseguire il test del fascio di equilibrio prima dell'intervento, 3 giorni, 1 settimana, 4 settimane, 8 settimane e 12 settimane dopo l'intervento chirurgico. Registra il tempo medio di ogni topo che passa la trave di equilibrio due volte di seguito e il numero di volte in cui il retropiede destro scivola dalla trave come variabili dipendenti.</li>
</ol>3. Analisi dell'impronta
<ol><li>Posizionare un canale di plastica a forma di U con una lunghezza di 50 cm, una larghezza di 10 cm e un'altezza di 10 cm sul tavolo sperimentale e collegare un'estremità del canale di plastica a una cassetta chiusa.</li>
	<li>Posiziona una carta pigmentata piatta nel canale, quindi tieni il mouse con entrambe le mani e dipingi uniformemente le zampe anteriori e posteriori con pigmento rosso e verde non tossico.</li>
	<li>Posiziona delicatamente il mouse dipinto a un'estremità del canale e lascialo spostare all'altra estremità della cassetta. Prendi la carta pigmentata con le impronte, segnala e mettila su una griglia ad asciugare in un luogo ventilato e ombreggiato.</li>
	<li>Dopo che ogni topo è passato, spruzzare il canale di plastica a forma di U con alcol al 75% in modo da evitare che l'odore residuo del topo precedente influisca sul topo successivo.</li>
	<li>Seleziona tre impronte di topo chiare consecutive su ciascun foglio e usa un righello per misurare la lunghezza del passo dell'impronta del piede destro del mouse, nonché la larghezza del passo tra le impronte sinistra e destra.</li>
</ol>4. Valutazione della nocicezione termica
<ol><li>Durante l'esperimento, utilizzare il test plantare per registrare il tempo di reazione alla nocicezione termica del piede del topo e il tempo di reazione del topo durante l'attività e il riposo, rispettivamente. Registra i dati di misurazione in pochi secondi.</li>
	<li>Posizionare il mouse nello strumento di misura, allineare lo strumento con il piede destro e iniziare a riscaldare lo strumento con la temperatura che aumenta lentamente. Osserva la risposta del mouse. Quando la temperatura aumenta al di sopra della tolleranza, il mouse si ritrae rapidamente o si lecca il piede destro. Registrare il tempo utilizzando lo strumento e definire il tempo come tempo di reazione durante l'attività.</li>
	<li>Per misurare il tempo di reazione a riposo, lasciare che il mouse si sieda per 30 minuti sul tavolo di riposo senza riscaldarsi, quindi ottenere i dati temporali come spiegato al punto 4.2. Utilizzare questi dati temporali acquisiti per analisi successive.</li>
</ol>5. Scansione micro-CT
<ol><li>Sopprimere topi di 12 settimane con anidride carbonica dopo l'intervento, staccare la pelle della caviglia destra e poi tagliare la tibia media e il perone con forbici chirurgiche per ottenere campioni completi di caviglia. Collocare i campioni in provette da centrifuga da 15 mL contrassegnate contenenti formalina neutra al 10% per 48 ore.</li>
	<li>Dopo il fissaggio, posizionare i campioni in lotti (quattro campioni per lotto) in uno speciale serbatoio di spugna per la scansione micro-CT. Impostare i parametri della macchina come segue: tensione = 50 kV, corrente = 200 mA, filtro = 0,5 mmAl e risoluzione = 9 μm. Eseguire lo scanner micro-CT.</li>
	<li>Dopo la scansione, utilizzare il software di ricostruzione per delineare l'intervallo dell'immagine e selezionare una posizione angolare specifica dopo aver regolato l'asse XYZ dell'immagine delineata utilizzando un software di analisi dei dati commerciale, come descritto in Liu et al.10.</li>
	<li>Utilizzare il software di analisi micro-CT per selezionare le regioni continue a 10 strati di interesse nelle immagini ristrutturate regolate dagli assi XYZ e analizzare quantitativamente le articolazioni necessarie per determinare la frazione di volume osseo (BV/TV), come descritto in Liu et al.10.</li>
	<li>Infine, utilizzare un software di elaborazione delle immagini mediche tridimensionali per eseguire l'elaborazione tridimensionale delle immagini TC delle articolazioni della caviglia del topo, come descritto in Liu et al.10. Dopo la ricostruzione, osservare l'usura e la formazione degli osteofiti nell'ASCJ.</li>
</ol>6. Colorazione della cartilagine articolare in sezione
NOTA: Tutte le fasi di colorazione vengono eseguite in una cappa aspirante e durante la procedura viene indossata una maschera.
<ol><li>Utilizzare pinzette microscopiche e forbici per rimuovere i tessuti molli in eccesso intorno ai campioni di caviglia, quindi posizionare i campioni in una provetta da centrifuga contenente una soluzione di decalcificazione EDTA al 10% preparata con 44 g di NaOH, due confezioni di PBS e 400 g di EDTA-2Na, con il pH regolato a 7,35-7,45 con acido cloridrico, e contrassegnare i diversi gruppi.</li>
	<li>Successivamente, posizionare la provetta da centrifuga su un tavolo vibrante (velocità impostata su 20 giri/min) per la decalcificazione e cambiare la soluzione di decalcificazione una volta al giorno. Determinare la decalcificazione dei campioni.</li>
	<li>Dopo 1 mese di decalcificazione, disidratare i campioni con alcool a gradiente e quindi utilizzare l'n-butanolo per 8 ore a scopo di pulizia. Infine, immergere i campioni eliminati in paraffina in posizione coronale per l'inclusione.</li>
	<li>Mettere i campioni di paraffina in frigorifero a 4 °C per un uso successivo. Prima del sezionamento, prelevare i campioni dal frigorifero a 4 °C e metterli in un congelatore a -20 °C per circa 10 minuti per facilitare il taglio dell'intero piano.</li>
	<li>Fissare i campioni sul microtomo e sezionarli a uno spessore di 6 μm. Allo stesso tempo, utilizzare un microscopio per osservare se i campioni sono stati tagliati al livello previsto: facilità di penetrazione di un ago da siringa nel tessuto osseo.</li>
	<li>Regolare in anticipo la temperatura dell'acqua della comprimitrice a 40 °C. Quindi, taglia due o tre sezioni complete di paraffina in fila e trasferiscile nella macchina per compresse per un'espansione completa. Quindi, rimuovere le sezioni di paraffina con un vetrino e scolare l'acqua. Infine, contrassegna le diapositive con gruppi e numeri.</li>
</ol>7. Colorazione dell'ematossilina e dell'eosina (H&E)
<ol><li>Mettere le sezioni in un incubatore a 60 °C in modo tale che la struttura intatta dell'articolazione ASCJ possa essere osservata al microscopio e cuocere le sezioni per 40-50 minuti. Quindi, decerare le sezioni con xilene 3x, numerate come I, II e III per una facile identificazione, rispettivamente per 15 minuti, 15 minuti e 10 minuti.</li>
	<li>Posizionare le sezioni decerate in etanolo al 100% 2x, numerato come I e II per una facile identificazione, etanolo al 90% ed etanolo all'80% rispettivamente per 3 minuti, 3 minuti, 5 minuti e 5 minuti. Successivamente, lavare le sezioni con acqua bidistillata (ddH2O) per 5 min.</li>
	<li>Dopo l'ammollo con ematossilina per 1 minuto, lavare le sezioni con ddH2O fino a quando non diventano incolori. Immergere le sezioni in una soluzione di differenziazione dell'etanolo acido all'1% per 30 s e lavarle 3 volte per 1 min con ddH2O. Successivamente, colorare le sezioni con una soluzione di ammoniaca all'1% per 1 minuto, quindi lavare 3 volte per 1 minuto ciascuna con ddH2O.</li>
	<li>Successivamente, colorare i campioni con una soluzione colorante di eosina per 1 minuto, quindi metterli in etanolo al 95% e etanolo al 100% per 1 minuto ciascuno in successione. Infine, trattare le sezioni con xilene IV per 1 minuto.</li>
	<li>Asciugare all'aria le sezioni, incollare una goccia di resina neutra sui campioni sui vetrini e coprirli con un vetrino coprioggettivo. Quindi, scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a 5x e 20x.</li>
</ol>8. Colorazione verde Safranina O-fast
<ol><li>Mettere le sezioni selezionate in un'incubatrice a 60 °C e cuocere le sezioni per 40-50 minuti. Quindi, decerare le sezioni con xilene I, II e III rispettivamente per 15 minuti, 15 minuti e 10 minuti.</li>
	<li>Posizionare le sezioni decerate in etanolo al 100% I, II, etanolo al 90% ed etanolo all'80% rispettivamente per 3 minuti, 3 minuti, 5 minuti e 5 minuti. Successivamente, lavare le sezioni con ddH2O per 5 min.</li>
	<li>Dopo l'ammollo con ematossilina per 1 minuto, lavare le sezioni con ddH2O fino a quando non diventano incolori. Immergere le sezioni in una soluzione di differenziazione dell'etanolo acido all'1% per 30 s e lavarle 3 volte per 1 min con ddH2O. Quindi, colorare le sezioni con una soluzione di ammoniaca all'1% per 1 minuto e lavarle 3 volte per 1 minuto ciascuna con ddH2O.</li>
	<li>Immergere le sezioni in verde rapido allo 0,05% per 2 minuti, quindi immergere le sezioni in una soluzione di acido acetico all'1% per 30 secondi e in safranina allo 0,1% per 5 minuti. Mettere i campioni colorati in etanolo al 95% ed etanolo al 100% per 1 minuto, uno dopo l'altro.</li>
	<li>Infine, trattare le sezioni con xilene IV per 1 minuto. Asciugare all'aria le sezioni, incollare una goccia di resina neutra sui campioni sui vetrini e coprirli con un vetrino coprioggettivo. Quindi, scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a 5x e 20x.</li>
</ol>9. Immunoistochimica
<ol><li>Giorno 1: Mettere le sezioni selezionate in un'incubatrice a 60 °C, cuocere le sezioni per 40-50 minuti, quindi decerarle con xilene I, II e III rispettivamente per 15 minuti, 15 minuti e 10 minuti. Posizionare le sezioni decerate in etanolo al 100% I, II, etanolo al 90% ed etanolo all'80% rispettivamente per 3 minuti, 3 minuti, 5 minuti e 5 minuti. Quindi, lavare le sezioni con ddH2O per 5 minuti, utilizzare una penna istochimica per cerchiare l'area del campione e posizionarle in una scatola scura.</li>
	<li>Recupero dell'antigene: far cadere 20-50 μL di tripsina allo 0,25% nell'area del campione cerchiato, incubare in un incubatore a 37 °C per 60 minuti, quindi lavare i campioni 3 volte per 2 minuti ciascuno con PBS. Bloccare la perossidasi endogena aggiungendo il 3% di H 2 O 2 , incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente al buio e poi lavarli 3 volte per2minuti ciascuno con PBS. Eseguire il blocco del siero aggiungendo il 10% di siero di capra a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi incubare con l'anticorpo primario (collagene di tipo II anti-topo di topo, diluito 1.000 volte) a 4 °C per una notte.</li>
	<li>Giorno 2: Riscaldare le sezioni a temperatura ambiente per 30 min. Recuperare l'anticorpo primario e lavare le sezioni 3 volte per 2 minuti ciascuna con PBS. Incubare con l'anticorpo secondario per 40 minuti in un'incubatrice a 37 °C, quindi lavare le sezioni 3 volte per 2 minuti ciascuna con PBS.</li>
	<li>Sviluppo del colore DAB: aggiungere 5 mL di ddH 2O, due gocce di tampone, quattro gocce di DAB e due gocce di H 2 O2per preparare il reagente DAB. Aggiungere 20-50 μL di reagente alle sezioni, tenere i campioni al riparo dalla luce per 5 minuti, quindi lavare le sezioni per 2 minuti con ddH2O.</li>
	<li>Dopo l'ammollo con ematossilina per 1 minuto, lavare le sezioni con ddH2O fino a quando non diventano incolori. Immergere le sezioni in una soluzione di differenziazione dell'etanolo acido all'1% per 30 secondi e lavarle 3 volte per 1 minuto ciascuna con ddH 2 O. Colorare le sezioni per 1 minuto con una soluzione di ammoniaca all'1%, quindi lavarle 3 volte per 1 minuto ciascuna conddH2O.</li>
	<li>Quindi, posizionare le sezioni rispettivamente in etanolo al 95% ed etanolo al 100% per 1 minuto ciascuna. Infine, incubare le sezioni per 1 minuto con xilene IV. Asciugare all'aria le sezioni, incollare una goccia di resina neutra sui campioni sui vetrini e coprirli con un vetrino coprioggettivo. Quindi, scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a 5x e 20x.</li>
</ol>

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<li>Pritzker, K. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+cartilage+histopathology%3A+Grading+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).</li>
<li>Glasson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative+-+Recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).</li>
<li>Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ankle+sprain+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Acute ankle sprain in a mouse model.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).</li>
<li>Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+ankle+sprain+in+a+mouse+model%3A+Lifelong+sensorimotor+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Athletic+Training%22%5BJournal%5D)">Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction.</a> Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).</li>
<li>Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+detection+and+Semmes-Weinstein+monofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hand+Therapy%22%5BJournal%5D)">Threshold detection and Semmes-Weinstein monofilaments.</a> Journal of Hand Therapy. 8 (2), 155-162 (1995).</li>
<li>Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+-+An+untreatable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis - An untreatable disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha interessi contrastanti.

In questo studio, due modelli murini di instabilità ASCJ sono stati costruiti con successo sezionando CL + ATFL o CL + DL. Il tempo impiegato dai topi per passare attraverso il fascio di equilibrio è aumentato significativamente a 8 settimane e 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, il che è simile ai risultati ottenuti dal team Hubbard-Turner tagliando il legamento laterale dell'articolazione della caviglia23,24. Nel test di scorrimento del piede destro, abb...

Le distorsioni della caviglia sono uno degli infortuni sportivi più comuni in tutto il mondo. Si stima che 10.000 persone si infortunano ogni giorno negli Stati Uniti1, di cui gli infortuni legati allo sport rappresentano il 15%-45%2. I costi medici associati al trattamento delle distorsioni della caviglia negli Stati Uniti ammontano a 4,2 miliardi di dollari all'anno 3,4,5. L'instabilità cronica del piede è un problema comune dopo le distorsioni della caviglia e si verifica in circa il 74% delle distorsioni della caviglia6, compresa l'instabilità della caviglia o sottoastragalica. Tuttavia, a causa dei sintomi e dei segni clinici simili, è difficile per il personale medico distinguere se l'instabilità cronica della caviglia è accompagnata anche da un'instabilità cronica dell'articolazione sottoastragalica in clinica e, di conseguenza, l'instabilità cronica del sottoastragalo può essere facilmente ignorata. Pertanto, la vera incidenza dell'instabilità cronica dell'articolazione complessa caviglia-sottoastragalica (ASCJ) (un tipo specifico di instabilità cronica del piede che include sia l'instabilità cronica della caviglia che l'instabilità cronica sottoastragalica) può essere superiore a quella riportata 7,8,9. Se non trattata, l'instabilità cronica dell'articolazione del complesso caviglia-sottoastragalico può causare ripetute distorsioni della caviglia, portando a un circolo vizioso di distorsioni della caviglia e instabilità cronica del complesso caviglia-sottoastragalico. L'instabilità cronica a lungo termine del complesso caviglia-sottoastragalico può portare alla degenerazione dell'ASCJ e all'artrosi post-traumatica, che può interessare le articolazioni adiacenti nei casi più gravi10. Per queste malattie, l'attuale trattamento clinico è principalmente conservativo, oltre ai metodi di trattamento chirurgico come la riparazione dei legamenti e la ricostruzione dei legamenti11,12.
L'ASCJ è la struttura centrale del piede e mantiene l'equilibrio del corpo durante il movimento13. Sono state condotte ricerche approfondite sulla struttura dell'articolazione della caviglia e dell'articolazione sottoastragalica separatamente14,15,16,17. Tuttavia, la ricerca sull'intera articolazione caviglia-sottoastragalica è rara. Circa un quarto dei casi di lesione alla caviglia è associato a lesione dell'articolazione sottoastragalica18. A causa del complesso meccanismo di lesione dell'instabilità dell'ASCJ, non c'è consenso sulla diagnosi e sul trattamento in ambito clinico. Considerando l'attuale situazione delle lesioni alla caviglia in clinica, è necessario un metodo più scientifico per studiare la caviglia e l'articolazione sottoastragalica nel suo complesso, fornendo così una nuova comprensione per lo studio delle malattie del piede.
Poiché la struttura anatomica del retropiede del topo a livello muscolo-scheletrico è paragonabile a quella del piede umano 19, in diversi studi sono già stati implementati modelli murini per la ricerca piede/caviglia10,19. Chang et al.19 hanno sviluppato con successo tre diversi modelli murini di osteoartrosi della caviglia. Ispirati dall'instaurazione dell'instabilità della caviglia nel modello murino, abbiamo stabilito un modello murino per l'instabilità del complesso caviglia-sottoastragalico, ipotizzando che la transezione dei legamenti parziali nel retropiede del topo avrebbe provocato un'instabilità meccanica dell'ASCJ, che avrebbe portato all'osteoartrite post-traumatica (PTOA) dell'ASCJ. Il modello animale di instabilità ASCJ potrebbe essere utilizzato per il trattamento sia dell'instabilità della caviglia che dell'instabilità sottoastragalica, che è più in linea con la situazione clinica reale rispetto al modello di instabilità della caviglia semplice 7,8,9,19 attualmente utilizzato. Per testare questa ipotesi, sono stati progettati due modelli murini di instabilità indotta da transezione legamentosa dell'ASCJ. I risultati per la funzione senso-motoria - il test del fascio di equilibrio, l'analisi dell'impronta e la valutazione della nocicezione termica - sono stati utilizzati per valutare la fattibilità del modello, mentre la micro-tomografia computerizzata (TC) e la colorazione istologica sono state utilizzate per valutare il danno e la degenerazione della cartilagine articolare del topo. Il successo della creazione di un modello murino di instabilità ASCJ non solo fornisce una nuova comprensione per lo studio delle malattie del piede, ma fornisce anche un prezioso riferimento per la ricerca clinica sui meccanismi correlati alla lesione, fornisce migliori opzioni di trattamento per le distorsioni della caviglia ed è utile per ulteriori studi sulla malattia.

<table><tbody><tr><td>5-0 Sutura chirurgica in nylon</td><td>Ningbo Medical Needle Co., Ltd.</td><td></td><td></td>191104</tr><tr><td>Soluzione acida di differenziazione dell'etanolo (1%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R20778</td><td></td></tr><tr><td>Diapositive adesive</td><td>Jiangsu Shitai Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ammoniaca (1%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R20788</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo anidro</td><td>Shanghai Sinopharm Group Reagente chimico Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico acquoso (1%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R20773</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta cubo nero</td><td>Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga 15ml</td><td>Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.</td><td>YA0476</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga 50ml</td><td>Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.</td><td>YA0472</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>Jiangsu Shitai Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAn software</td> di <td>analisi micro-CT</td><td>scientifica</td><td></td> blu</tr><tr><td>software di analisi Dataview software</td><td>AEMC strumenti</td><td></td><td>di analisi dei dati commerciali software di analisi dei dati</td></tr><tr><td>disodici etilendiamminotetraacetato (EDTA-2Na)</td><td>Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.</td><td>E8490</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice elettrica</td><td>Suzhou Huamei Equipment Factory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incorporamento di paraffina</td><td>Leica, Germania</td><td>39001006</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colorante di eosina (solubile in alcool, 1%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R30117</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di colorazione verde veloce</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>F7275</td><td></td></tr><tr><td>Carta per l'andatura</td><td>Baoding Huarong Paper Factory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0</td><td>Software Graphpad</td><td></td><td>strumenti di analisi statistica online</td></tr><tr><td>Iodophor batuffoli di cotone</td><td>Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 818 lama</td><td>Leica, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Skyscan, Belgio</td><td>SkyScan 1176</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per micromanipolazione</td><td>Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imita il software</td><td>Materialise&nbsp;</td><td></td><td>Software di elaborazione di immagini mediche 3D&nbsp;</td></tr><tr><td>Modificato Harris Hematoxylin Stain</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R20566</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-topo tipo II collagene</td><td>American Abcam Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-butanolo</td><td>Shanghai Sinopharm Group Reagente chimico Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fissativo neutro in formalina (10%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina neutra</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di ricostruzione Nrecon&nbsp;</td><td>Micro Fotonica Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oaks tagliacapelli</td><td>Oaks Group Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina per l'inclusione di paraffina</td><td>Leica, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH metro</td><td>Shanghai Leitz Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>American Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina fisiologica (per mammiferi, sterile)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R22172</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O-soluzione colorante</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>HT90432</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina (0,9%)</td><td>Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.</td><td></td><td></td>309107</tr><tr><td>Shaker</td><td>Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td><td></td><td></td>2008779</tr><tr><td>SPSS 23</td><td>Strumenti di analisi statistica online</td><td>IBM</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per compresse</td><td>Leica, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice per tessuti</td><td>Leica, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ugo Basile</td><td>Ugo Basile Biological Research Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza verticale</td><td>Zeiss Axiovert, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canale in plastica a forma di U</td><td>Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unguento veterinario per gli occhi</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>YLS-10B Tester di fatica della ruota</td><td>Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello murino di instabilità articolare del complesso caviglia-sottoastragalico

A Mouse Model of Ankle-Subtalar Complex Joint Instability

Le distorsioni della caviglia sono forse gli infortuni sportivi più comuni nella vita quotidiana, spesso con conseguente instabilità dell'articolazione del complesso caviglia-sottoastragalico (ASCJ) e possono eventualmente portare all'artrosi post-traumatica (PTOA) a lungo termine. Tuttavia, a causa della complessità del meccanismo della lesione e delle manifestazioni cliniche, come ecchimosi, ematoma o dolorabilità nel piede laterale, non esiste un consenso clinico sulla diagnosi e sul trattamento dell'instabilità dell'ASCJ. Poiché la struttura muscolo-scheletrica delle ossa e dei legamenti del retropiede del topo è paragonabile a quella degli esseri umani, un modello animale di instabilità dell'ASCJ nei topi è stato stabilito dalla transezione dei legamenti attorno all'ASCJ. Il modello è stato ben convalidato attraverso una serie di test comportamentali e analisi istologiche, tra cui un test del fascio di equilibrio, un'analisi dell'impronta (una valutazione del livello di esercizio e della capacità di equilibrio nei topi), una valutazione della nocicezione termica (una valutazione della funzione sensoriale del piede nei topi), una scansione con tomografia microcomputerizzata (TC) e la colorazione della sezione della cartilagine articolare (una valutazione del danno e della degenerazione della cartilagine articolare nei topi). Il successo della creazione di un modello murino di instabilità ASCJ fornirà un prezioso riferimento per la ricerca clinica sul meccanismo della lesione e si tradurrà in migliori opzioni di trattamento per la distorsione della caviglia.

L'analisi statistica dei dati di correlazione è stata effettuata utilizzando strumenti di analisi statistica online. I dati che hanno soddisfatto i due test di distribuzione normale e omogeneità della varianza sono stati utilizzati per un'ulteriore analisi statistica mediante analisi unidirezionale della varianza. Se i dati non soddisfacevano i due test, per l'analisi statistica è stato utilizzato il test di Kruskal-Wallis. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD) e p &lt; 0,05 è stato consider...

L'articolazione complessa caviglia-sottoastragalica (ASCJ) è il nucleo del piede e svolge un ruolo chiave nel controllo dell'equilibrio nelle attività quotidiane. Gli infortuni sportivi spesso portano all'instabilità di questa articolazione. Qui, descriviamo un modello murino di instabilità indotta dalla transezione legamentosa dell'ASCJ.

Un modello murino di instabilità articolare del complesso caviglia-sottoastragalico

Ankle sprains are perhaps the most common sports injuries in daily life, often resulting in instability of the ankle-subtalar complex joint (ASCJ), and ...

Il successo dell'istituzione del modello murino di incapacità ASCJ estende un semplice modello animale di incapacità della caviglia e fornisce nuovi concetti per lo studio delle malattie cliniche del piede. Abbiamo creato un modello animale più in linea con la situazione clinica reale, che può essere utilizzato per ulteriori ricerche sulla diagnosi e il trattamento delle malattie del piede. Una settimana prima dell'esperimento, sottoponi i topi a un allenamento di equilibrio e andatura, passando da un'estremità all'altra di una trave di equilibrio o di un tubo a forma di U, senza fermarsi.Dopo aver anestetizzato e rimosso i peli sull'articolazione della caviglia degli arti posteriori destri del topo, disinfettare la pelle esposta con un tampone di iodio. Trasferire il topo nella sala operatoria dell'animale di microchirurgia utilizzando un tampone chirurgico sterile. Per i gruppi trasversali del legamento cervicale e del legamento peroneo-astragalico anteriore, praticare un'incisione longitudinale obliqua verso il basso di sette millimetri con un bisturi sulla pelle sopra l'articolazione della caviglia destra.E sonda con microscopiche pinze diritte nella parte anteriore dell'articolazione della caviglia. Assicurandosi l'esposizione del legamento peroneo-astragalico anteriore al bordo inferiore del corpo astragalico e del perone, tagliarlo delicatamente con un bisturi. Separare i tendini peroneali lunghi e corti e i tendini estensori lunghi delle dita.Esporre il legamento cervicale e tagliarlo con un bisturi. Per il gruppo legamento cervicale trasverso più legamento deltoide, praticare un'incisione verticale di otto millimetri sulla pelle mediale dell'articolazione della caviglia destra e separare bruscamente il DL dal malleolo mediale per tagliarlo. Quindi tagliare il legamento cervicale come dimostrato in precedenza.Per il gruppo fittizio, eseguire un intervento chirurgico fittizio sull'articolazione della caviglia destra. Dopo aver lavato l'incisione con soluzione fisiologica normale sterile, suturarla con filo di nylon chirurgico 5-0, seguita dalla disinfezione dell'incisione suturata con un tampone di iodio. Una volta che il gonfiore dell'articolazione angolare si è ridotto a due settimane dall'intervento chirurgico, esercitare i topi nella macchina per la fatica rotante del mouse per un'ora al giorno.Per il test della trave di equilibrio, clamp una trave di legno circolare inclinata di 15 gradi a un'estremità con una clip per treppiede fotografico e posizionare l'altra estremità su una superficie di lavoro collegata a una cassetta chiusa. Eseguire l'allenamento del fascio di equilibrio una settimana prima dell'intervento chirurgico per assicurarsi che i topi si muovano agevolmente da un'estremità all'altra del fascio. Si consideri che un topo ha superato il test quando passa attraverso il raggio due volte in 60 secondi senza fermarsi.Dopo ogni prova, spruzzare il bilanciere con alcol al 75% per presentare l'odore residuo del topo precedente che influisce sul topo successivo. Eseguire il test della trave di bilanciamento e registrare il tempo medio di passaggio di ciascun mouse sulla trave di equilibrio due volte di seguito. E il numero di volte in cui il piede posteriore destro scivola fuori dalla trave, come variabili dipendenti.Per l'analisi dell'impronta, posizionare un canale di plastica a forma di U sul tavolo sperimentale e collegare un'estremità del canale di plastica a una cassetta chiusa. Posiziona una carta pigmentata semplice nel canale. Quindi tieni il mouse con entrambe le mani e dipingi i piedi anteriori e posteriori in modo uniforme con pigmento rosso e verde non tossico.Ora, posiziona il mouse dipinto a un'estremità del canale e lascialo spostare all'altra estremità della cassetta. Prendete la carta pigmentata con le impronte, segnatela e lasciatela asciugare in uno spazio ventilato e ombreggiato. Spruzzare il canale di plastica a forma di U con alcol al 75% dopo che ogni topo è passato, per evitare che l'odore residuo del topo precedente influisca sul topo successivo.Selezionare tre impronte di topo chiare consecutive su ciascun foglio. Usando un righello, misura la lunghezza del passo dell'impronta del piede destro del mouse, con la larghezza del passo tra le impronte sinistra e destra. Usa pinzette e forbici microscopiche per rimuovere i tessuti molli in eccesso intorno ai campioni di caviglia.Quindi, posizionare i campioni in una provetta da centrifuga contenente una soluzione di decalcificazione EDTA al 10% e contrassegnare i diversi gruppi. Quindi, posizionare la provetta da centrifuga su un tavolo vibrante per la decalcificazione. Cambiare la soluzione di decalcificazione una volta al giorno e determinare la decalcificazione dei campioni.Dopo un mese di decalcificazione, disidratare i campioni con alcool a gradiente, quindi utilizzare l'N-butanolo per otto ore a scopo di pulizia. Infine, immergere i campioni eliminati in paraffina in posizione coronale per l'inclusione. Prima del sezionamento, trasferire i campioni dal frigorifero a quattro gradi Celsius a un congelatore a meno 20 gradi Celsius per circa 10 minuti, per facilitare il taglio completo dei piani.Fissare i campioni sul microtomo e sezionarli in uno spessore di sei micrometri. Allo stesso tempo, utilizzare un microscopio per osservare se i campioni sono stati tagliati al livello previsto per una facile penetrazione dell'ago di una siringa nel tessuto osseo. Dopo aver tagliato due o tre sezioni complete di paraffina in fila, trasferirle nella macchina per compresse, impostata a 40 gradi Celsius, per un'espansione completa.Quindi rimuovere le sezioni di paraffina con un vetrino. Infine, contrassegna le diapositive con gruppi e numeri. Osservare al microscopio la struttura intatta dell'articolazione ASCJ.Mettere le sezioni in un'incubatrice a 60 gradi Celsius per 40-50 minuti. Quindi decerare le sezioni con xilene tre volte, come descritto nel manoscritto. Mettere le sezioni decerate in etanolo al 100% due volte per tre minuti, seguite da etanolo al 90% e all'80% per cinque minuti ciascuna.Quindi lavare le sezioni con acqua bidistillata per cinque minuti. Dopo l'ammollo in ematossilina per un minuto, lavare le sezioni con acqua bidistillata fino a quando non diventano incolori. Immergere le sezioni in una soluzione di differenziazione dell'etanolo acido all'1% per 30 secondi e lavarle con acqua bidistillata.Una volta che le sezioni sono state colorate con una soluzione di ammoniaca all'1% e lavate con acqua bidistillata, colorare i campioni con una soluzione colorante di eosina per un minuto. E poi metterli in 95% e 100% di etanolo in successione per un minuto ciascuno. Infine, trattare le sezioni con xilene quattro per un minuto.Asciugare le sezioni all'aria e coprirle con un vetrino coprioggetto, dopo aver incollato una goccia di resina neutra sui campioni sui vetrini. Quindi scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a cinque e 20X. Immergere le sezioni macchiate di ematossilina e ammoniaca in verde rapido allo 0,05% per due minuti.Successivamente immergere le sezioni in una soluzione di acido acetico all'1% per 30 secondi e in safranina allo 0,1% per cinque minuti. Quindi trattare i vetrini con etanolo e xilene come dimostrato in precedenza. Scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a 5X e 20X.Dopo tre giorni, otto settimane e 12 settimane di intervento chirurgico, i gruppi legamentosi recisi hanno impiegato molto più tempo a passare attraverso la trave di equilibrio rispetto al gruppo fittizio. Prima dell'intervento chirurgico, la lunghezza del passo del piede posteriore destro era paragonabile tra i tre gruppi di topi. Tuttavia, 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, la lunghezza del passo era più breve nel gruppo con taglio dei legamenti rispetto al gruppo fittizio.Prima dell'intervento chirurgico, il tempo di risposta alla nocicezione termica dei piedi dei topi durante l'attività è simile tra i tre gruppi di topi. Dopo l'intervento chirurgico, i topi nel gruppo con taglio dei legamenti hanno mostrato tempi di risposta più lunghi rispetto al gruppo fittizio. L'ASCJ del piede posteriore destro nei gruppi legamentosi recisi ha mostrato superfici ruvide, accumulo di osteofiti, alterazioni degenerative.E una frazione di volume osseo significativamente più alta rispetto al gruppo fittizio. Lo strato di cartilagine dell'ASCJ nel gruppo di taglio dei legamenti ha mostrato discontinuità e diminuzione del numero di condrociti. Inoltre, i punteggi di Malkin e Osteoarthritis Research Society International dei topi con amputazione dei legamenti erano significativamente più alti rispetto al gruppo fittizio.Il collagene di tipo due nello strato di cartilagine articolare ASCJ del gruppo fittizio del piede posteriore destro era più uniforme e superiore a quello dei due gruppi di topi con legamenti recisi. Questo studio può essere utilizzato per la diagnosi e i trattamenti per l'instabilità della caviglia, e fornire un riferimento sperimentale per i trattamenti clinici di questa malattia.

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