Metodi per studiare i contributi uterini all'instaurazione della gravidanza in un modello murino ovariectomizzato

Quindi è difficile separare il ruolo delle influenze ormonali uterine e ovariche sull'instaurazione della gravidanza poiché entrambi sono intimamente collegati. Quindi questo protocollo ci permette di esaminare direttamente i contributi uterini. Mentre alcune di queste tecniche come l'ovariectomia sono piuttosto invasive, sono relativamente semplici da eseguire dopo la pratica e l'allenamento, il che le rende adatte ai ricercatori che sono nuovi ai modelli murini.

Quindi questo metodo può essere utilizzato per comprendere la regolazione più ampia dell'asse HPG poiché sia le ovaie che l'utero svolgono un ruolo importante nella regolazione di questo asse. Se non hai mai eseguito queste tecniche prima, consulta il team veterinario del tuo istituto per la formazione e il supporto. Per iniziare, applicare generosamente il lubrificante per gli occhi a un topo anestetizzato tamponandolo delicatamente sull'occhio dopo aver rasato una piccola area sotto l'intuizione della colonna vertebrale.

Iniettare 0,1 millilitri di carprofen per via sottocutanea nella collottola. Verificare se l'animale è anestetizzato pizzicando il dito posteriore e controllando un riflesso. Quindi, applicare Betadine al sito chirurgico.

Quindi coprirlo con un drappeggio chirurgico. Usando una pinza a denti di ratto, allontana la pelle dall'intuizione verso l'alto e fai un'incisione longitudinale di cinque millimetri. Quindi, usando una pinza smussata, sezionare la pelle lontano dallo strato muscolare sottostante verso un lato verso il rene.

Identificare il rene, l'ovaio e il grasso ovarico attraverso la parete muscolare. Afferrare e sollevare lo strato muscolare con la pinza. Quindi, usando le forbici, fare un'incisione lunga da 0,5 a un centimetro e tirare il tampone ovarico attraverso l'incisione con un paio di pinze smussate.

Successivamente, utilizzando un portaaghi curvo, bloccare sotto l'ovaio e l'ovidotto all'estremità distale del corno uterino e asportare l'ovaio con le forbici. Dopo 30 secondi, rimuovere il morsetto e tamponare con una garza sterile. Per chiudere l'incisione della parete muscolare, sollevare la parte superiore dell'incisione usando una pinza.

Quindi legare l'incisione con un nodo del chirurgo usando punti di sutura di seta. Applicare localmente alcune gocce di bupivacaina usando una siringa da un millilitro senza attacco dell'ago e tamponare l'eccesso con una garza sterile. Dopo aver eseguito in modo simile l'ovariectomia sull'altro lato, chiudere l'incisione cutanea premendo i due lati della pelle insieme e applicando un paio di clip chirurgiche da sette millimetri, lasciando spazio al gonfiore della ferita.

Posizionare tutte le attrezzature necessarie su un foglio all'interno di un cappuccio di biosicurezza a flusso laminare o di classe II e sterilizzare UV per 20 minuti. Lavare il tubo silastic in 100% desinol e lasciarlo asciugare all'aria all'interno del cappuccio. Una volta asciutto, tagliare il tubo in segmenti lunghi un centimetro usando un bisturi.

Quindi, spremere circa 200 microlitri di sigillante in una siringa senza stantuffo. Riposizionare lo stantuffo e spingere fuori una piccola quantità di sigillante. Applicare il sigillante su un'estremità del tubo, lisciandolo con un dito guantato.

E lasciare asciugare il sigillante durante la notte o sotto la luce UV per 30 minuti nel cappuccio. Quindi, versare la polvere di progesterone in una capsula di Petri sterilizzata. Raccogliere la polvere in pellet con l'aiuto di una pinza.

Picchiettare l'estremità sigillata del pellet lungo la superficie della cappa per condensare la polvere. Quindi sigillare l'estremità aperta con il sigillante. Avvolgere la capsula di Petri contenente i pellet in un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce.

Circa 72 ore prima dell'inserimento sottocutaneo, attivare i pellet incubandoli in FCS spogliato di carbone. A dimostrare questa procedura sarà la dottoressa Fiona Cousins, ricercatrice all'inizio della carriera dell'Hudson Institute of Medical Research. Dopo aver innescato gli animali con iniezioni sottocutanee di estradiolo, innescare gli animali con pellet di progesterone sottocutaneo due giorni prima della decidualizzazione artificiale.

Prima dell'intervento, anestetizzare il topo e testare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso del pizzico della punta. Quindi posizionare il topo in posizione prona, sollevare la coda e inserire lentamente uno speculum di sei millimetri nella sua vagina. Posizionare la parte inferiore del corpo del mouse tra le prime due dita della mano non dominante.

Quindi, usando il dito indice, spingere delicatamente la coda verso l'alto per consentire una migliore accessibilità vaginale. Trasferire 20 microlitri di olio di sesamo in una punta di trasferimento embrionale non chirurgica e inserire la punta attraverso la vagina e la cervice nel corno uterino. Espellere lentamente l'olio.

Una volta fatto, rimuovere lo speculum dalla vagina. In questo studio, l'80% dei topi ha subito una decidualizzazione di successo, mentre il 20% no. Quindi è importante mantenere tutte le attrezzature chirurgiche e le aree di lavoro sterili e avere pazienti quando si inserisce il dispositivo FANS attraverso la cervice nel corno uterino del topo.

Dopo aver indotto la decidualizzazione artificiale, il palato del progesterone può essere rimosso per imitare le mestruazioni e studiare la rottura endometriale. Usando questo metodo, possiamo studiare la biologia uterina e la regolazione indipendentemente dall'influenza delle ovaie. Questo è davvero eccitante nell'area della fertilità e della salute delle donne in generale.