Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

Questo protocollo fornisce un metodo per studiare la funzione delle cellule staminali del colon in un ambiente manipolabile con costi inferiori nel tempo rispetto ai modelli animali. La coltura organoide consente lo studio della funzione delle cellule staminali in un ambiente immuno-libero. Ciò consente di individuare gli effetti di una causa specifica, come il knockout di claudina-7.

Comprendere i meccanismi della funzione delle cellule staminali può far luce su nuovi bersagli terapeutici per malattie debilitanti come la malattia infiammatoria intestinale e il cancro del colon-retto. Per iniziare l'isolamento delle cripte del colon dal topo eutanasiato, fai un'incisione di circa due pollici lungo la linea mediana del topo. Quindi, fissare indietro la pelle per esporre l'addome.

Tagliare il colon appena sotto il cieco dal lato prossimale e sopra il retto dal lato distale per isolare il colon. Quindi, rimuovere il tessuto adiposo attaccato al colon usando una pinza. Dopo aver spinto fuori le feci dal colon isolato con l'estremità piatta della pinza, tagliare il tessuto aperto longitudinalmente.

Lavare il tessuto da 10 a 15 volte con PBS freddo facendo roteare il tessuto intorno in PBS tra i lavaggi con una pinza. Quindi, usando un paio di forbici pulite e affilate, tagliare il tessuto in piccoli pezzi che vanno da circa tre a cinque millimetri. Dopo aver isolato il colon da un altro topo eutanasia, combinare tutti i pezzi di tessuto in una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente mezzi di dissociazione epiteliale fredda e incubare i pezzi di tessuto del colon in mezzi di dissociazione epiteliale per 90 minuti a quattro gradi Celsius con un leggero dondolio.

Dopo l'incubazione, lasciare che i frammenti di tessuto affondino sul fondo del tubo. Una volta sistemato, scartare i mezzi di dissociazione epiteliale senza interrompere i frammenti di tessuto. Ripetere il processo quando si lava il tessuto da 10 a 15 volte con PBS freddo.

Scartare quanto più PBS possibile durante il lavaggio finale. Quindi, aggiungere il mezzo di dissociazione della cripta fredda ai pezzi di tessuto del colon lavati in un tubo da 50 millilitri e agitare per cinque o 10 minuti a mano. Sotto il cappuccio della coltura cellulare, filtrare il mezzo contenente il tessuto con un filtro cellulare in nylon da 70 micron in una provetta da centrifuga fresca da 50 millilitri.

Dopo la filtrazione, centrifugare il tubo a 200 G per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi scartare il surnatante senza disturbare le cripte pellettizzate. Risospendere il pellet in tre o quattro millilitri di PBS freddo. Pipettare 10 microlitri della sospensione della cripta in una linea su un vetrino da microscopio.

Utilizzando il microscopio, contare il numero di cripte piene e lunghe per stimare la concentrazione di cripte e calcolare il volume appropriato di cripte necessarie per placcare 10 cripte per microlitro in una piastra da 96 pozzetti. Centrifugare un volume appropriato di cripte isolate in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri a 200 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri senza interrompere le cripte pellettate.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di matrice di gel alle cripte pellettate senza introdurre bolle d'aria. Attendere uno o due minuti fino a quando la matrice di gel è parzialmente solidificata. Quindi, piastra 10 microlitri della matrice di gel mescolati con le cripte in ciascun pozzetto di una piastra di coltura preriscaldata a 96 pozzetti per formare una forma a cupola.

Attendere da 10 a 20 minuti affinché la matrice di gel sia completamente impostata posizionando la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Infine, aggiungere 100 microlitri della soluzione di lavoro appena preparata di mezzi L-WRN integrati con antibiotici a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per raccogliere gli organoidi, rimuovere i vecchi mezzi dai pozzetti applicando l'aspirazione sottovuoto e fissare gli organoidi con paraformaldeide al 4% per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere il 4% di paraformaldeide dai pozzetti mediante aspirazione sottovuoto e trattare gli organoidi con 100 microlitri di saccarosio al 30% per pozzetto a quattro gradi Celsius. Dopo 24 ore, rimuovere il 30% di saccarosio dai pozzetti mediante aspirazione sottovuoto prima di aggiungere 10 microlitri di PBS a ciascun pozzetto. Utilizzare una punta di pipetta per grattare delicatamente il fondo del pozzetto per dissociare gli organoidi contenenti la cupola.

Quindi, rimuovere il PBS contenente gli organoidi dissociati dal pozzetto con una pipetta e trasferirlo in uno stampo di plastica etichettato riempito al 90% con temperatura di taglio ottimale, o OCT, composto. Continuare il processo fino a quando tutti gli organoidi sono stati rimossi da tutti i pozzi. Aggiungere 2-metilbutano a un pallone Dewar in acciaio inossidabile contenente pellet di ghiaccio secco, sufficiente a coprire il pellet.

Congelare il blocco OCT contenente organoide tenendolo costantemente sopra il 2-metilbutano. Infine, conservare il blocco OCT contenente organoidi a meno 80 gradi Celsius fino al momento della sezione. L'immagine rappresentativa evidenzia la crescita di successo dei colonoidi dalle normali cripte contenenti claudina-7.

Le cripte contenenti claudina-7 hanno iniziato a formare sferoidi dal secondo giorno, hanno iniziato a germogliare il quinto giorno e hanno continuato a crescere e germogliare fino a quando non sono state raccolte il nono giorno. Al contrario, le cripte prive di claudina-7 non sono riuscite a formare colonoidi appropriati. Dopo il trattamento con 4-idrossitamoxifene per due o tre giorni, le cripte knockout claudina-7 apparivano come grumi circolari di cellule.

A differenza del controllo, le cripte non sono cresciute in sferoidi sani. La colorazione a immunofluorescenza per claudina-7 nel controllo raccolto e gli organoidi knockout condizionali hanno confermato il successo del knockout di claudina-7 in coltura. I colonoidi di controllo hanno mostrato pochissimo segnale apoptotico il nono giorno.

Tuttavia, i colonoidi knockout claudin-7 mostravano un'alta apoptosi allo stesso tempo. Garantire una solidificazione parziale prima della placcatura. La placcatura prima della solidificazione parziale causerà la diffusione della matrice di gel e la cupola non si formerà, influenzando la sopravvivenza e la crescita delle cripte.

Questo protocollo può essere utilizzato per la scoperta di farmaci, lo studio della comunicazione cellulare, il metabolismo dei farmaci, la vitalità, la proliferazione e lo sviluppo di trattamenti personalizzati specifici per il paziente. L'istituzione della cultura organoide ha rivoluzionato lo studio delle malattie e la medicina personalizzata.