Applicazione del sistema intelligente di test di sensibilità antimicrobica/screening fagico ad alto rendimento e dell'indice Lar di resistenza antimicrobica

Questo protocollo presenta un metodo multilivello, sia per la rilevazione dell'EST che per la figura del fago. Ha inoltre introdotto un grande indice per i salvataggi per confrontare i livelli EMR di diverse tecnologie di controllo. Questa tecnica economica è intelligente, ad alta produttività e multifunzionale.

Ha permesso la creazione di VAMS, una rete di monitoraggio veterinario che ha raccolto 20.000 geni epidemici e fagi analitici. Questo metodo può essere utilizzato anche per il monitoraggio e il controllo dei batteri patogeni in medicina, agricoltura, batterie cardiache animali e pesca. Questo protocollo e questo documento aziendale dovrebbero prevedere di essere un.

Noi con guida di formazione tecnica. Seguirlo aiuterebbe chiunque a padroneggiare la tecnica in un breve lasso di tempo. Iniziare incubando l'organismo di controllo qualità E.coli e 93 ceppi di salmonella testati su piastre di agar Mueller-Hinton.

Successivamente, diluire l'inoculo preparato di ciascun ceppo 10 volte. Trasferire 200 microlitri di soluzione fisiologica normale sterile nel pozzetto a-1 di una piastra a 96 pozzetti come controllo negativo. Quindi pipettare due sospensioni di E.coli nei pozzetti a-2 e a-3 rispettivamente come controlli positivi e di qualità.

Ai restanti 93 pozzetti, aggiungere 200 microlitri del ceppo di prova diluito. Per la preparazione delle piastre di agar antimicrobico. Innanzitutto, impostare gli intervalli di concentrazione per i diversi agenti antibatterici testati, in base all'indice LAR.

Eseguire uno schema di diluizione di raddoppio log-due per la soluzione antibiotica seguendo il metodo di diluizione dell'agar standard CLSI. Ora aggiungi due millilitri di soluzione antimicrobica a un flacone di vetro sterilizzato contenente 18 millilitri di terreno di agar fuso Mueller-Hinton. Dopo aver mescolato accuratamente, versare in piastre all'interno di un armadio di sicurezza biologica.

Lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente. Assicurati di lasciare uno spazio sotto il coperchio delle piastre per consentire l'asciugatura della superficie dell'agar. Etichettare i tipi di agenti antimicrobici e le rispettive concentrazioni sul lato inferiore delle piastre incubate.

Disporre le piastre incubate multiple per ciascun agente antimicrobico in una pila disposta in ordine di diluizione di raddoppio del log due. Infine, preparare due piastre di agar prive di farmaci che fungano da controlli per ciascun agente. Installare una piastra di inoculazione sterilizzata sul supporto di un inoculatore a matrice di 96 punti all'interno di un armadio di sicurezza biologica.

Successivamente, disporre il blocco di semi preparato con i ceppi testati e una piastra incubata in agar sul supporto mobile. Spingere il supporto mobile fino a quando il blocco di semina non si trova sotto la piastra del perno di inoculazione. Ora premere la maniglia di comando e abbassare la piastra del perno di inoculazione, guidando i 96 perni verso l'inoculo nei 96 pozzetti del blocco di semina.

Rilasciare la maniglia di funzionamento in modo controllato e ripristinare automaticamente la piastra del perno di inoculazione per mescolare bene ogni inoculo e immergere, spingere la maniglia di funzionamento due o tre volte. Successivamente, spostare e posizionare la piastra di supporto in modo che la piastra di incubazione si trovi sotto la piastra del perno di inoculazione. Premere verso il basso la maniglia di comando, abbassando la piastra del perno di inoculazione e lasciandola per uno o due secondi per garantire il pieno contatto con la superficie della piastra incubata.

Rilasciare la maniglia di comando per completare un ciclo di inoculazione. Sostituire la piastra incubata e ripetere il processo fino al completamento del lotto di piastre agar antimicrobiche. Passa a una nuova piastra di inoculazione e a un nuovo blocco di semi per inoculare un altro gruppo di ceppi testati.

Incubare le piastre di agar antimicrobico inoculate a temperatura ambiente fino a quando l'umidità dei punti di inoculo non viene completamente assorbita dall'agar. Dopo l'incubazione, capovolgere le piastre e continuare l'incubazione per consentire ai batteri disinibiti di formare colonie. Per eseguire l'acquisizione di immagini e statistiche dei dati, iniziare facendo clic sul sistema di acquisizione di immagini AST a matrice di 96 punti per avviare il programma.

Dalla barra delle applicazioni, seleziona informazioni sul test. Fare clic su Nuovo per creare una nuova attività di test e immettere i dettagli richiesti. Quindi premere raccolta dati seguita da fotografia e elemento di prova per selezionare l'attività appena creata.

Scegliere antibiotici per selezionare il nome dell'antibiotico e gradiente per selezionare la concentrazione iniziale dell'antibiotico. Infine, fare clic su Connetti per stabilire una connessione con il convertitore di acquisizione immagini. Quindi, posizionare le piastre incubate sulla base della piastra di rilevamento e inserirle nel convertitore di acquisizione delle immagini.

Clicca sulla collezione per catturare le immagini delle tavole. Premere gli antibiotici e selezionare il set di piastre successivo. Scegli la sfumatura per identificare la sfumatura iniziale, quindi procedi al prossimo round di raccolta di immagini.

Finalizzare la procedura facendo clic su invia per determinare la formazione della colonia e convertire le immagini in concentrazioni minime inibitorie, ovvero valori MIC. Fare clic sulla query per accedere a tutti i risultati del MIC. Inizia utilizzando il metodo dell'agar a doppio strato per produrre fagi diversi.

Diluire i fagi a un'adeguata concentrazione parallela e aggiungere 200 microlitri di inoculo fagico nel blocco di semi a 96 pozzetti. Successivamente, preparare una piastra incubata a doppio strato per ogni ceppo da esaminare. Lasciare uno spazio sotto il coperchio della piastra a doppio strato per consentire l'asciugatura.

Posizionare il blocco di semi di fago preparato e la piastra a doppio strato sul supporto mobile dell'inoculatore a matrice di punti 96. Trasferire tutto l'inoculare fagico sulla superficie semi agar. Lasciare che le piastre rimangano a temperatura ambiente fino a quando tutta l'umidità inoculare non è stata assorbita nel semi agar.

Ora incubate le piastre a 37 gradi Celsius per i ceppi testati per quattro-sei ore. Utilizzare il convertitore di acquisizione immagini per ottenere e salvare l'immagine del risultato sperimentale di ciascuna lastra a doppio strato. Registra il numero e le morfologie delle diverse forme di spot in un foglio di calcolo basato sulle immagini ottenute e calcola le rispettive proporzioni dei diversi tipi di fagi.

Lo studio morfologico della crescita di salmonella su piastre con ampicillina ha mostrato che il controllo negativo in a-1 non ha mostrato alcuna crescita. La MIC del ceppo di salmonella in a-4 era di 64 microgrammi per millilitro, mentre quella di a-5 era di 16 microgrammi per millilitro. I valori percentuali di resistenza di ampicillina, ciprofloxacina e amoxicillina-acido clavulanico erano superiori al 50%, mentre quelli di doxiciclina, florfenicolo, cefotaxima ed enrofloxacina erano dal 30% al 50%Gentamicina, amikacina e meropenem hanno mostrato valori percentuali di resistenza inferiori al 30%Gli indici LAR di ciprofloxacina e amoxicillina-acido clavulanico differivano in modo significativo.

Le analisi morfologiche della crescita di salmonella su piastre a doppio strato hanno mostrato che sono state osservate quattro morfologie principali dei fagi. La macchia litica rotonda e chiara proveniva da un fago che poteva uccidere in modo affidabile l'ospite sulla piastra, ma che poteva o meno replicarsi con successo a spese di quell'ospite. La collezione di targhe era formata da vere e proprie placche.

La macchia litica torbida è il risultato di un fago che non ha ucciso in modo affidabile l'ospite sulla piastra e che può o non può replicarsi con successo a spese di quell'ospite. La macchia non litica indicava una natura non litica. Questa tecnica trasferisce facilmente in modo efficiente 96 lenti di agar in una sola volta e gli strumenti riconoscono automaticamente le immagini e quindi calcolano i dadi a linea.

Questa tecnologia dovrebbe promuovere la ricerca e l'industrializzazione dei fagi e l'applicazione dei fagi è uno dei modi sorprendenti per ridurre e risolvere il problema della resistenza antimicrobica.