Esplorazione delle aberrazioni cromosomiche X nelle cellule ovariche utilizzando l'ibridazione fluorescenza in situ

L'analisi FISH delle cellule ovariche di femmine con aberrazioni cromosomiche X è una tecnica unica per ottenere informazioni sul contenuto cromosomico X delle cellule ovariche in questo gruppo specifico. Queste tecniche potrebbero essere utili per saperne di più sul potenziale riproduttivo nelle femmine con aberrazioni cromosomiche X. È importante ricordare che entrambi i metodi hanno lo scopo di facilitare la ricerca futura e non sono progettati per essere utilizzati come strumento diagnostico nella pratica clinica.

A dimostrare la procedura saranno Ronald Peek, ricercatore senior del nostro laboratorio di fertilità, e Milad Intezar, analista del nostro dipartimento di patologia. Per iniziare, tagliare il tessuto della corteccia ovarica crioconservato o scongelato in piccoli pezzi di uno per uno per un millimetro usando un bisturi. Digerire enzimaticamente i frammenti di tessuto in quattro litri di L15 preriscaldato per 75 minuti a 37 gradi Celsius.

Pipettare la miscela di digestione su e giù ogni 15 minuti. Interrompere la digestione enzimatica aggiungendo quattro millilitri di L15 freddo integrato con siero bovino fetale al 10% o FBS. Lavare il tessuto dissociato una volta con otto millilitri di terreno L15 freddo mediante centrifugazione a 500 g prima di risospendere in 500 microlitri di terreno L15.

Trasferire la sospensione cellulare contenente in gran parte singole cellule stromali e piccoli follicoli in una capsula di Petri di plastica ed esaminare la sospensione al microscopio stereo. Prelevare manualmente i follicoli di dimensioni inferiori a 50 micrometri utilizzando una pipetta di plastica da 75 micrometri e trasferirli nella goccia di terreno L15 integrata con il 10% FBS a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire i follicoli purificati in una soluzione di tripsina allo 0,06%, un milligrammo per millilitro di EDTA e un milligrammo per millilitro di glucosio e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, ottenere cellule stromali ovariche dalla sospensione cellulare della corteccia utilizzando una pipetta di plastica da 75 micrometri. Per l'ibridazione in situ a fluorescenza o l'analisi FISH di singole cellule ovariche, trasferire i follicoli ovarici trattati con tripsina / EDTA / glucosio o cellule stromali in goccioline di cinque microlitri di cloruro di potassio 0,15 millimolare e 15 microlitri di DPBS su un vetrino e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Asciugare e prefissare il vetrino in 300 microlitri di cloruro di potassio 0,05 millimolare, acido acetico al 7,5% e metanolo al 22,5% per due minuti.

Coprire il vetrino con acido acetico metanolo tre a uno per due minuti per finalizzare la fissazione. Dopo la fissazione, lavare il campione due volte in SSC appena preparato a 73 gradi Celsius. Coprirlo con 100 microlitri di 2% di proteinasi K e sigillarlo con un vetrino di copertura.

Incubare il vetrino per 10 minuti a 37 gradi Celsius nella stazione di ibridazione. Dopo l'incubazione, rimuovere il vetrino di copertura e lavare il vetrino per cinque minuti in DPBS a temperatura ambiente sotto agitazione. Fissare il campione per cinque minuti con l'1% di formaldeide.

Quindi lavare il vetrino in DPBS e disidratarlo in serie aumentando le concentrazioni di etanolo per due minuti ciascuno. Asciugare all'aria il campione prima di ibridarlo con sonde marcate con fluorescenza. Quindi, aggiungere un microlitro di CEPX, un microlitro di CEP18 e 18 microlitri del tampone di ibridazione al campione e sigillare con un vetrino di copertura incollato al vetrino.

Trasferire il vetrino alla stazione di ibridazione per la denaturazione a 73 gradi Celsius per tre minuti, seguita dall'ibridazione durante un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. Dopo l'ibridazione, rimuovere il vetrino di copertura e l'eventuale colla residua dalla diapositiva. Lavare il vetrino in 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 a 72 gradi Celsius per due minuti, seguito da incubazione per un minuto in 2X SSC e 0,1% Tween-20.

Disidratare il vetrino come dimostrato e asciugarlo all'aria al buio prima di coprirlo con un supporto di montaggio contenente DAPI. Posizionare il vetrino a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti prima dell'analisi mediante microscopia a fluorescenza. Per ibridare le sezioni di paraffina, selezionare nuove sezioni prima o dopo la sezione contenente i follicoli dal nastro di paraffina.

Montare una sezione su un vetrino e asciugarla per 45 minuti su una stufa a 56 gradi Celsius. Deparaffinizzare la sezione in xilene per 10 minuti, quindi immergere il vetrino in etanolo al 99,5% e sciacquarlo per cinque minuti in acqua di rubinetto. Pretrattare il vetrino con la soluzione di recupero target per 10 minuti a 96 gradi Celsius.

Dopo il raffreddamento, sciacquare il vetrino in acqua distillata. Trattare il vetrino per cinque minuti con acido cloridrico molare 0,01, seguito da digestione della pepsina per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Risciacquare nuovamente il vetrino in acido cloridrico e successivamente in PBS.

Fissare il vetrino in 1% formaldeide PBS per cinque minuti. Quindi sciacquare brevemente il vetrino in PBS e di nuovo in acqua demineralizzata prima di disidratarlo in etanolo al 99,5%. Applicare cinque microlitri di sonda CEP18 e CEPX sul vetrino pretrattato.

Quindi applicare un vetrino di copertura e sigillare l'area con colla fotografica. Posizionare il vetrino in un ibridatore per la denaturazione a 80 gradi Celsius per 10 minuti e l'ibridazione durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare il vetrino due volte per cinque minuti ciascuno in SSC a 42 gradi Celsius, seguito da un risciacquo di due minuti e un minuto in 0,3% Nonidet P-40 a 73 gradi Celsius.

Ancora una volta, sciacquare il vetrino in 2X SSC seguito da risciacquare in acqua distillata prima di disidratarlo con etanolo al 99,5%. Asciugare all'aria la slitta e montarla in un supporto di montaggio contenente DAPI. Il tessuto della corteccia ovarica crioconservata nella paziente A ha mostrato il 50% dei linfociti, aveva un cariotipo X 45, e il 50% aveva 46, XX.In paziente B, il 38% dei linfociti erano 45, X, 28% erano 46, XX e 34% erano 47, XXX.

Le cellule stromali circostanti sono state anche analizzate per il contenuto cromosomico X. La digestione enzimatica del tessuto della corteccia ovarica ha provocato una sospensione di cellule in gran parte dissociate, ma lasciando i follicoli primordiali, costituiti da un ovocita intatto circondato da un singolo strato di cellule di granulosi. I piccoli follicoli hanno fornito difficoltà nell'interpretazione dei segnali dopo la FISH, a causa dell'aggregazione delle cellule di granulosi.

Un'ulteriore digestione dei follicoli con tripsina prima della FISH ha provocato la contrazione delle singole cellule di granulosi in una morfologia sferica sulla superficie dei follicoli. La colorazione dell'eosina ematossilina ha mostrato follicoli secondari e antrali morfologicamente normali nel tessuto della corteccia ovarica dopo cinque mesi di xenotrapianto. Il contenuto cromosomico X delle cellule di granulosi di questi follicoli è stato determinato mediante analisi FISH.

La fissazione del tessuto della corteccia ovarica innestata nella soluzione di Bouin ha provocato segnali fluorescenti sfocati e in gran parte oscurati nelle cellule follicolari a causa di una foschia verde. Al contrario, il tessuto della corteccia ovarica fissato nella formaldeide ha fornito eccellenti segnali fluorescenti. La sfida principale di questo protocollo risiede nell'isolamento delle cellule ovariche e nella digestione enzimatica del tessuto.

Deviare da questo protocollo può causare una sostanziale perdita di cellule ovariche durante il processo, e questo dovrebbe essere evitato soprattutto nelle donne che hanno già una bassa riserva ovarica. Un ulteriore profilo di espressione genica potrebbe essere utile per saperne di più sull'impatto delle cellule ovariche aneuploidi sulla follicologenesi e quindi sul processo di insufficienza ovarica prematura nelle femmine con aberrazioni cromosomiche X.