Name: In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso liniezione intraduttale mammaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Scopri la consegna genica intraduttale nelle cellule epiteliali mammarie di topo mediante vettori virali. Questo metodo controllato migliora la modellazione dei tumori mammari per studi di oncologia e terapia genica.

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Ringraziamo il Dr. Gary Chamness per i suoi utili commenti su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento della Difesa (DOD) CDMRP BC191649 (YL) e BC191646 (YL), nonché dal National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL). Gli autori desiderano ringraziare il Breast Center Pathology Core Facility supportato da SPORE P50CA186784 e il Cytometry and Cell Sorting Core supportato da CPRIT-RP180672, NIH CA125123 e RR024574 con l'assistenza di Joel M. Sederstrom.

Tutte le procedure che utilizzano topi sono state eseguite in conformità con il protocollo sugli animali approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Per il presente studio, sono stati utilizzati topi femmina FVB / N o MMTV-tva di 9-12 settimane. I topi sono stati ottenuti commercialmente o autoprodotti (vedi Tabella dei materiali). Sono stati utilizzati i virus Lenti-EGFP (FUCGW) e RCAS-Erbb2 (Neu). La preparazione del virus e la determinazione del titolo sono state eseguite seguendo i rapporti precedentemente pubblicati10,12.
1. Preparazione della siringa
<ol><li>Tagliare gli aghi del mozzo metallico da 33 G (vedere la tabella dei materiali) a circa 1 cm di lunghezza. Conservare gli aghi e la siringa da 50 μL in alcool al 70% dopo l'autoclave.</li>
	<li>Estrarre siringhe e aghi dall'alcol. Spingere l'alcol rimanente fuori dalla siringa e dall'ago. Smontare la siringa per asciugare all'aria su un cuscinetto assorbente autoclavato.</li>
	<li>Assemblare la siringa dopo l'asciugatura.</li>
</ol>2. Preparazione del virus
<ol><li>Estrarre una o più provette virali secondo necessità dal congelatore a -80 °C e scongelare il virus sul ghiaccio. NOTA: A seconda del numero di cellule da infettare, potrebbe essere necessario diluire il virus nei titoli previsti utilizzando 1x PBS in questo momento.</li>
	<li>Aggiungere il blu di bromofenolo immergendo la punta della pipetta a una profondità di 1 cm nella polvere blu di bromofenolo (vedere Tabella dei materiali). Quindi, portare la quantità di traccia allegata di blu di bromofenolo nella sospensione del virus. NOTA: Per il presente studio, lo stock virale è solitamente di 200 μL per provetta, quindi la concentrazione finale del colorante è di circa lo 0,2% (0,2 μg / 100 μL). Il blu di bromofenolo deve essere sterilizzato con radiazioni a microonde per 45 secondi ad alta potenza di 1250 W (vedi Tabella dei materiali). Assicurarsi di eseguire l'intera procedura in un ambiente sterile.</li>
	<li>Mescolare il blu di bromofenolo con la soluzione virale pipettando su e giù 10 volte.</li>
	<li>Metti il virus sul ghiaccio e porta il secchiello del ghiaccio al vivaio.</li>
</ol>3. Preparazione degli animali
<ol><li>Anestetizzare una femmina di topo mediante iniezione intraperitoneale di 2 μL/g di anestetico (37,6 mg/mL di ketamina, 1,92 mg/mL di xilazina e 0,38 mg/ml di acepromazina, vedere Tabella dei materiali). Controlla la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta. Applicare un unguento sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. NOTA: il mouse deve non rispondere al pizzicamento della punta in buona anestesia. L'isoflurano può anche essere usato per anestetizzare i topi.</li>
	<li>Metti il mouse in posizione supina su un pad caldo e attacca tutti e quattro gli arti alla panca usando del nastro adesivo.</li>
	<li>Identificare un capezzolo (o più) da iniettare (il numero 4 è preferito per il presente studio). Esporlo tagliando i capelli circostanti usando un paio di forbici.</li>
	<li>Applicare tamponi di alcol e iodophor al 70% sulla zona del capezzolo in tre giri per pulire ed esporre il capezzolo.</li>
</ol>4. Iniezione intraduttale di virus
NOTA: Una lampada d'ingrandimento può essere utilizzata per aiutare a visualizzare l'apertura del capezzolo.
<ol><li>Transetto la punta distale di un capezzolo usando un paio di forbici a molla sterili per microdissezione, fino a quando una piccola apertura duttale centrale può essere vista sotto una lampada d'ingrandimento (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Caricare 10 μL di miscela virus/blu di bromofenolo nella siringa. NOTA: in questa dimostrazione vengono utilizzati Lenti-EGFP (FUCGW) e RCAS-Erbb2 (Neu).</li>
	<li>Inserire con cautela l'ago nell'apertura del capezzolo con l'aiuto della lampada della lente d'ingrandimento. L'orientamento dell'ago viene regolato leggermente dalla mediale alla laterale per allinearsi con il condotto principale.</li>
	<li>Iniettare tutti i 10 μL del virus nell'albero dei condotti. NOTA: I dotti sotto la pelle dovrebbero diventare blu, se l'iniezione ha successo. Qualsiasi resistenza o la comparsa di un cambiamento di colore localizzato indica il fallimento dell'iniezione.</li>
	<li>Posizionare il mouse su uno scaldavetrino impostato a 45 °C fino a quando il mouse non si sveglia completamente (~30-60 min).</li>
</ol>5. Rilevamento di cellule infette mediante stereomicroscopio fluorescente
<ol><li>Da tre a cinque giorni dopo l'iniezione del virus portatore di GFP o altri geni fluorescenti, eutanasia il topo sovradosandolo con 4 uL / g di anestetico (37,6 mg / mL di ketamina, 1,92 mg / mL di xilazina e 0,38 mg / mL di acepromazina).</li>
	<li>Aprire la cavità toracica. Tagliare la pelle lungo la linea mediana ventrale e lungo gli arti superiori e inferiori usando un paio di forbici. Sollevare la pelle ed esporre le ghiandole mammarie.</li>
	<li>Rimuovere la ghiandola mammaria iniettata dalla pelle usando un paio di pinze e forbici. Inoltre, rimuovere una ghiandola non iniettata come controllo.</li>
	<li>Posizionare le ghiandole mammarie su vetrini e diffondere le ghiandole alla loro forma originale.</li>
	<li>Osservare e visualizzare le ghiandole sotto uno stereomicroscopio fluorescente.</li>
</ol>

<ol><li>Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D-A+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research.+Eds+Margot%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+a+rabbit+beta-globin+gene+into+the+mouse+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line.</a> Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).</li>
<li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+expression+of+herpes+thymidine+kinase+in+mice+following+injection+of+a+fusion+gene+into+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs.</a> Cell. 27 (1), 223-231 (1981).</li>
<li>Du, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCAS-TVA+in+the+mammary+gland%3A+an+in+vivo+oncogene+screen+and+a+high+fidelity+model+for+breast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation.</a> Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+precancerous+stem+and+non-stem+cells+evolve+into+cancers+of+distinct+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes.</a> Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+6a+marks+mammary+bipotential+progenitor+cells+that+can+give+rise+to+a+unique+tumor+model+resembling+human+normal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer.</a> Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+an+alveolar+cell+of+origin+to+the+high-grade+malignant+phenotype+of+pregnancy-associated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer.</a> Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).</li>
<li>Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+cells+with+active+Wnt+signaling+resist+ErbB2-induced+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis.</a> PLoS One. 8 (11), 78720(2013).</li>
<li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+oncogenes+into+mammary+glands+in+vivo+with+an+avian+retroviral+vector+initiates+and+promotes+carcinogenesis+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).</li>
<li>Siwko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+oncogene+introduction+into+mammary+cells+in+vivo+induces+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors.</a> Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).</li>
<li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).</li>
<li>Russell, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+the+mammary+epithelium+with+adenovirus+vectors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo.</a> Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).</li>
<li>Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated-virus-mediated+transduction+of+the+mammary+gland+enables+sustained+production+of+recombinant+proteins+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk.</a> Scientific Reports. 5, 15115(2015).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
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<li>McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Bu, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+of+lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+rat+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+individual+somatic+mammary+cells+in+vivo+reveals+a+master+role+of+STAT5a+in+inducing+alveolar+fate+commitment+and+lactogenesis+even+in+the+absence+of+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones.</a> Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+preclinical+prevention+of+increased+breast+cancer+risk+caused+by+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy.</a> eLife. 2, 00996(2013).</li>
<li>Reddy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+ATM-mediated+barrier+to+tumorigenesis+in+somatic+mammary+cells+following+ErbB2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PR+status+of+the+originating+cell+of+ER%2FPR-negative+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors.</a> Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).</li>
<li>Young, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+pro-survival+protein+BCL-2+to+prevent+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer.</a> Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).</li>
<li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+lentiviral+vector+exposures+and+prevention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+and+Environmental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krt6a-positive+mammary+epithelial+progenitors+are+not+at+increased+vulnerability+to+tumorigenesis+initiated+by+ErbB2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2.</a> PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+into+a+defined+subset+of+mammary+cells+demonstrates+that+the+initiating+oncogenic+mutation+defines+the+resulting+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype.</a> International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).</li>
<li>Hein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+epithelial+cells+within+the+mammary+gland+can+produce+basal+cells+upon+oncogenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress.</a> Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+CRISPR-Cas9+base+editing+for+the+development+of+genetically+engineered+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer.</a> EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+invasive+lobular+breast+carcinoma+by+CRISPR%2FCas9-mediated+somatic+genome+editing+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland.</a> Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).</li>
</ol>

Entrambi gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Questo articolo dimostra la tecnica di iniezione intraduttale virale per l'introduzione di geni nelle cellule epiteliali mammarie di topo per modellare il carcinoma mammario sporadico. Di solito, i topi di almeno 5 settimane o più anziani vengono iniettati in modo che il processo oncogeno inizi dopo lo sviluppo della ghiandola mammaria. Inoltre, l'apertura del capezzolo dei topi di età inferiore alle 5 settimane è spesso troppo piccola per l'iniezione. D'altra parte, i capezzoli di topi molto vecchi sono talvolta degener...

Le cellule epiteliali delle ghiandole mammarie svolgono un ruolo importante nella funzione di queste ghiandole e sono la principale cellula di origine del cancro al seno. Gli studi sulla biologia della ghiandola mammaria e sulla tumorigenesi spesso richiedono la consegna di geni di interesse in queste cellule. Ogni ghiandola mammaria di topo comprende un albero duttale fiancheggiato da cellule epiteliali con una singola apertura sulla punta del capezzolo. Questa struttura rende le cellule epiteliali mammarie facilmente accessibili ai vettori virali, che possono essere consegnati nel lume di un albero duttale tramite iniezione intraduttale1.
La tecnica dell'iniezione intraduttale mammaria è stata originariamente utilizzata per animali molto più grandi come capre, conigli e ratti1. Per un animale molto più piccolo come i topi, l'iniezione intraduttale ha bisogno di molti strumenti delicati e più pratiche degli operatori. Esistono due approcci per l'iniezione intraduttale del topo. Uno è l'iniezione up-the-teat1. Un altro è l'iniezione diretta del dotto primario della ghiandola mammaria #3 o #4 dopo l'esposizione chirurgica1. Poiché il primo è non invasivo e più veloce una volta che l'operatore è stato ben addestrato, questa tecnica è più comunemente utilizzata e verrà descritta in dettaglio in questo articolo.
Rispetto ai modelli murini transgenici tradizionali ampiamente utilizzati, in cui il gene di interesse viene introdotto nella fase di ovuli fecondati attraverso la microiniezione 2,3,4, la consegna genica attraverso il metodo di iniezione intraduttale del virus presenta molti vantaggi, tra cui: (1) evita il lungo processo di creazione di una linea di topo transgenico per ciascun gene di interesse; (2) evita potenziali compromissioni del normale sviluppo delle ghiandole mammarie imposte dal gene di interesse; (3) introduce il gene di interesse in qualsiasi momento desiderato dopo la nascita; (4) può facilmente co-introdurre più di un gene di interesse; (5) imita meglio il naturale processo tumorigenico perché le cellule infette e quindi portatrici di oncogeni sono circondate da cellule normali; e (6) in combinazione con la tecnologia TVA (virus tumorale A, una proteina di superficie delle cellule aviarie e il recettore per il vettore RCAS retrovirus)5, il gene di interesse può essere introdotto in una specifica popolazione cellulare per studiare l'origine cellulare della tumorigenesi e condurre saggi di tracciamento della linea cellulare nelle ghiandole mammarie 6,7,8, 9.
Qualsiasi vettore derivato da retrovirus10, lentivirus 11,12, adenovirus13 e virus associato all'adenovirus (AAV)14 può essere utilizzato per la consegna intraduttale di materiale genetico. I vettori di retrovirus e lentivirus si integrano permanentemente nel genoma dell'ospite; Pertanto, introducono geni di interesse stabilmente nelle cellule epiteliali mammarie. Mentre il lentivirus può integrarsi nel genoma di qualsiasi cellula che incontra15, l'efficiente integrazione genomica del retrovirus richiede la proliferazione delle cellule bersaglio16. I vettori adenovirali e AAV non si integrano nel genoma delle cellule infette e, quindi, esprimono solo transitoriamente il gene di interesse17,18. Questa caratteristica può essere un vantaggio quando il gene di interesse deve essere espresso solo per un breve periodo di tempo, come Cre, per eliminare un gene oncosoppressore floxato.
Lentivirus, adenovirus e AAV infettano tutte le cellule di topo che incontrano. Ma poiché l'epitelio luminale è in gran parte isolato dallo strato basale sottostante, che è ulteriormente separato dallo stroma dalla membrana basale, l'iniezione intraduttale limita l'infezione in gran parte alle cellule epiteliali luminali, la cellula primaria di origine del cancro al seno. All'interno di questo strato epiteliale luminale, ci sono anche sottotipi cellulari distinti, tra cui cellule staminali, cellule progenitrici e diversi gruppi di cellule differenziate. Per infettare sottogruppi cellulari specifici all'interno della popolazione cellulare luminale, può essere utilizzata la tecnologia TVA, con la quale i vettori RCAS 5,10 derivati dal virus della leucosi aviariao i vettori lentivirali pseudotipizzati11 infettano selettivamente le cellule che esprimono TVA in topi portatori di un transgene tva sotto il controllo di un promotore specifico del tipo di cellula, come un promotore attivo solo nelle cellule staminali 6 o in alcuni progenitori 6, 7 o cellule alveolari8 o cellule attive della via Wnt9.
Questo protocollo presenta la tecnica di introduzione di geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie attraverso l'iniezione intraduttale di un vettore virale. Viene quindi dimostrata la rilevazione dell'espressione dei geni introdotti e delle conseguenti lesioni iperplastiche e tumori.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-HA</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Diluizione: 1 : 1000</td></tr><tr><td>Lacrime artificiali</td><td>Covetrus</td><td>NDC 11695-0832-1</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma</td><td>B5525</td><td>radiazione a microonde per 45 secondi ad alta potenza del forno a microonde da 1250 W</td></tr><tr><td>FACSCantoII</td><td>BD Biosciences</td><td>V96100899</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio fluorescente</td><td>Leica</td><td>MZ16 FA</td><td></td></tr><tr><td>FUCGW lenti-virus</td><td>Autocostruito</td><td>N/A</td><td>Vedi riferimento # 12</td></tr><tr><td>FVB/N</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:001800</td><td></td></tr><tr><td>Ago Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>91033</td> siringa <td>Hamilton autoclavata</td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>201000</td> lampada d'ingrandimento <td>LED autoclavata</td></tr><tr><td></td><td>Intertek</td><td>3165273</td><td></td></tr><tr><td>Forbice a molla per micro dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>autoclavato</td></tr><tr><td>MMTV-tva</td><td>Autocostruito</td><td></td><td>Vedi riferimento # 10</td></tr><tr><td>RCAS-Neu (HA)</td><td>Autocostruito</td><td>N/A</td><td>Vedi riferimento # 10</td></tr><tr><td>Roditore Comboanestetico III</td><td>Farmacia veterinaria</td><td>Prescrizione veterinaria</td><td>37,6 mg/mL ketamina, 1,92 mg/mL xilazina e 0,38 mg/mL acepromazina</td></tr></tbody></table>

in vivo consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Le ghiandole mammarie del topo comprendono alberi duttali, che sono rivestiti da cellule epiteliali e hanno un'apertura sulla punta di ciascun capezzolo. Le cellule epiteliali svolgono un ruolo importante nella funzione della ghiandola mammaria e sono l'origine della maggior parte dei tumori mammari. L'introduzione di geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie di topo è un passo fondamentale nella valutazione della funzione genica nelle cellule epiteliali e nella generazione di modelli di tumore mammario di topo. Questo obiettivo può essere raggiunto attraverso l'iniezione intraduttale di un vettore virale che trasporta i geni di interesse nell'albero duttale mammario del topo. Il virus iniettato successivamente infetta le cellule epiteliali mammarie, portando i geni di interesse. Il vettore virale può essere lentivirale, retrovirale, adenovirale o virale associato all'adenovirus (AAV). Questo studio dimostra come un gene di interesse viene consegnato nelle cellule epiteliali mammarie attraverso l'iniezione intraduttale mammaria di topo di un vettore virale. Un lentivirus che trasporta GFP viene utilizzato per mostrare un'espressione stabile di un gene consegnato e un retrovirus che trasporta Erbb2 (HER2 / Neu) viene utilizzato per dimostrare lesioni iperplastiche atipiche indotte da oncogeni e tumori mammari.

I dati rappresentativi sono presentati qui per dimostrare il successo dell'iniezione intraduttale, l'infezione virale di successo e l'impatto dei geni consegnati sulla tumorigenesi mammaria. La quantità di virus iniettato deve essere adattata allo scopo di ciascun esperimento. Per illustrare quanto ampiamente l'albero del dotto mammario possa essere infettato, è necessario utilizzare una grande quantità di geni portatori di virus che possono essere visualizzati, come la GFP. D'altra parte, per imitare la naturale tumorig...

Il presente protocollo descrive l'iniezione intraduttale di vettori virali attraverso la tettarella per fornire geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie.

In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Questo metodo trasporta il materiale genetico nelle cellule epiteliali della ghiandola mammaria in modo speciale, temporaneo e quantitativamente controllabile. Poiché la consegna di materiale genetico nelle cellule epiteliali mammarie è speciale, temporaneamente e quantitativamente controllata, i modelli mammari generati da questo metodo imitano meglio la genesi naturale del tumore. Iniziare la preparazione della siringa tagliando gli aghi del mozzo metallico calibro 33 a circa un centimetro di lunghezza e conservandoli in alcool.Rimuovere siringhe e aghi dall'alcool e spingere l'alcol rimanente fuori dalla siringa e dagli aghi. Quindi smontare la siringa per l'asciugatura all'aria. Dopo l'asciugatura, assemblare la siringa.Estrarre i tubi virali dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelarli sul ghiaccio. Per aggiungere il blu di bromofenolo, immergere la punta della pipetta a una profondità di un centimetro nella polvere blu di bromofenolo. Quindi portare la traccia allegata di blu di bromofenolo nella sospensione del virus.Mescolare il blu di bromofenolo con la soluzione virale pipettando su e giù 10 volte, prima di posizionare il virus sul ghiaccio. Controlla la profondi

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Questo video descrive una tecnica di iniezione intraduttale in cui forniamo una miscela per iniezione nei dotti delle ghiandole mammarie di topo.

Iniezione intraduttale: erogazione di una miscela per iniezione nei dotti della ghiandola mammaria del topo

Un protocollo per la consegna intraduttale non invasiva di reagenti acquosi alla ghiandola mammaria topo è descritto. Il metodo si avvale di iniezione localizzato nei capezzoli delle ghiandole mammarie destinati dotti mammari in particolare. Questa tecnica è adattabile per una varietà di composti compresi siRNA, agenti chemioterapici e piccole molecole.

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Attivazione di mutazioni latenti con adenovirus-Cre nei risultati mammarie sistema duttale in un carcinoma mammario metastatico clinicamente rilevante. Incorporazione di un promotore YFP consente di tenere traccia di cellule tumorali metastatiche distali. Questo modello è utile per studiare metastasi latente, immunità anti-tumorale, e per la progettazione di nuove immunoterapie per trattare il cancro al seno.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Il cancro è una malattia complessa che è influenzata dal tessuto circostante il tumore nonché pro- locale e anti-infiammatori mediatori. Pertanto, modelli iniezione ortotropici, anziché modelli sottocutanee possono essere utili per studiare la progressione del cancro in un modo che imita migliori patologia umana.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Qui, descriviamo una tecnica per la somministrazione localizzata di reagenti alla ghiandola mammaria del coniglio tramite un'iniezione intraduttale. Inoltre, descriviamo un protocollo per la visualizzazione e la conferma della somministrazione mediante imaging ecografico ad alta risoluzione degli agenti di contrasto.

Consegna intraduttale al Coniglio ghiandola mammaria

Qui, presentiamo un protocollo per impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, meno invasiva e facile da maneggiare, e questo modello di cancro al seno ortotopico del topo con un ambiente adeguato cuscinetto grasso mammario può essere utilizzato per approfondire vari aspetti della cancro.

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre nelle ghiandole mammarie dei topi. Questo approccio consente la manipolazione sia di tipo cellulare che di un organo degli eventi oncogeni in modo controllato temporaneamente.

Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

Viene descritto un metodo di iniezione intraduttale di reagenti per una soluzione ablativa a base di etanolo all'albero duttale mammario di topo per l'imaging in vivo e la prevenzione del cancro al seno. L'iniezione direttamente nell'apertura del capezzolo consente di colpire le cellule epiteliali mammarie con un danno tissutale collaterale minimo.

Somministrazione intraduttale e visualizzazione a raggi X della soluzione ablativa a base di etanolo per la prevenzione e il trattamento locale del cancro al seno in modelli murini

Il presente protocollo descrive una tecnica semplice per l'imaging intravitale della ghiandola mammaria del topo in allattamento mediante microscopia confocale e multifotonica a scansione laser.

Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Questo protocollo descrive un approccio scalabile di screening intraductale CRISPR che consente studi paralleli in vivo di knockout e attivazione genica nella ghiandola mammaria del topo.

Screening parallelo in vivo del knockout e attivazione genica nella ghiandola mammaria del topo

Scopri la consegna genica intraduttale nelle cellule epiteliali mammarie di topo mediante vettori virali. Questo metodo controllato migliora la modellazione dei tumori mammari per studi di oncologia e terapia genica.

In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

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