Imaging intravitale dell'espressione di proteine fluorescenti nei topi con una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso e una finestra cranica utilizzando un microscopio a due fotoni

Il nostro protocollo fornisce un modo per visualizzare la risposta neuronale allo stress meccanico in un topo vivo, che può fornire prove dirette di come la lesione cerebrale traumatica influisca sul cervello. Questa tecnica è in grado di monitorare la proteina bersaglio nella stessa posizione cerebrale nello stesso animale sia per la fase acuta che per quella cronica dopo una lesione cerebrale traumatica. Il gene di interesse e il promotore del virus possono essere modificati di conseguenza per studiare altre proteine nei tipi di cellule specifiche del cervello.

Per iniziare, applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo anestetizzato. Rimuovi i capelli dalla sommità della testa tagliandoli con le normali forbici. Dopo aver stabilito un'incisione della linea mediana lunga da 12 a 15 millimetri, asportare la pelle sugli emisferi sinistro e destro del cranio usando forbici a molla a punta curva.

Una volta che il cranio è esposto, rimuovere il periostio strofinandolo delicatamente con l'applicatore sterile con punta in cotone e sciacquandolo con soluzione fisiologica sterile. Una volta che l'area del cranio è asciutta, segnare il sito di impatto della lesione cerebrale traumatica, o TBI, alle coordinate 2,5 millimetri posteriori al bregma e due millimetri laterali dalla sutura sagittale a destra. Rimuovere rapidamente il mouse dal telaio stereotassico e posizionare la testa sul cuscino tampone sotto il dispositivo TBI.

Allineare la punta del dispositivo d'urto con il punto d'impatto contrassegnato. Sollevare la colonna metallica tirando la corda di nylon legata a 15 centimetri sopra la testa del topo, quindi rilasciarla, lasciando che il peso cada liberamente sull'asta del trasduttore, che è a contatto con la parte superiore del cranio nel sito del trauma cranico. Posizionare la testa del topo anestetizzato sul telaio stereotassico tenuto sotto il microscopio operatorio.

Forare delicatamente e lentamente la superficie del cranio utilizzando una punta in metallo duro FG4 a bassa velocità del rotore per rimuovere il periostio rimanente e creare una superficie cranica ruvida in modo tale che il cemento dentale si leghi saldamente al cranio. Usa la soluzione salina per lavare e rimuovere la polvere ossea dalla superficie del cranio. Per separare i muscoli laterali dal cranio, a circa cinque millimetri posteriormente all'occhio, dove si trova la sutura che collega il cranio parietale e temporale, inserire delicatamente le punte fini chiuse e muovere delicatamente le punte chiuse in direzione posteriore fino alla sutura lambdoide.

Separare i muscoli laterali sul lato in cui si verificherà l'impianto della finestra cranica. Lavare via i detriti dal sito chirurgico con soluzione fisiologica e asciugare l'area con una garza. Per impiantare il perno della testa, segnare il punto centrale 2,5 millimetri posteriormente al bregma e 1,5 millimetri dalla sutura sagittale sull'emisfero destro utilizzando un pennarello e un calibro chirurgico.

Quindi traccia la circonferenza della craniotomia sul cranio pulito e asciutto. Allentare la barra auricolare e ruotare la testa, in modo che il piano della craniotomia sia perfettamente orizzontale, quindi serrare nuovamente la barra auricolare. Usa il bastoncino di legno di un applicatore con punta di cotone per aggiungere due piccole gocce di supercolla sul bordo anteriore e posteriore del montante della testa.

Posizionare il perno della testa in titanio al centro della craniotomia e regolarlo rapidamente per farlo riposare all'interno dello stesso piano in cui verrà impiantata la finestra cranica. Applicare una leggera pressione fino a quando la supercolla non si è asciugata, il che di solito richiede circa 30 secondi. Preparare il cemento dentale in un piatto di ceramica preraffreddato mescolando accuratamente 300 milligrammi di polvere di cemento, sei gocce di liquido QuickBase e una goccia di catalizzatore.

Applicare rapidamente una generosa quantità di miscela di cemento dentale sul perimetro esterno della circonferenza tracciata e coprire qualsiasi superficie ossea esposta. Tuttavia, non coprire il sito della craniotomia. Rilasciare la barra auricolare e fissare il montante della testa al telaio metallico per assicurarsi che la testa sia stabile per una perforazione precisa lungo la circonferenza della craniotomia contrassegnata.

Per eseguire la craniotomia, utilizzare un calibro chirurgico per verificare il diametro del cerchio contrassegnato come dimostrato in precedenza e regolare se necessario, in modo che la finestra cranica si adatti perfettamente all'interno della craniotomia. Utilizzando un trapano dentale elettrico, incidere e assottigliare il cranio lungo l'esterno del cerchio contrassegnato utilizzando prima una punta in metallo duro FG4, che crea una traccia all'interno della quale assottigliare il cranio. Irrigare l'area con soluzione fisiologica per lavare via la polvere ossea.

Continuare ad assottigliare il cranio usando una punta in metallo duro FG 1/4 fino a quando il cranio non è sottile come carta e trasparente. Periodicamente, interrompere la perforazione e irrigare nuovamente l'intera area con soluzione fisiologica sterile per ridurre il riscaldamento del trapano e per lavare via la polvere ossea. Completare l'assottigliamento del cranio utilizzando una punta in metallo duro EF4 e continuare ad assottigliare e perforare il resto del cranio lungo la pista.

Inserire una pinza a punta fine da 0,5 millimetri attraverso il punto incrinato e sollevare delicatamente il lembo osseo verso l'alto senza intaccare il cervello sottostante. Dopo aver rimosso il lembo osseo, irrigare l'area craniotomica con soluzione fisiologica. Utilizzando la pinza chirurgica a punta curva, rimuovere delicatamente la materia aracnoidea visibile.

Utilizzare la pinza chirurgica a punta diritta per sollevare la finestra di vetro sterile con il vetrino di copertura da tre millimetri rivolto verso il basso. Posizionare e regolare la finestra di vetro sopra il sito della craniotomia per assicurarsi che la finestra possa adattarsi perfettamente al bordo della craniotomia. Il vetrino coprioggetto da cinque millimetri è in alto.

Preparare il cemento dentale come dimostrato in precedenza e attendere circa sei minuti fino a quando il cemento diventa pastoso e denso. In attesa che il cemento diventi pastoso e denso, applicare un'adeguata pressione alla finestra attraverso un manipolatore stereotassico per verificare che il cranio possa entrare in contatto sicuro e stretto con la finestra di vetro. Usa un pennello applicatore di precisione regolabile per aggiungere una piccola quantità di cemento lungo il bordo della finestra per sigillare la finestra di vetro con il cranio.

Attendere circa 10 minuti per lasciare asciugare completamente il cemento, quindi rilasciare delicatamente e rimuovere il manipolatore sopra la finestra. Completare tagliando il cemento dentale utilizzando il trapano dentale con una punta in metallo duro FG4 se il cemento in eccesso copre la finestra. A circa quattro ore dall'intervento chirurgico, è stato eseguito l'imaging a due fotoni, dove a livello superficiale la vascolarizzazione appariva nera, e a livello profondo di circa 400 micrometri, l'espressione della proteina EGFP era diffusamente distribuita in tutto il corpo cellulare.

A una settimana e quattro mesi dopo il trauma cranico, il modello vascolare osservato al punto del giorno zero è stato utilizzato come riferimento per localizzare la stessa regione di imaging. Il modello vascolare è simile a quello del giorno zero. Allo stesso modo, l'espressione di EGFP è stata rilevata in tutto il corpo cellulare.

L'intensità della fluorescenza al giorno zero e a quattro mesi era simile sia a livello superficiale che a livello più profondo. Tuttavia, l'intensità della fluorescenza a una settimana era inferiore a quella del giorno zero e a quattro mesi, probabilmente a causa della repressione traslazionale riportata per altri modelli di trauma cranico. È fondamentale prestare la massima attenzione quando si esegue la fase di craniotomia per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale.

Non inserire la punta del trapano nel cervello. Utilizzando questa tecnica, i ricercatori possono visualizzare diverse proteine di interesse nella stessa cellula longitudinalmente attraverso diverse fasi post-trauma cranico, fornendo informazioni sulla localizzazione, l'espressione e la solubilità di quella proteina nel cervello dei mammiferi dopo un trauma.