Valutazione dell'integrità della barriera intestinale nei topi utilizzando destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato

Questo metodo aiuta a rispondere alle domande sul fatto che una condizione alteri l'integrità della barriera intestinale o domande sul fatto che un potenziale trattamento possa mantenere l'integrità della barriera intestinale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre una tecnica non invasiva e a basso carico per valutare e quantificare la permeabilità intestinale in vivo. Per iniziare, digiunare i topi per quattro ore, quindi somministrare 200 microlitri di sospensione FITC-destrano tramite sonda orale a ciascun topo utilizzando un ago da 38 millimetri calibro 22 sterilizzato.

Avviare un timer dopo il primo gavage e attendere da cinque a 10 minuti tra ogni gavage per consentire misurazioni in vivo, mantenendo un'ora dopo il gavage. Mantenere le restanti sospensioni FITC-destrano per la curva standard. Avviare la macchina e il software facendo clic e tenendo premuto il pulsante di avvio e consentire al sistema di riscaldarsi.

Fare clic su Stato dispositivo e assicurarsi che tutti i dispositivi configurati mostrino OK prima di procedere. Quindi fare clic su Nuovo studio e salvare il file con il nome desiderato. Quindi, fai clic su Opzioni di studio.

Inserisci l'ID del campione e scegli il laser corretto e sperimenta. Quindi rimuovere la pelliccia dalla zona addominale usando un rasoio elettrico e applicare generosamente un unguento veterinario sugli occhi per evitare l'essiccazione. Aprire la camera di imaging e posizionare l'animale dorsalmente sulla piastra di scansione.

Quindi fissare gli arti e la coda con del nastro adesivo. Quindi, selezionare l'area da scansionare utilizzando lo strumento Disegno. Assicurarsi di includere l'intera larghezza dell'addome da appena sopra il fegato al retto.

Quindi fare clic sullo strumento Modifica per regolare l'area una volta disegnata. Impostare la risoluzione di scansione su 2,0 millimetri e fare clic su Start per iniziare la scansione. Quindi, apri i file di immagine trovandoli sotto il nome del file scelto e apri contemporaneamente tutti i file con impostazioni sincronizzate.

Utilizzando la barra degli strumenti delle impostazioni immagine, utilizzare i pulsanti Sincronizza immagine e Sincronizza scala per sincronizzare le impostazioni dell'immagine per un confronto accurato. Quindi salvare le immagini con le scale regolate. Confronta la fluorescenza addominale di ciascun animale e del mouse di controllo su immagini in scala uniforme utilizzando il software associato al sistema di imaging.

Raccogli un pellet fecale da ciascun topo in un tubo sterile quattro ore dopo il gavage. Quindi tenere i tubi sul ghiaccio e metterli al buio. Quindi, centrifugare i campioni di sangue a 9, 390 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi trasferire il plasma in un nuovo tubo sterile e tenerlo sul ghiaccio al buio. Diluire 50 milligrammi di campioni fecali in 200 microlitri di PBS e diluire il plasma con PBS in un rapporto uno o due. Piastra 100 microlitri campioni e standard in una piastra nera opaca a 96 pozzetti.

Leggere la fluorescenza su un lettore di piastre fluorescenti con eccitazione a 485 nanometri e assorbimento a 530 nanometri. Infine, determinare la concentrazione di destrano FITC per campione confrontando la fluorescenza con le concentrazioni note della curva standard. L'analisi della fluorescenza in vivo ha mostrato che i topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo avevano un apporto epatico più elevato di destrano FITC e livelli più elevati di fluorescenza residua nella cavità addominale rispetto ai topi che hanno ricevuto la dieta integrata con inulina.

I topi che hanno ricevuto la dieta integrata con inulina avevano livelli significativamente più bassi di destrano FITC nel loro plasma rispetto ai topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo. Concordemente, i topi che hanno ricevuto la dieta dell'inulina avevano livelli significativamente più alti di destrano FITC nelle loro feci rispetto ai topi che hanno ricevuto solo la dieta di controllo. I livelli più bassi di FITC-destrano nelle feci dei topi controllati indicano che permeava attraverso la barriera intestinale nella circolazione piuttosto che essere opportunamente escreto.

Gli alti livelli di FITC-destrano nel plasma hanno rafforzato questa scoperta. La tempistica è essenziale quando si tenta questa procedura. La lettura della fluorescenza e la raccolta dei campioni dovrebbero avvenire il più vicino possibile a un'ora e quattro ore dopo la sonda gastrica per ogni singolo topo.