Name: Utilizzo della microscopia ad espansione per ingrandire fisicamente embrioni di Drosophila a montaggio intero per limaging a super-risoluzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara la microscopia ad espansione per ottenere immagini a super-risoluzione di embrioni di Drosophila senza microscopi specializzati. Questo protocollo consente di superare il limite di diffrazione espandendo fisicamente il campione.

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Vorremmo ringraziare la dottoressa Jennifer Zallen per aver fornito l'anticorpo primario anti-Par-3 per porcellini d'India. Questo lavoro è stato sostenuto da un generoso finanziamento (1R15GM143729-01 e 1P20GM139768-01 5743) del National Institute of General Medical Science (NIGMS), uno dei membri del National Institutes of Health (NIH), nonché dell'Arkansas Biosciences Institute (ABI), che ha fornito finanziamenti parziali per l'acquisto del nostro microscopio confocale.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Devitellinizzazione manuale La maggior parte dei protocolli di fissazione embrionale di Drosophila prevede la rimozione della membrana vitellina scuotendo gli embrioni fissati in un'emulsione di metanolo ed eptano, che provoca lo scoppio delle membrane attraverso la rottura osmotica26. Mentre la devitellinizzazione a base di metanolo (metanolo popping) è efficace e appropriata per molte applicazioni, la devitellinizzazione manuale (peeling manuale) offre alcuni vantaggi significativi. In primo luogo, il peeling manuale consente di scegliere embrioni in stadi precisi da devitellinizzare e raccogliere, aumentando notevolmente la probabilità di ottenere embrioni espansi in un orientamento utilizzabile alla fine dell'esperimento. Questo arricchimento è fondamentale quando si studiano aspetti specifici di processi di sviluppo rapidi (ad esempio, l'invaginazione del mesoderma o l'estensione convergente), per i quali gli embrioni stadiati in modo appropriato possono rappresentare solo una piccola percentuale di tutti gli embrioni, anche all'interno di una finestra di raccolta strettamente temporizzata. Naturalmente, per molte applicazioni, sarà sufficiente il più tradizionale spuntamento di metanolo di embrioni da una finestra di raccolta temporizzata, e il peeling manuale potrebbe non valere lo sforzo aggiuntivo. In secondo luogo, il legame di alcuni anticorpi e coloranti primari è influenzato negativamente dalla precedente esposizione del campione al metanolo. Per questo motivo, il peeling manuale può produrre aumenti significativi della qualità del segnale di immunofluorescenza rispetto ai campioni con metanolo, rendendolo una tecnica generale utile per i biologi dello sviluppo della Drosophila .
Microscopia confocale ad alta risoluzione in embrioni di Drosophila espansi a montaggio intero Mentre l'esecuzione della microscopia confocale ad alta risoluzione su campioni espansi è concettualmente la stessa di quella su campioni non espansi, ExM introduce alcuni ostacoli tecnici. In particolare, l'orientamento dell'embrione, che è casuale, diventa ancora più importante con l'aumentare della dimensione del campione, perché gli obiettivi ad alto ingrandimento e ad alto NA sono in grado di focalizzare la luce solo dalle regioni del campione che sono molto vicine al vetrino coprioggetto27. Pertanto, di solito è possibile concentrarsi solo sulle cellule in corrispondenza o vicino alla superficie dell'embrione che sono finite adiacenti al vetrino coprioggetto quando si è formato il gel. Il modo migliore per assicurarsi che ci siano campioni con l'orientamento corretto alla fine è quello di iniziare il protocollo ExM con una raccolta di embrioni fissi in fasi fitte (ad esempio, utilizzando il peeling manuale) e di seminare molti embrioni in ogni pozzetto (>10). Per visualizzare le cellule in profondità all'interno dell'embrione, potrebbe essere necessario utilizzare configurazioni di imaging più specializzate, come la microscopia a foglio di luce28. Inoltre, troviamo che la qualità dell'immagine può essere migliorata aprendo il foro stenopeico confocale a una dimensione maggiore di un'unità airy. Naturalmente, un aumento delle dimensioni del foro stenopeico avrà il costo di una diminuzione della risoluzione massima, ma in pratica, anche piccoli aumenti della dimensione del foro stenopeico possono aumentare significativamente l'intensità del segnale (dati non mostrati). Gli studi futuri dovrebbero affrontare sistematicamente la dimensione del foro stenopeico e la risoluzione effettiva nei campioni ExM.
Variazioni sull'ExM di base Il protocollo qui descritto è un esempio relativamente semplice di ExM che dovrebbe funzionare per molte applicazioni ed essere facile da implementare nella maggior parte dei laboratori di biologia dello sviluppo. Tuttavia, ci sono numerose variazioni sul concetto di base di ExM 4,5,7 che possono essere utilizzate per aumentare l'intensità del segnale, raggiungere ulteriori gradi di espansione e rilevare molecole di acido nucleico e proteine. In questo protocollo, gli embrioni vengono incubati con anticorpi prima della gelificazione e dell'espansione. In alternativa, i campioni possono essere trattati con anticorpi dopo essere stati espansi 6,30, il che può aumentare l'intensità del segnale a causa della maggiore accessibilità dell'epitopo e della diminuzione della perdita di anticorpi legati durante le fasi di espansione. Inoltre, specifiche molecole reticolanti possono essere utilizzate per legare molecole di RNA all'idrogel per consentire la rilevazione di RNA in gel espansi utilizzando il metodo della reazione a catena di ibridazione30. Infine, i campioni possono essere sottoposti a cicli multipli di espansione, come nella microscopia ad espansione iterativa (iExM)31, pan-ExM32 e nella rivelazione di espansione (ExR)31, per ottenere gradi ancora più elevati di maggiore risoluzione.

Nella biologia cellulare e dello sviluppo, vedere per credere, e la capacità di determinare con precisione i modelli di localizzazione delle proteine è fondamentale per molti tipi di esperimenti. La microscopia confocale a scansione laser è lo strumento standard per l'imaging di proteine marcate con fluorescenza in tre dimensioni all'interno di campioni intatti. I microscopi confocali convenzionali non sono in grado di distinguere (risolvere) i segnali fluorescenti adiacenti che sono separati da meno della metà della lunghezza d'onda della luce che emettono1. In altre parole, due sorgenti puntiformi devono essere separate da almeno 200-300 nm in direzione laterale (500-700 nm in direzione assiale) per risolverle come due segnali distinti. Questa barriera tecnica è nota come limite di diffrazione, ed è un ostacolo fondamentale per lo studio di strutture subcellulari complesse (ad esempio, le reti citoscheletriche o mitocondriali dell'actomiosina) con caratteristiche spaziali al di sotto del limite di diffrazione. Pertanto, le tecniche per aumentare il potere risolutivo dei microscopi confocali convenzionali sono di interesse generale per la comunità biologica.
Per aggirare il limite di diffrazione, sono state sviluppate diverse tecnologie di microscopia a super-risoluzione che consentono una risoluzione dell'ordine di decine di nanometri o meno 1,2,3, rivelando un mondo di complessità biologica che in precedenza era accessibile solo tramite microscopia elettronica. Nonostante gli ovvi vantaggi di questi metodi basati su hardware, i microscopi a super-risoluzione hanno spesso requisiti specifici per l'etichettatura dei campioni e lunghi tempi di acquisizione, limitando la loro flessibilità, o potrebbero semplicemente essere troppo costosi per alcuni laboratori. Un'alternativa alla super-risoluzione basata sul microscopio è la microscopia ad espansione (ExM), che non è un tipo di microscopia di per sé, ma è piuttosto un metodo per gonfiare un campione preservando l'organizzazione spaziale relativa delle molecole che lo costituiscono. I campioni espansi isotropicamente possono quindi essere osservati con una risoluzione effettivamente aumentata utilizzando un microscopio confocale a fluorescenza tradizionale. ExM è stato descritto per la prima volta dal gruppo di Boyden nel 20155 e da allora la tecnica di base è stata adattata per l'uso in una varietà di esperimenti 6,7,8. ExM è stato anche adattato per l'uso in embrioni interi, in particolare in Drosophila 9,10,11, C. elegans12 e zebrafish 13, rendendolo un potente strumento per i biologi dello sviluppo.
ExM si basa su due diverse sostanze chimiche dell'idrogel: 1) idrogel di polielettrolita gonfiabili, che aumentano notevolmente di dimensioni quando vengono immersi in acqua14, e 2) idrogel di poliacrilammide, che hanno una spaziatura del polimero estremamente piccola per consentire l'espansione isotropadel campione 15. Sebbene esistano molti protocolli ExM pubblicati, generalmente condividono le seguenti fasi: fissazione del campione, etichettatura, attivazione, gelificazione, digestione ed espansione4. Le condizioni di fissazione e le strategie di marcatura della fluorescenza variano ovviamente in base alle esigenze dell'esperimento e del sistema e, in alcuni protocolli, l'etichettatura avviene dopo l'espansione. Le molecole bersaglio nel campione devono essere innescate (attivate) per il legame con l'idrogel, che può essere ottenuto utilizzando diverse sostanze chimiche4. Durante le fasi di gelificazione, il campione viene saturo con monomeri del futuro idrogel (acrilato di sodio, acrilammide e bisacrilammide reticolante) e l'idrogel viene quindi formato mediante polimerizzazione di radicali liberi catalizzata da un iniziatore, come il persolfato di ammonio (APS), e da un acceleratore, come la tetrametilendiammina (TEMED)4. Dopo la gelificazione, il campione viene digerito enzimaticamente per omogeneizzare la resistenza del campione al rigonfiamento e garantire l'espansione isotropa dell'idrogel4. Infine, l'idrogel digerito viene posto in acqua, il che lo fa espandere fino a circa quattro volte la sua dimensione lineare originale4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> Figura 1: Panoramica della microscopia di espansione negli embrioni di Drosophila . ExM è un protocollo multi-step che richiede almeno 4 giorni per essere completato. La raccolta, la fissazione e la devitellinizzazione degli embrioni richiedono 1 giorno o più, a seconda che gli embrioni provenienti da più raccolte siano raggruppati. La marcatura in immunofluorescenza richiede 1 giorno o 2 giorni a seconda che gli embrioni vengano incubati durante la notte con gli anticorpi primari. L'attivazione, la gelificazione, la digestione e l'espansione dell'embrione possono essere eseguite in un solo giorno. I gel possono essere montati e sottoposti a imaging immediatamente dopo l'espansione, anche se per motivi pratici è spesso auspicabile iniziare l'imaging il giorno successivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo protocollo descrive come eseguire ExM su embrioni di Drosophila in stadio iniziale e intermedio16 per visualizzare i modelli di localizzazione delle proteine subcellulari a super-risoluzione (Figura 1). Questo metodo utilizza la chimica dell'estere N-idrossisuccinimidil dell'acido metilacrilico (MA-NHS) per attivare e ancorare le molecole proteiche all'idrogel17 ed è una modifica di un protocollo ExM precedentemente pubblicato per l'uso in embrioni e tessuti di Drosophila in fase avanzata11. Questo protocollo utilizza pozzetti di polidimetilsilossano (PDMS) per modellare gli idrogel e facilitare lo scambio di soluzioni durante l'attivazione e la gelificazione. Un metodo alternativo che non richiede la creazione di pozzetti PDMS prevede l'abbassamento degli embrioni attaccati ai vetrini coprioggetti in gocce di soluzione monomerica che si trovano su un pezzo di pellicola sigillante da laboratorio22. Inoltre, questo protocollo descrive un metodo per rimuovere manualmente la membrana impermeabile vitellina che circonda gli embrioni di Drosophila , che è un prerequisito per la colorazione in immunofluorescenza. È importante sottolineare che questo metodo di peeling manuale degli embrioni può essere utilizzato per selezionare solo embrioni di Drosophila adeguatamente stadiati prima dell'etichettatura del campione, il che aumenta notevolmente la probabilità di ottenere campioni espansi dello stadio e dell'orientamento corretti e, quindi, rende la raccolta dei dati a valle molto più efficiente.

<table><tbody><tr><td>acrilammide</td><td>Milipore Sigma</td><td>1490-100ML</td><td></td></tr><tr><td>persolfato di ammonio</td><td>VWR</td><td>BDH9214-500G</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo policlonale di coniglio anti-GFP</td><td>Torrey Pines BioLabs</td><td>TP-401</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo policlonale di capra IgG di cavia, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11075</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo policlonale di capra IgG di coniglio, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>bisacrilammide</td><td>Research Products International</td><td>A11275</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina (soluzione al 30%)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>tubi conici, 50 mL</td><td>fisherscientific&nbsp;</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>vetro coverlab, quadrato 22 mm</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>vetro vetrino, rettangolare 40 mm x 24 mm</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>capillari in vetro per l'estrazione degli aghi World</td><td>Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>aghi per microiniezione in vetro (pre-tirati)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TIP10LT</td><td></td></tr><tr><td>guanidina HCl</td><td>VWR</td><td>101970-606</td><td></td></tr><tr><td>eptano</td><td>VWR</td><td>EM-HX0078-1</td><td></td></tr><tr><td>pipetta in lattice</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>acido metilacilico N-idrossisuccinimidil estere</td><td>VWR</td><td>730300-1G</td><td></td></tr><tr><td>provetta per microfuge, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>piastra multipozzetto, 6 pozzetti</td><td>Genesee</td><td>25-100</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide (16%, grado EM, senza metanolo)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>509804487 (Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur (2 mL, punta corta)</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Kit PDMS (Sylgard 184 Kit, base e agente indurente)</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri</td><td>Genesee</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione 10x)</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina (soluzione allo 0,1%)</td><td>VWR</td><td>P8920-1ooML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E00491</td><td></td></tr><tr><td>fiale di scintillazione (30 mL)</td><td>VWR</td><td>66022-128</td><td></td></tr><tr><td>acrilato di sodio</td><td>VWR</td><td>101181-226</td><td></td></tr><tr><td>azoturo di sodio ( polvere)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>71289</td><td>fa un 1% w/v stock di lavoro; VELENO acuto a questa concentrazione!</td></tr><tr><td>Streptavidina, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>TAE (50x)</td><td>VWR</td><td>97063-692</td><td></td></tr><tr><td>nastro (biadesivo, 1 pollice di larghezza)</td><td>Scotch&nbsp; 3M</td><td>665 Scotch bifacciale 1 pollice/1296 pollici Boxed</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TEMED Thermo Fisher Scientific</td><td>PI17919</td><td></td></tr><tr><td>TEMPO</td><td>VWR</td><td>EM8.14681.0005</td><td>ossidante catalitico</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>97063-872</td><td>estremamente viscoso quando puro; fare un 10% di stock di lavoro con acqua</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopio a scansione laser utilizzato senza AiryScan</td></tr></tbody></table>

utilizzo della microscopia ad espansione per ingrandire fisicamente embrioni di drosophila a montaggio intero per l'imaging a super-risoluzione

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Il cavallo di battaglia della biologia dello sviluppo è il microscopio confocale, che consente ai ricercatori di determinare la localizzazione tridimensionale delle molecole marcate all'interno di campioni biologici complessi. Mentre i microscopi confocali tradizionali consentono di risolvere due sorgenti puntiformi fluorescenti adiacenti situate a poche centinaia di nanometri di distanza, l'osservazione dei dettagli più fini della biologia subcellulare richiede la capacità di risolvere segnali nell'ordine delle decine di nanometri. Sono stati sviluppati numerosi metodi basati su hardware per la microscopia a super-risoluzione per consentire ai ricercatori di aggirare tali limiti di risoluzione, sebbene questi metodi richiedano microscopi specializzati che non sono disponibili per tutti i ricercatori. Un metodo alternativo per aumentare il potere risolutivo consiste nell'ingrandire isotropicamente il campione stesso attraverso un processo noto come microscopia ad espansione (ExM), che è stato descritto per la prima volta dal gruppo di Boyden nel 2015. L'ExM non è un tipo di microscopia di per sé , ma è piuttosto un metodo per gonfiare un campione preservando la relativa organizzazione spaziale delle molecole che lo costituiscono. Il campione espanso può quindi essere osservato con una risoluzione effettivamente maggiore utilizzando un microscopio confocale tradizionale. Qui, descriviamo un protocollo per l'implementazione di ExM in embrioni di Drosophila a montaggio intero, che viene utilizzato per esaminare la localizzazione di Par-3, miosina II e mitocondri all'interno delle cellule epiteliali di superficie. Questo protocollo produce un aumento di circa quattro volte della dimensione del campione, consentendo il rilevamento di dettagli subcellulari che non sono visibili con la microscopia confocale convenzionale. Come prova di principio, un anticorpo anti-GFP viene utilizzato per distinguere pool distinti di miosina-GFP tra cortecce cellulari adiacenti e la streptavidina marcata con fluorescenza viene utilizzata per rilevare molecole biotinilate endogene per rivelare i dettagli fini dell'architettura della rete mitocondriale. Questo protocollo utilizza anticorpi e reagenti comuni per la marcatura a fluorescenza e dovrebbe essere compatibile con molti protocolli di immunofluorescenza esistenti.

Per caratterizzare l'efficacia generale di ExM negli embrioni di Drosophila a montaggio intero, la lunghezza dell'embrione lungo l'asse testa-coda è stata misurata negli embrioni di controllo non espansi rispetto agli embrioni espansi (Figura 3A-C). Gli embrioni di controllo non espansi sono stati sottoposti alle stesse condizioni di fissazione e alle stesse fasi di marcatura dell'immunofluorescenza degli embrioni espansi, tranne per il fatto che sono stati montati utilizzando un mezzo di montaggio solidificato prima dell'imaging. I singoli embrioni non espansi coprivano circa la metà di un campo visivo quando si utilizzava un obiettivo 10x (Figura 3A). Al contrario, gli embrioni espansi coprivano approssimativamente due campi visivi completi quando si utilizzava lo stesso obiettivo 10x (Figura 3B). Per valutare come il grado di espansione variasse sia all'interno che tra gli esperimenti, lo stesso protocollo ExM è stato eseguito in tre diverse occasioni e la lunghezza dell'embrione è stata misurata in tre diversi gel all'interno di ogni singolo esperimento. La lunghezza media dalla testa alla coda degli embrioni di controllo non espansi era di 398,8 μm (deviazione standard [SD] = 22,93 μm; n = 74; Figura 3C). Per l'esperimento 1, l'esperimento 2 e l'esperimento 3, la lunghezza media degli embrioni era rispettivamente di 1.596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1.868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) e 1.954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), che rappresentano fattori di espansione rispettivamente di 4,0 volte, 4,7 volte e 4,9 volte (Figura 3C). La variazione intra-sperimentale tra i gel era molto meno evidente rispetto alla variazione inter-sperimentale, che era di circa il 20% (Figura 3C). Per valutare gli effetti di ExM sulla morfologia delle cellule e degli embrioni, è stato utilizzato un anticorpo contro il componente della giunzione aderente Par-3 (Bazooka)21 per marcare le membrane cellulari apicali e abbiamo analizzato i segmenti della bocca in via di sviluppo degli embrioni di Drosophila in stadio 11, uno stadio con una struttura segmentata complessa (Figura 3D-F). Nel campione di controllo, le cellule del segmento mascellare avevano una larghezza media di 4,76 μm (SD = 1,053 μm, n = 25; Figura 3D,F). Nei campioni espansi ripresi utilizzando lo stesso obiettivo 40x e lo stesso fattore di zoom (1x), le cellule nel segmento mascellare avevano una larghezza media di 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Figura 3E,F), che rappresenta un'espansione di 4,0 volte. Pertanto, coerentemente con i precedenti rapporti11, siamo stati in grado di espandere gli embrioni di Drosophila a montaggio intero di circa quattro volte in dimensioni lineari utilizzando ExM senza lacerazione del campione o evidenti distorsioni nella morfologia cellulare o tissutale.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> Figura 3: Espansione quadruplicata degli embrioni di Drosophila. (A) Embrioni di Drosophila non espansi e (B) espansi ripresi utilizzando un obiettivo 10x (0,3 NA) con zoom 1x. I singoli campi visivi (FOV) sono indicati con linee tratteggiate. Gli embrioni esprimevano una versione marcata con GFP della catena leggera della miosina e sono stati colorati con un anticorpo anti-GFP. (C) Quantificazione della lunghezza dell'embrione (lungo l'asse testa-coda) in tre idrogel per esperimento e da tre esperimenti ExM separati rispetto ai controlli non espansi. (D,E) Segmenti mascellari di embrioni di Drosophila in stadio 11 non espansi e (E) espansi ripresi utilizzando un obiettivo 40x (1,3 NA) con zoom 1x. I contorni cellulari (giunzioni aderenti) sono stati rilevati con un anticorpo anti Par-3/Bazooka (bianco). (F) Quantificazione della larghezza della cella (asse lungo) da gruppi equivalenti di cellule di (D) e (E). I box plot in (C) e (F) mostrano gli intervalli del 25°, 50° e 75° percentile; i baffi indicano i valori minimo e massimo; I simboli "+" indicano la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per dimostrare che ExM può essere utilizzato per risolvere i dettagli subcellulari al di sotto del tipico limite di diffrazione, il citoscheletro dell'actomiosina è stato visualizzato in controllo non espanso rispetto agli embrioni espansi sottoposti a estensione convergente (stadio 7). Gli eventi di rimodellamento tissutale della gastrulazione e dell'estensione convergente sono in gran parte controllati da cambiamenti nella localizzazione della proteina motoria miosina II24. Tuttavia, nell'epitelio colonnare densamente impacchettato del primo ectoderma di Drosophila , è difficile osservare molti dettagli fini del modello di localizzazione della miosina II, anche quando viene ripreso con un ingrandimento di 158x (obiettivo 63x con uno zoom ottico 2,5x), un tipico potere risolutivo massimo per un microscopio confocale a scansione laser. Ad esempio, poiché la miosina II è una proteina corticale (situata direttamente sotto la membrana plasmatica), i pool di miosina II25 situati su entrambi i lati dei contatti cellula-cellula non erano risolvibili negli embrioni allo stadio 7 e apparivano come un'unica linea in cui le cellule vicine si incontravano (Figura 4A). Al contrario, negli embrioni in stadio 7 espanso, è stato possibile osservare linee parallele di miosina II alle giunzioni cellula-cellula, che rappresentano pool proteici corticali nelle cellule adiacenti (Figura 4B). La distanza tra le linee parallele della miosina II nei campioni espansi è stata di 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); se diviso per quattro, questo produce una distanza prevista di ~220 nm tra le linee di miosina nelle cellule adiacenti in embrioni non espansi, che è effettivamente appena al di sotto del limite di diffrazione per un segnale rilevato con Alexa 488 (emissione di picco di ~520 nm/2 = 260 nm).
Inoltre, abbiamo anche testato se ExM potesse essere utilizzato per risolvere l'architettura della rete mitocondriale in cellule densamente impacchettate di embrioni di Drosophila gastrulanti (stadio 6). La funzione mitocondriale è strettamente legata alla struttura della rete (cioè organelli fusi e frammentati), ma i dettagli dell'organizzazione della rete mitocondriale sono difficili da visualizzare utilizzando la microscopia confocale convenzionale in tipi di cellule che non sono piatte e/o sottili. I mitocondri sono naturalmente ricchi di molecole biotinilate e, quindi, i mitocondri possono essere marcati nell'embrione precoce di Drosophila utilizzando la streptavidina26 marcata in modo fluorescente. Negli embrioni non espansi in stadio 6 marcati con streptavidina-Alexa 488, il segnale è apparso come punti citoplasmatici spesso sovrapposti e difficili da risolvere (Figura 4C). Al contrario, negli embrioni in stadio 6 espanso, erano visibili molti più dettagli fini della rete mitocondriale e i punti erano più facilmente risolvibili (Figura 4D)26,27. Questi risultati indicano che ExM può essere utilizzato per studiare l'organizzazione della rete mitocondriale in tipi di cellule non tradizionalmente adatte all'analisi mitocondriale.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> Figura 4: Dettagli del citoscheletro dell'actomiosina e dei mitocondri rivelati dalla microscopia ad espansione. (A,B) Localizzazione della miosina II in cellule di neuroectoderma (banda germinale) visualizzate con un obiettivo 63x (1,4 NA) con zoom 2,5x in embrioni non espansi di stadio 7 (A) e (B) espansi. La miosina II è stata rilevata negli embrioni che esprimono una versione transgenica marcata con GFP della catena leggera regolatoria della miosina II (sqh-GFP), che è stata rilevata con un anticorpo anti-GFP (rosso). Pool distinti di miosina corticale situati nelle cellule adiacenti possono essere risolti nell'embrione espanso (frecce bianche). (C,D) Reti mitocondriali in cellule di neuroectoderma visualizzate con un obiettivo 63× (1,4 NA) con zoom 2,5x in embrioni non espansi (C) ed espansi (D) allo stadio 6. I mitocondri sono stati rilevati con streptavidina-Alexa 488 (verde) e i contorni cellulari sono stati rilevati con un anticorpo anti-Par-3/Bazooka (magenta). Gli esperimenti sono stati eseguiti con un microscopio confocale a scansione laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Ricette di soluzione. Composizione delle soluzioni utilizzate in questo protocollo in ordine di apparizione. Tutte le scorte sono liquide, salvo diversa indicazione. Le sostanze chimiche sono state risospese o diluite in acqua filtrata in autoclave, salvo diversa indicazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Qui viene presentato un protocollo per l'implementazione della microscopia ad espansione nei primi embrioni di Drosophila per ottenere immagini a super-risoluzione utilizzando un microscopio confocale convenzionale a scansione laser.

Utilizzo della microscopia ad espansione per ingrandire fisicamente embrioni di Drosophila a montaggio intero per l'imaging a super-risoluzione

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Questo protocollo può essere implementato nella maggior parte dei laboratori di biologia dello sviluppo dell'esofago, consentendo ai ricercatori che non hanno accesso ai microscopi a super risoluzione di produrre immagini a super risoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di aggirare il limite di diffrazione della microscopia confocale convenzionale senza richiedere un microscopio a super risoluzione espandendo il campione stesso. Questo protocollo sarà utile per coloro che studiano come la localizzazione delle proteine influenzi la morfologia o la funzione cellulare negli embrioni intatti, in particolare quando tali proteine sono organizzate in strutture o reti subcellulari complesse.Il problema più comune che le persone incontrano è la perdita di embrioni durante il protocollo. Si consiglia di applicare più mani di Poli-L-Lisina per far aderire saldamente gli embrioni. Dopo gli embrioni, prendi una base di plastica di sei centimetri riempita per metà con agar al 3%.Incidete un rettangolo di cinque centimetri per tre nell'agar con una lama di rasoio o un bisturi. Rimuovere la lastra di agar utilizzando una piccola spatola da laboratorio. Quindi capovolgere la base della piastra di Petri, posizionarla sul banco e posizionare la lastra di agar sopra la piastra capovolta.Rimuovere il coperchio dalla piastra di Petri e assicurarsi che sia asciutto. Usando i guanti, attacca un pezzo di nastro biadesivo all'interno del coperchio. Estrarre le fiale contenenti gli embrioni rivestiti e fissati dall'agitatore e posizionarle verticalmente sul banco di lavoro.Lasciare che le fasi organiche e acquose si separino. Gli embrioni correttamente fissati dovrebbero rimanere alla loro interfaccia. Rimuovere completamente la fase acquosa inferiore utilizzando una pipetta Pasteur e una pipetta P200.Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro dotata di un bulbo in lattice per trasferire gli embrioni fissati su una lastra di agar in più piccoli lotti in modo che non aderiscano all'interno della pipetta. Una volta che gli embrioni sono sulla lastra di agar, utilizzare una pipetta P200 per rimuovere l'eptano rimanente vicino agli embrioni. A questo punto, far cadere il coperchio del nastro biadesivo sulla lastra di agar da un'altezza di due centimetri per far aderire gli embrioni al nastro.Rimuovere delicatamente il coperchio dalla lastra di agar, posizionarla capovolta sul banco e aggiungere PBS Tween a sufficienza per coprire gli embrioni nel coperchio. Per raccogliere gli embrioni desiderati, utilizzare uno stereomicroscopio da dissezione a 100x con illuminazione indiretta. Bucherellare la membrana vitellina vicino all'estremità anteriore o posteriore dell'embrione con un ago di vetro sottile per sgonfiarla e rilasciare la pressione.Utilizzare una pinza fine o una sonda metallica per spingere delicatamente l'embrione attraverso il foro con la membrana vitellina ancora aderente al nastro biadesivo. Lasciare gli embrioni indesiderati sul nastro. Utilizzare periodicamente una pipetta di vetro Pasteur per raccogliere eventuali embrioni devitellinizzati galleggianti e spostarli in una provetta microfuge da 1,5 millilitri.Preparare la soluzione PDMS in un tubo conico da 50 millilitri e creare un tubo bilanciato aggiungendo una quantità appropriata di acqua a un secondo tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare la soluzione PDMS a 500G per tre minuti a 15 gradi Celsius. Quindi versarlo in una capsula di Petri da 10 centimetri a una profondità di un millimetro.Lasciare solidificare la soluzione PDMS durante la notte a 55 gradi Celsius. Una volta che la lastra PDMS è solidificata, incidere aree quadrate leggermente più piccole di un vetrino coprioggetto di 22 x 22 millimetri utilizzando un bisturi. All'interno di ogni quadrato, incidete e rimuovete un quadrato largo otto millimetri.trasferire bene ogni PDMS quadrato su un vetrino coprioggetto di 22 x 22 millimetri e farlo aderire saldamente. Per far aderire gli embrioni ai vetrini copricopertini, applicare una quantità sufficiente allo 0,1% di poli-L-lisina per coprire la superficie del vetrino coprioggetto all'interno di ciascun pozzetto e metterli ad asciugare in un'incubatrice a 55 gradi Celsius. Sciacquare brevemente gli embrioni e il PBS per rimuovere il detersivo Tween.Quindi trasferire più di 10 embrioni in ogni pozzetto rivestito di poli-L-lisina. Lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo dei pozzetti. Rimuovere il liquido in eccesso dagli embrioni aderenti utilizzando una pipetta Pasteur e procedere immediatamente alla fase successiva.Mentre gli embrioni si trovano nella soluzione di monomero, preparare una soluzione di gelificazione per coprire i pozzetti PDMS. Diluire l'ossidante catalitico appena estratto dalla polvere. Combinare 3.920 microlitri di soluzione monomerica con 60 microlitri di TEMED al 10% e 20 microlitri di TEMPO all'1%.Dividere la soluzione di gelificazione in aliquote da 125 microlitri in più provette PCR. Rimuovere la soluzione di monomero dai pozzetti PDMS utilizzando un vuoto o una pipetta, facendo attenzione a non distruggere gli embrioni. Aggiungere cinque microlitri di APS a una delle provette PCR contenenti la soluzione di gelificazione per avviare la polimerizzazione.Distribuire rapidamente la soluzione di gelificazione polimerizzante tra i tre pozzetti. Ripetere l'operazione fino a coprire tutti i pozzetti e gli embrioni. Lasciare gelificare i campioni per 1,5-2,5 ore a 37 gradi Celsius.Gli idrogel più densi impiegheranno più tempo per completare la polimerizzazione e solidificare. Agitare spesso gli idrogel per monitorare la polimerizzazione. Una volta solidificati, gli idrogel non si muovono.Dopo la gelificazione, staccare i pozzetti PDMS dal vetrino coprioggetto senza disturbare gli idrogel. Trasferire gli idrogel singolarmente nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Gli idrogel possono espandersi leggermente durante la digestione.Coprire completamente i gel con il tampone digestivo. 30 millilitri di tampone digestivo sono sufficienti per coprirli in una piastra a sei pozzetti e incubarli per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo la digestione, spostare gli idrogel in una capsula di Petri di sei centimetri e riempirla con acqua deionizzata per espandersi.A questo punto gli idrogel possono staccarsi dai vetrini di copertura ed espandersi di quattro volte in dimensione lineare. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere quanta più acqua in eccesso possibile dalla capsula di Petri per ridurre al minimo il movimento dei gel durante la manipolazione. Manovrare i gel espansi con gli embrioni sulla superficie inferiore su un ampio vetrino coprioggetto per l'imaging.Montare ogni vetrino coprioggetto con gel sull'obiettivo di un microscopio confocale a scansione laser invertita. Dopo aver individuato i campioni correttamente posizionati e orientati, sono passati a un obiettivo ad immersione in olio o acqua ad alto ingrandimento per ottenere l'immagine ad alta risoluzione. La misurazione della lunghezza dell'embrione lungo l'asse testa-coda con un obiettivo 10x ha mostrato che gli embrioni non espansi coprivano circa la metà di un campo visivo, mentre gli embrioni espansi coprivano circa due campi visivi completi.La lunghezza media della testa alla coda degli embrioni di controllo non espansi era di 398,8 micrometri. Per gli esperimenti uno, due e tre, la lunghezza media degli embrioni era costituita da fattori di espansione rispettivamente di 4,0 volte, 4,7 volte e 4,9 volte. Nel campione di controllo, le cellule del segmento mascellare avevano una larghezza media di 4,76 micrometri.Nei campioni espansi, le cellule nel segmento mascellare avevano una larghezza media di 19,10 micrometri, che rappresenta un'espansione di 4,0 volte. Il citoscheletro dell'actomiosina è stato visualizzato in controllo non espanso rispetto agli embrioni espansi, sottoposti a estensione convergente. Apparivano come un'unica linea in cui si incontravano le cellule vicine.Al contrario, negli embrioni in stadio sette espanso, è stato possibile osservare linee parallele di miosina due alle giunzioni cellulari, che rappresentano pool proteici corticali nelle cellule adiacenti. Negli embrioni non espansi allo stadio sei, i mitocondri marcati con streptavidina apparivano come una foschia citoplasmatica eterogenea senza chiari dettagli subcellulari. Tuttavia, negli embrioni espansi, numerosi punti erano risolvibili all'interno del citoplasma, probabilmente rappresentando mitocondri frammentati o porzioni della rete mitocondriale.Una cosa importante da ricordare quando si tenta questa procedura è proteggere gli embrioni dall'eccessiva esposizione alla luce dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi.

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Microscopia a espansione: Imaging fluorescente ad alta risoluzione con microscopio convenzionale

Impara la microscopia ad espansione per ottenere immagini a super-risoluzione di embrioni di Drosophila senza microscopi specializzati. Questo protocollo consente di superare il limite di diffrazione espandendo fisicamente il campione.

Utilizzo della microscopia ad espansione per ingrandire fisicamente embrioni di Drosophila a montaggio intero per limaging a super-risoluzione (Video) | JoVE Journal

Utilizzo della microscopia ad espansione per ingrandire fisicamente embrioni di Drosophila a montaggio intero per l'imaging a super-risoluzione

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