Name: Modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Scopri come generare organoidi 3D murini oro-esofagei per modellare il carcinoma squamoso esofageo (ESCC). Questo protocollo permette di studiare i cambiamenti molecolari e testare nuove strategie terapeutiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo le risorse condivise (citometria a flusso, patologia molecolare e microscopia confocale e specializzata) presso l'Herbert Irving Comprehensive Cancer Center della Columbia University per il supporto tecnico. Ringraziamo i dottori Alan Diehl, Adam J. Bass e Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) e i membri dei laboratori Rustgi e Nakagawa per le utili discussioni. Questo studio è stato supportato dai seguenti NIH Grants: P01CA098101 (H.N. e A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(G.J.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. e H.N.) e P30CA013696 (A.K.R.). H.N. e C.L. hanno ricevuto il premio pilota multi-PI della Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center. H.N. ha ricevuto il Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. ha ricevuto il premio The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) e un American Association for Cancer Research Award. J.G. ha ricevuto il premio American Gastroenterological Association (AGA).

<ol><li>Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Esophageal carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).</li>
<li>Dotto, G. P., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Squamous+cell+cancers%3A+A+unified+perspective+on+biology+and+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics.</a> Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).</li>
<li>Giroux, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+keratin+15%2B+esophageal+progenitor+cells+contribute+to+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kinugasa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+SOD2+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+populations+defined+by+differential+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression.</a> Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).</li>
<li>Whelan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+supports+generation+of+cells+with+high+CD44+expression+via+modulation+of+oxidative+stress+and+Parkin-mediated+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance.</a> Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).</li>
<li>Natsuizaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Notch1+and+Notch3+promotes+EMT+and+tumor+initiation+in+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma.</a> Nature Communications. 8 (1), 1758(2017).</li>
<li>Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+3D+culture+systems+as+modeling+tools+in+esophageal+epithelial+pathobiology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).</li>
<li>Sachdeva, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+cellular+origin+and+progression+of+esophageal+cancer+using+esophageal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids.</a> Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+targeting+of+the+cyclin+D1+oncogene+by+an+Epstein-Barr+virus+promoter+in+transgenic+mice+causes+dysplasia+in+the+tongue%2C+esophagus+and+forestomach%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach.</a> Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).</li>
<li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li>
<li>Opitz, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+human+oral-esophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A mouse model of human oral-esophageal cancer.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).</li>
<li>Stairs, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+p120-catenin+results+in+a+tumor+microenvironment+with+inflammation+and+cancer+that+establishes+it+as+a+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene.</a> Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).</li>
<li>Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).</li>
<li>Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+cyclin+D1+overexpression+and+zinc+deficiency+disrupts+cell+cycle+and+accelerates+mouse+forestomach+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis.</a> Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>Hisha, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+lingual+organoid+culture+system%3A+generation+of+organoids+having+mature+keratinized+epithelium+from+adult+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells.</a> Scientific Reports. 3, 3224(2013).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Nguyen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B21+alters+esophageal+epithelial+barrier+function+by+attenuation+of+claudin-7+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis.</a> Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).</li>
<li>Sherrill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+expansion+of+the+eosinophilic+esophagitis+transcriptome+by+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing.</a> Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).</li>
<li>Ruffner, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+stimulation+augments+esophageal+barrier+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity.</a> Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).</li>
<li>Kabir, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomic+analysis+reveals+cellular+diversity+of+murine+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li>
<li>Shimonosono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+metabolism+enriches+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+that+survive+oxidative+stress+via+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy.</a> Biomolecules. 11 (10), 1479(2021).</li>
<li>Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+organoids%3A+An+untapped+platform+for+studying+host-microbiome+interactions+in+esophageal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers.</a> Microorganisms. 9 (11), 2182(2021).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+cooperates+with+inflammation-mediated+stat3+activation+in+the+malignant+transformation+of+foregut+basal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ci sono diversi passaggi critici e considerazioni per la generazione e l'analisi dei MEO nei protocolli qui descritti. Per garantire la riproducibilità e il rigore negli esperimenti MEO, le repliche biologiche e tecniche sono entrambe importanti. Per le repliche biologiche, due o tre topi indipendenti portatori di ESCC sono generalmente sufficienti per condizione sperimentale. Tuttavia, il numero appropriato di repliche biologiche può variare a seconda dei parametri da testare nei singoli studi. Ad esempio, non è attualm...

Il carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) è il più letale dei carcinomi a cellule squamose umane, a causa della sua diagnosi tardiva, della resistenza alla terapia e delle metastasi 1,2. L'ESCC nasce dall'epitelio squamoso stratificato, che riveste la superficie luminale dell'esofago. L'epitelio squamoso è composto da cellule basali proliferative e cellule differenziate all'interno dello strato cellulare soprabasale. In condizioni fisiologiche, le cellule basali esprimono marcatori come p63, Sox2 e citocheratina K5 e K14, mentre le cellule differenziate esprimono K4, K13 e IVL. Le cellule basali stesse sono eterogenee e includono cellule staminali putative definite da marcatori come K153 e CD734. Nell'omeostasi, le cellule basali subiscono una differenziazione terminale post-mitotica all'interno dello strato cellulare soprabasale, mentre le cellule differenziate migrano e si desquamano nel lume per completare il rinnovamento epiteliale. Ricordando le loro cellule di origine, ESCC mostra la differenziazione delle cellule squamose a vari livelli. L'ESCC è spesso accompagnata da lesioni precursori istologiche multifocali, note come neoplasia intraepiteliale (IEN) o displasia, comprendenti cellule basaloidi atipiche. Oltre ai cambiamenti epiteliali, ESCC mostra il rimodellamento tissutale all'interno del compartimento subepiteliale, dove avviene l'attivazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) e il reclutamento di cellule immunitarie / infiammatorie per favorire il microambiente che promuove il tumore.
La patogenesi dell'ESCC comporta cambiamenti genetici ed esposizione a fattori di rischio ambientali. Le lesioni genetiche chiave includono l'inattivazione dei geni oncosoppressori TP53 e CDKN2A (p16INK4A) e l'attivazione degli oncogeni CCND1 (ciclina D1) e EGFR, che culminano nella compromissione della funzione del checkpoint del ciclo cellulare, nella proliferazione aberrante e nella sopravvivenza sotto stress genotossico correlato all'esposizione ad agenti cancerogeni ambientali. In effetti, i cambiamenti genetici interagiscono strettamente con i fattori di rischio comportamentali e ambientali, più comunemente l'uso di tabacco e alcol. Il fumo di tabacco contiene agenti cancerogeni per l'uomo come l'acetaldeide, che è anche il principale metabolita dell'alcol. L'acetaldeide induce addotti del DNA e legami incrociati del DNA tra filamenti, portando a danni al DNA e all'accumulo di mutazioni del DNA e instabilità cromosomica. Dati gli eccessivi stimoli mitogenici e la proliferazione aberrante dall'attivazione dell'oncogene, la trasformazione maligna delle cellule epiteliali esofagee è facilitata da meccanismi per far fronte allo stress genotossico, tra cui l'attivazione di antiossidanti, l'autofagia e la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT). È interessante notare che queste funzioni citoprotettive sono spesso attivate nelle cellule staminali tumorali ESCC (CSC) che sono caratterizzate da un'elevata espressione di CD44 (CD44H) e hanno le capacità di inizio del tumore, invasione, metastasi e resistenza alla terapia 5,6,7.
L'ESCC è stato modellato in coltura cellulare e in roditori modello 8,9. Negli ultimi tre decenni, sono stati sviluppati robusti modelli murini geneticamente modificati di ESCC. Questi includono topi transgenici CCND1 e EGFR 10,11 e topi knockout p53 e p120Ctn 12,13. Tuttavia, i singoli cambiamenti genetici non provocano in genere ESCC a insorgenza rapida. Questa sfida è stata superata con l'uso di agenti cancerogeni esofagei che ricapitolano bene le lesioni genetiche umane in ESCC14. Ad esempio, la 4-nitrochinolina-1-ossido (4NQO) accelera lo sviluppo di ESCC nei topi transgenici CCND1 15. Negli ultimi anni, le cellule staminali epiteliali esofagee putative, le cellule progenitrici e i loro rispettivi destini sono stati studiati in modelli murini tracciabili dalla linea cellulare 3,4. Inoltre, questi topi tracciabili dalla linea cellulare sono stati utilizzati per esplorare le cellule di origine dell'ESCC e come tali cellule danno origine alle CSC CD44H attraverso l'istologia convenzionale e la caratterizzazione molecolare basata sull'omiche7.
Un'area emergente correlata a questi modelli murini è la nuova applicazione di tecniche di coltura cellulare per analizzare ESCC vivi e cellule precursori in un sistema organoide tridimensionale (3D) in cui l'architettura dei tessuti originali è ricapitolata ex vivo 7,8,9. Questi organoidi 3D sono rapidamente cresciuti da una sospensione unicellulare isolata da tessuti mrini, compresi i tumori primari e metastatici (ad esempio, lesioni linfonodali, polmonari ed epatiche). Le cellule sono incorporate nell'estratto di membrana basale (BME) e alimentate con un mezzo di coltura cellulare privo di siero ben definito. Gli organoidi 3D crescono entro 7-10 giorni e le strutture sferiche risultanti sono suscettibili di sottocoltura, crioconservazione e saggi per analizzare una varietà di proprietà e funzioni cellulari, tra cui marcatori CSC, EMT, autofagia, proliferazione, differenziazione e morte cellulare apoptotica.
Questi metodi possono essere ampiamente applicati a colture di organoidi 3D stabilite da qualsiasi tessuto epiteliale squamoso stratificato, come la mucosa della testa e del collo (cavità orale, lingua, faringe e laringe) e persino il prestomaco. La mucosa della testa e del collo sono contigue all'esofago e i due tessuti condividono organizzazione, funzione e suscettibilità alle malattie dei tessuti simili. Sia il carcinoma a cellule squamose della testa che del collo (HNSCC) e l'ESCC condividono lesioni genetiche e fattori di rischio ambientali legati allo stile di vita come l'esposizione al tabacco e all'alcol. Sottolineando questa somiglianza, i topi trattati con il fumo di tabacco mimetico 4NQO sviluppano prontamente sia HNSCC che ESCC. Data la facilità con cui i protocolli descritti di seguito possono essere applicati alla modellazione HNSCC, includiamo istruzioni specifiche per stabilire colture di organoidi 3D da queste lesioni.
Qui, forniamo protocolli dettagliati per la generazione di organoidi 3D esofagei murini (MEO) che rappresentano lesioni normali, preneoplastiche e ESCC che si sviluppano in topi trattati con 4NQO. Possono essere utilizzati vari ceppi di topo, compresi ceppi di laboratorio comuni come C57BL / 6 e derivati tracciabili e altri derivati geneticamente modificati tracciabili dalla linea cellulare. Sottolineiamo i passaggi chiave, tra cui l'isolamento dell'epitelio esofageo murino normale o malato, la preparazione di sospensioni unicellulari, la coltivazione e il monitoraggio degli organoidi 3D in crescita, la sottocoltura, la crioconservazione e l'elaborazione per analisi successive, compresa la morfologia e altre applicazioni.

<table><tbody><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Siringa tubercolina da 1 mL senza ago</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; filtro cellulare m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 15 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Puntali per micropipette a foro largo L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212361A</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da 21 G</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-556-006</td><td></td></tr><tr><td>4-nitrochinolina-1-ossido (4NQO)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>NO250</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>a 6 pozzetti piastra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12556004</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro cellulare m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>99,9% glicole etilene propilenico</td><td>SK picglobal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td>Concentrazione di stock 250 &; g/mL, concentrazione finale 0,5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Concentrazione madre 100x, concentrazione finale 1x</td></tr><tr><td>integratore di B-27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Concentrazione stock 50x, concentrazione finale 1x</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore, ad es. Heracell 150i</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026406</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Countess II FL Contatore di cellule automatizzato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-337-7D</td><td></td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>72-07-5022</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td>Concentrazione stock 50 U/mL, concentrazione finale 2,5&ndash; 5 U/mL</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>VWR</td><td>25870-002</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>Concentrazione di riserva 1x</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento</td><td>Corning</td><td>432002</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G7-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific 35050061</td><td></td><td>Concentrazione di riserva 100x, concentrazione finale 1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Concentrazione di riserva 1 M, concentrazione finale 10 mM</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante/agitatore</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Lab Bagno di perline per armatura (o bagnomaria)</td><td>VWR</td><td>89409-222</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Bilancia da laboratorio</td><td>Ohaus</td><td>71142841</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Matrigel estratto di membrana basale (BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Minispin</td><td>Eppendorf</td><td>22620100</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Rack per provette per microcentrifuga</td><td>Southern Labware</td><td>0061</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di N-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td>Concentrazione madre 100x, concentrazione finale 1x</td></tr><tr><td>N-acetilcisteina (NAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Concentrazione madre 0,5 M, concentrazione finale 1 mM</td></tr><tr><td>Parafilm M wrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta patologica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase</td><td>Nikon</td><td></td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico di topo ricombinante (mEGF)</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1mg</td><td>Concentrazione di base 500 ng/&micro; L, concentrazione finale 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Terreno condizionato con cellule RN che esprime R-spondin1 e Noggin (RN CM)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Disponibile attraverso l'organoide e il nucleo di coltura cellulare su richiesta, concentrazione finale 2%</td></tr><tr><td>Centrifuga Sorval ST 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di soia (STI)</td><td>MilliporeSigma</td><td>T9128</td><td>Concentrazione madre 250 &; g/mL</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-285-562 PM</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>Concentrazione di riserva 10 mM, concentrazione finale 10 &; M</td></tr></tbody></table>

modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3d

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Il carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) è prevalente in tutto il mondo, rappresentando il 90% di tutti i casi di cancro esofageo ogni anno ed è il più mortale di tutti i carcinomi a cellule squamose umane. Nonostante i recenti progressi nella definizione dei cambiamenti molecolari che accompagnano l'inizio e lo sviluppo dell'ESCC, la prognosi del paziente rimane sfavorevole. L'annotazione funzionale di questi cambiamenti molecolari è il passo successivo necessario e richiede modelli che catturino le caratteristiche molecolari dell'ESCC e possano essere manipolati in modo semplice ed economico per l'annotazione funzionale. I topi trattati con il fumo di tabacco mimetico 4-nitrochinolina 1-ossido (4NQO) formano prevedibilmente ESCC e preneoplasia esofagea. Da notare che le lesioni 4NQO insorgono anche nella cavità orale, più comunemente nella lingua, così come nel prestomaco, che condividono tutti l'epitelio squamoso stratificato. Tuttavia, questi topi non possono essere semplicemente manipolati per il test di ipotesi funzionali, poiché la generazione di modelli murini isogeni richiede molto tempo e risorse. Qui, superiamo questa limitazione generando organoidi tridimensionali (3D) derivati da singole cellule da topi trattati con 4NQO per caratterizzare ESCC murino o cellule preneoplastiche ex vivo. Questi organoidi catturano le caratteristiche salienti dell'ESCC e della preneoplasia esofagea, possono essere sfruttati in modo economico e rapido per formare modelli isogeni e possono essere utilizzati per esperimenti di trapianto singeneico. Dimostriamo come generare organoidi 3D da tessuto esofageo murino normale, preneoplastico e SCC e mantenere e crioconservare questi organoidi. Le applicazioni di questi organoidi versatili sono ampie e includono l'utilizzo di topi geneticamente modificati e l'ulteriore caratterizzazione mediante citometria a flusso o immunoistochimica, la generazione di linee di organoidi isogeneici utilizzando le tecnologie CRISPR e lo screening farmacologico o il trapianto singeneico. Riteniamo che l'adozione diffusa delle tecniche dimostrate in questo protocollo accelererà i progressi in questo campo per combattere il grave onere dell'ESCC.

Questo protocollo descrive il processo di generazione di organoidi esofagei murini (MEO) da tessuto esofageo normale o tessuto tumorale ESCC da topi trattati con 4NQO secondo un regime di trattamento specifico costituito da 16 settimane di 4NQO somministrato in acqua potabile, seguito da un periodo di osservazione da 10 settimane a 12 settimane (Figura 1). I topi vengono quindi eutanizzati per la dissezione della lingua o del tessuto esofageo (Figura 2 e <strong...

Questo protocollo descrive i passaggi chiave per generare e caratterizzare organoidi 3D orali-esofagei murini che rappresentano lesioni da carcinoma a cellule squamose normali, preneoplastiche e squamose indotte tramite carcinogenesi chimica.

Modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3D

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Il carcinoma esofageo a cellule squamose, ESCC, è mortale e prevalente in tutto il mondo. Gli organoidi tridimensionali possono essere utilizzati per accelerare i progressi nel campo per combattere il grave onere dell'ESCC. Gli organoidi 3D derivati da singole cellule di topi trattati con 4NQO possono essere facilmente ed economicamente manipolati per l'annotazione funzionale dei cambiamenti molecolari che accompagnano l'inizio e lo sviluppo dell'ESCC.Questo modello cattura l'eterogeneità genetica dei tumori indotti da mutageni. Pertanto, questi organoidi forniscono una piattaforma fisiologicamente rilevante per testare nuove strategie terapeutiche o identificare i cambiamenti genetici salienti che guidano la tumorigenesi. Ad aiutare a dimostrare la dissezione animale e la raccolta di organi sarà Yasuto Tomita, un collaboratore dello staff, e a dimostrare la preparazione dell'organoide per la procedura di incorporazione della paraffina sarà Norihiro Matsuura, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio.Per iniziare, apri la pelle dei topi eutanizzati pizzicando la pelliccia addominale centrale e usando le forbici chirurgiche, fai un'incisione craniocaudale della linea mediana

modeling-oral-esophageal-squamous-cell-carcinoma-in-3d-organoids

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Una panoramica completa delle tecniche coinvolte nella generazione di un modello murino di cancro orale e monitoraggio quantitativo di invasione tumorale all'interno della lingua attraverso multi-fotone microscopia di cellule marcate è presentato. Questo sistema può essere utilizzato come piattaforma utile per la valutazione molecolare e di efficacia dei farmaci anti-invasiva composti.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Gli organoidi derivati dai tumori sono un tipo di modello di coltura cellulare 3D in grado di mantenere le caratteristiche patologiche e la linea cellulare organo-specifica dei tumori. Nel protocollo di esempio, vedremo gli scienziati generare organoidi da un tumore alla prostata da un modello murino geneticamente modificato.

Preparazione di organoidi dai tumori: un modello tumorale in vitro 3D

Questo video descrive una tecnica di coltura in vitro per generare costrutti esofagei organotipici umani mediante la co-coltura di fibroblasti esofagei umani primari e cellule epiteliali squamose all'interno di un'impalcatura suina decellularizzata. Questi modelli di coltura 3D imitano la funzione e la fisiologia delle loro controparti tissutali in vivo.

Modello di coltura esofagea 3D su zattera: una tecnica di coltura in vitro per generare un modello di mucosa esofagea umana

Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all'interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di pelle 3D organotipiche melanoma sferoide che ricapitola sia l'architettura e pluricellulari complessità di un organo/del tumore in vivo ma allo stesso tempo accomoda sistematica sperimentale intervento.

Un modello di pelle sferoide 3D Organotypic Melanoma

È stato sviluppato un sistema di modelli in vitro per catturare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) in una co-coltura tridimensionale (3D) con fibroblasti associati al cancro (CAF). Questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per studiare i ruoli dei diversi cambiamenti delle cellule tumorali-intrinseche ed estrinseci che modulano il fenotipo tumorale.

Sistema di cocultura multidimensionale per modellare la progressione del carcinoma squamoso polmonare

L'articolo descrive la differenziazione diretta graduale delle cellule staminali pluripotenti indotte in organoidi polmonari interi tridimensionali contenenti cellule polmonari epiteliali sia prossimali che distali insieme a mesenchima.

Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Questo protocollo descrive i metodi di sottocoltura e crioconservazione degli organoidi dell'adenocarcinoma esofageo con e senza digestione a singola cellula per consentire ai ricercatori di scegliere strategie appropriate in base al loro disegno sperimentale.

Sottocoltura e crioconservazione degli organoidi dell'adenocarcinoma esofageo: pro e contro per la digestione a cellula singola

Questo protocollo discute un approccio per generare organoidi epiteliali dal tessuto mammario primario normale e tumorale attraverso la centrifugazione differenziale. Inoltre, sono incluse istruzioni per la coltura tridimensionale e l'imaging immunofluorescente di organoidi incorporati.

Generazione e imaging di organoidi epiteliali di topo e umani da tessuto mammario normale e tumorale senza passaggio

Le co-colture organoide-fibroblasti forniscono un modello per studiare la nicchia delle cellule staminali in vivo . Qui viene descritto un protocollo per le co-colture organoide-fibroblasti esofagee. Inoltre, l'imaging a montaggio intero viene utilizzato per visualizzare l'interazione fibroblasto-organoide.

Caratterizzazione funzionale e visualizzazione di fibroblasti esofagei mediante co-colture organoidi

Il presente protocollo descrive la costituzione e l'analisi istologica di modelli di organoidi esofagei che rappresentano diversi stadi di progressione tumorale. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella morfologia cellulare, nell'organizzazione spaziale e nei modelli di espressione dei marcatori molecolari durante la transizione dai tessuti normali a quelli cancerosi.

Definizione e analisi istologica di organoidi esofagei che modellano la progressione da tessuti normali a cancerosi

Scopri come generare organoidi 3D murini oro-esofagei per modellare il carcinoma squamoso esofageo (ESCC). Questo protocollo permette di studiare i cambiamenti molecolari e testare nuove strategie terapeutiche.

Modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3D

Esplora altri video