In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

Questo metodo trasporta il materiale genetico nelle cellule epiteliali della ghiandola mammaria in modo speciale, temporaneo e quantitativamente controllabile. Poiché la consegna di materiale genetico nelle cellule epiteliali mammarie è speciale, temporaneamente e quantitativamente controllata, i modelli mammari generati da questo metodo imitano meglio la genesi naturale del tumore. Iniziare la preparazione della siringa tagliando gli aghi del mozzo metallico calibro 33 a circa un centimetro di lunghezza e conservandoli in alcool.

Rimuovere siringhe e aghi dall'alcool e spingere l'alcol rimanente fuori dalla siringa e dagli aghi. Quindi smontare la siringa per l'asciugatura all'aria. Dopo l'asciugatura, assemblare la siringa.

Estrarre i tubi virali dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelarli sul ghiaccio. Per aggiungere il blu di bromofenolo, immergere la punta della pipetta a una profondità di un centimetro nella polvere blu di bromofenolo. Quindi portare la traccia allegata di blu di bromofenolo nella sospensione del virus.

Mescolare il blu di bromofenolo con la soluzione virale pipettando su e giù 10 volte, prima di posizionare il virus sul ghiaccio. Controlla la profondità dell'anestesia pizzicando la punta di un topo femmina anestetizzata. Applicare un unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre l'animale è sotto anestesia.

Metti il mouse in posizione supina su un pad caldo e attacca tutti e quattro gli arti alla panca usando del nastro adesivo. Identificare il capezzolo da iniettare ed esporlo tagliando i capelli circostanti usando le forbici. Applicare il 70% di alcol e iota quattro tamponi in tre giri alternati sulla zona del capezzolo per pulire ed esporre il capezzolo.

Transetto la punta distale di un capezzolo usando un paio di forbici a molla di micro dissezione sterilizzate, fino a quando una piccola apertura duttale centrale può essere vista sotto una lampada d'ingrandimento. Quindi caricare 10 microlitri della miscela blu di bromofenolo virale nella siringa e inserire con attenzione l'ago nell'apertura del capezzolo con l'aiuto della lampada della lente d'ingrandimento. Iniettare tutti i 10 microlitri del virus nell'albero del condotto e posizionare il mouse su uno scaldavetri impostato a 45 gradi Celsius fino a quando il mouse non si sveglia completamente.

Aprire la cavità toracica da tre a cinque giorni dopo l'iniezione del virus. Tagliare la pelle lungo la linea mediana ventrale e gli arti superiori e inferiori usando le forbici. Sollevare la pelle ed esporre le ghiandole mammarie.

Rimuovere la ghiandola mammaria iniettata dalla pelle e una ghiandola non iniettata come controllo utilizzando pinze e forbici. Una volta fatto, posizionare la ghiandola mammaria su un vetrino e diffondere la ghiandola alla sua forma originale prima di osservarla e visualizzarla sotto un microscopio stereo fluorescente. Il successo dell'iniezione intraduttale è stato confermato esponendo la ghiandola mammaria e osservando un albero duttale blu.

Dopo due-cinque giorni dall'iniezione del virus lenti-EGFPFUCGW, l'infezione delle cellule epiteliali mammarie è stata valutata osservando l'intera preparazione della montatura al microscopio stereoscopico fluorescente. Per l'analisi citometrica a flusso delle proteine fluorescenti o dei marcatori di superficie cellulare prodotti dal virus, le ghiandole non infette e le ghiandole infette sono state raccolte e trasformate in una singola sospensione cellulare per stimare il tasso di infezione virale. ERBBB2 attivato ha portato a lesioni precancerose in poche settimane e tumori in pochi mesi.

La dimensione dei capezzoli può variare in modo significativo a causa delle differenze di massa, età, peso corporeo e forza tra i singoli topi. Tagliare correttamente la punta del capezzolo per esporre l'apertura del dotto mammario e il montaggio dell'ago è un passo importante per iniettare con successo il virus.