Name: Sintesi di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri la sintesi di idrogel di matrice extracellulare da cartilagine decellularizzata. Questo metodo combina trattamenti fisici, chimici e digestione enzimatica per rimuovere il materiale cellulare preservando la struttura ECM.

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Questo lavoro è stato sponsorizzato dal Piano di Medicina e Tecnologia Sanitaria della Provincia di Zhejiang (2019KY050), dal Piano di Scienza e Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della Provincia di Zhejiang (2019ZA026), dal Piano di Ricerca e Sviluppo Chiave nella Provincia di Zhejiang (Grant No.2020C03043), dal Piano di Scienza e Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della Provincia di Zhejiang (2021ZQ021) e dalla Fondazione Provinciale di Scienze Naturali della Cina di Zhejiang (LQ22H060007).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale di Tongde della provincia di Zhejiang.
1. Preparazione dell'idrogel DC-ECM
NOTA: In questo studio, la cartilagine è stata ottenuta dalle articolazioni del ginocchio di maiali in miniatura Bama di 12 mesi, evitando la raccolta di tessuto osseo.
<ol><li>Prendete la cartilagine raccolta, bloccatela e tagliatela in1-2 mm 3 pezzi con un bisturi.</li>
	<li>Mettere 20 g di cartilagine tritata in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere 20 ml di tampone Tris-HCl ipotonico (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) per immergere completamente il tessuto. Mettere la provetta da centrifuga in un congelatore a -80 °C per 3 ore e poi in un forno a 37 °C per 3 ore. Ripetere la fase di congelamento e riscaldamento sei volte. In questa fase, il tampone ipotonico Tris-HCl non deve essere sostituito.</li>
	<li>Agitare la provetta da centrifuga per 30 s utilizzando un miscelatore a vortice a una velocità di 1.000 giri/min. Posizionare un setaccio in acciaio inossidabile (dimensione dei pori: ~250 μm) su una nuova provetta da centrifuga da 50 mL.</li>
	<li>Decantare lentamente la cartilagine decellularizzata nel setaccio in acciaio inossidabile, lavare il tessuto tre volte con PBS sterile e raccogliere la cartilagine.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di soluzione di tripsina (0,25% di tripsina in PBS) e posizionare la provetta su uno shaker a 37 °C per 24 ore. Durante questo periodo, sostituire la tripsina ogni 4 ore. Filtrare la sospensione con il setaccio in acciaio inossidabile e conservare il tessuto. La tripsina può essere trattata durante la notte durante uno dei processi di digestione e questo non influirà sulla digestione finale.</li>
	<li>Lavare il tessuto tripsinizzato con tampone ipertonico (1,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6).</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di soluzione di nucleasi (50 U/mL di desossiribonucleasi e 1 U/mL di ribonucleasi in 10 mM di Tris-HCl, pH 7,5) e posizionare la provetta su uno shaker a 37 °C per 4 ore.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di nucleasi, lavare la cartilagine tre volte con PBS sterile e aggiungere una soluzione ipotonica di Tris-HCl. Posizionare la provetta da centrifuga su uno shaker e risciacquare per 20 ore a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Rimuovere la soluzione ipotonica di Tris-HCl, lavare la cartilagine tre volte con PBS sterile e aggiungere una soluzione di Triton X-100 all'1% per immergere il tessuto per 24 ore.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione Triton X-100 e sciacquare accuratamente la cartilagine decellularizzata con acqua distillata per 3 giorni, cambiando l'acqua distillata ogni 12 ore.</li>
	<li>Immergere la cartilagine in una soluzione di acido peracetico (0,1% PAA in 4% etanolo) per 4 ore. Rimuovere la soluzione di acido peracetico e lavare la cartilagine tre volte con acqua distillata sterile.</li>
	<li>Posizionare il setaccio in acciaio inossidabile (dimensione dei pori: ~250 μm) su una provetta da centrifuga da 50 mL. Decantare lentamente la cartilagine decellularizzata nel setaccio in acciaio inossidabile e raccogliere la cartilagine. Testare il grado di decellularizzazione e la ritenzione della matrice della cartilagine stimando il contenuto di DNA, collagene e glicosaminoglicani (GAG).</li>
	<li>Metti la cartilagine decellularizzata in una ciotola di macinazione, aggiungi azoto liquido e macina la cartilagine decellularizzata per formare una polvere. Prendere 2 g di polvere di cartilagine decellularizzata, aggiungere 80 ml di acido acetico 0,5 M e 20 mg di pepsina e digerire per 24 ore. Centrifugare a 400 x g per 10 min; scartare il sedimento e raccogliere la soluzione surnatante (soluzione DC-ECM).</li>
	<li>Decantare 1 mL di soluzione DC-ECM per pozzetto in piastre da 6 pozzetti. Mettere le piastre a 6 pozzetti in un liofilizzatore. Congelare la soluzione DC-ECM. Una volta che la temperatura nel liofilizzatore scende a -40 °C, accendere la pompa del vuoto e mantenere il grado di vuoto a 10 Pa per 22 ore.</li>
	<li>Estrarre la soluzione DC-ECM liofilizzata, metterla in provette da centrifuga e conservarla a -20 °C. Il periodo minimo di conservazione della soluzione DC-ECM liofilizzata supera la metà dell'anno.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di acqua distillata sterile per sciogliere 20 mg di soluzione DC-ECM liofilizzata nella provetta da centrifuga. Agitare per 1 minuto utilizzando un miscelatore a vortice a una velocità di 1.000 giri/min a RT. Aggiungere 1 mg di vitamina B2 (0,1% p/v) alla soluzione DC-ECM, incubare a 37 °C per 60 minuti e irradiare con luce UV (370 nm, 3,5 mW/cm2) per 3 minuti per formare un idrogel (idrogel DC-ECM).</li>
</ol>2. Rilevamento della cartilagine decellularizzata
<ol><li>Rilevamento del contenuto di DNA della cartilagine decellularizzata NOTA: Estrarre il DNA utilizzando il kit DNEasy Blood & Tissue.<ol><li>Per prima cosa, prendi 20 mg di cartilagine DC-ECM in una provetta da centrifuga. Aggiungere 180 μL di Buffer GTL e 20 μL di Proteinasi K mediante oscillazione del vortice e incubare la cartilagine a 56 °C per 4 ore fino a quando non è completamente disciolta.</li>
		<li>Agitare la provetta da centrifuga per 15 secondi utilizzando un miscelatore a vortice a una velocità di 1.000 giri/min a RT. Successivamente, aggiungere 200 μL di Buffer GL ed etanolo anidro e mescolare accuratamente mediante vibrazione a vortice. Centrifugare i campioni per 1 minuto a una velocità di 6.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di tampone GW1 alla colonna di adsorbimento e centrifugare i campioni per 1 minuto a una velocità di 12.000 x g a 4 °C. Aggiungere 500 μL di tampone GW2 alla colonna di adsorbimento e centrifugare a 20.000 x g a 4 °C per 1 minuto. Infine, aggiungere 50 μL di acqua sterilizzata alla colonna di adsorbimento e centrifugare per 1 minuto a una velocità di 6.000 x g a 4 °C per raccogliere la soluzione di DNA. Determinare il contenuto di DNA utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento del contenuto di collagene nella cartilagine decellularizzata<ol><li>Per rilevare il contenuto di collagene nella cartilagine decellularizzata, utilizzare l'idrossiprolina come marcatore di aminoacidi del collagene. Acidificare 5 mg di cartilagine decellularizzata con 5 mL di acido cloridrico 6 M a 100 °C per 20 min, quindi neutralizzarli con 5 mL di una soluzione di idrossido di sodio 6 M.</li>
		<li>Calcolare il contenuto di idrossiprolina misurando l'assorbanza del campione a 570 nm con uno spettrofotometro. Ottenere una regressione lineare concentrazione-assorbimento utilizzando il campione standard di idrossiprolina.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento del contenuto di GAG nella cartilagine decellularizzata NOTA: Il contenuto di GAG nella cartilagine DC-ECM è stato rilevato utilizzando un kit di rilevamento quantitativo colorimetrico GAG tissutale. Tutti i reagenti riportati di seguito sono disponibili nel kit.<ol><li>Prelevare 200 mg di polvere di cartilagine DC-ECM e aggiungere 500 μL di reagente A mediante oscillazione a vortice. Incubare il campione a 4 °C per 16 ore, quindi centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti.</li>
		<li>Prelevare 50 mL di soluzione campione e aggiungere 50 μL di soluzione ad alto contenuto salino (reagente B) e 50 μL di soluzione acida (reagente C) mediante oscillazione a vortice. Incubare il campione per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere 750 μL di soluzione colorante (reagente D) mediante oscillazione a vortice e incubare il campione per 30 minuti in condizioni di oscurità. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 10 minuti, quindi scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 1 μL di soluzione detergente (reagente E) e mescolare bene. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 10 minuti ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 1 μL di soluzione di dissociazione (reagente F) al campione e mescolare bene. Incubare il campione per 30 minuti in condizioni di oscurità. Infine, determinare il contenuto di GAG utilizzando uno spettrofotometro a 600 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) e al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) della cartilagine decellularizzata<ol><li>Confronta la cartilagine decellularizzata e il tessuto cartilagineo normale. Porre il campione in una soluzione di glutaraldeide al 2,5%, incubare a 4 °C per una notte e poi lavare con PBS tre volte.</li>
		<li>Fissare il campione all'1% di OsO4 per 1 ora, quindi lavare tre volte con PBS.</li>
		<li>Disidratare il campione mediante immersione sequenziale in etanolo al 50%, 70%, 90% e 100% e acetone al 100% per 15 minuti ciascuno. Porre il campione in una soluzione mista di esametildisilazano ed etanolo (1:1) per 15 minuti, seguito da immersione in esametildisilazano puro per 15 minuti.</li>
		<li>Mettere il campione in un essiccatore HCP-2, quindi asciugare con azoto liquido. Quindi, rivestire il campione completamente essiccato con un sottile strato di oro-palladio utilizzando il rivestimento sputter e l'immagine utilizzando SEM. Il rivestimento sputtering è stato eseguito ad una potenza di 120 W per 5 min. L'esperimento è stato condotto nelle seguenti condizioni: una tensione di lavoro di 15 kV e un grado di vuoto inferiore a 5 x 10−5 Pa.</li>
		<li>Per l'analisi TEM, porre il campione in una miscela di acetone anidro e resina (1:1) per 1 ora, seguita da una miscela di acetone anidro e resina (1:3) per 3 ore. Quindi, metti il campione nella resina per una notte.<ol><li>Porre il campione in capsule riempite di terreno e riscaldare a 70 °C per 9 ore.</li>
			<li>Dopo l'inclusione, tagliare il campione in fette sottili da 70 nm utilizzando un microtomo ultrafine e posizionarlo su una rete di rame.</li>
			<li>Pipettare 20 μL di soluzione colorante con acetato di uranile sulla rete di rame e colorare per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione colorante lavando delicatamente la rete due volte con acqua distillata.</li>
			<li>Quindi, pipettare 20 μL di soluzione colorante di citrato di piombo sulla rete di rame e colorare per 15 minuti a RT. Lavare la rete tre volte con acqua distillata.</li>
			<li>Posizionare la rete di rame su una capsula di Petri pulita rivestita di carta da filtro. Dopo l'asciugatura all'aria, fotografare le sezioni utilizzando TEM. La sonda è stata applicata con una forza verso il basso di 500 nN, scansionata a una velocità di 1 Hz e aveva una costante elastica (valore k) di 40 Nm-1. Il raggio della punta della sonda è stato misurato in 8 nm.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+hydrogels+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering.</a> European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).</li>
<li>Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+hydrogels+for+osteochondral+and+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).</li>
<li>Bejleri, D., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+materials+for+cardiac+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217(2019).</li>
<li>Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix%3A+New+promising+and+challenging+biomaterials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine.</a> Biomaterials. 289, 121786(2022).</li>
<li>Barbulescu, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+cardiovascular+tissue+engineering%3A+Current+techniques+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040(2022).</li>
<li>Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+in+decellularized+extracellular+matrix-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels.</a> Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+articular+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair.</a> International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).</li>
<li>Li, T., Javed, R., Ao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+decellularized+extracellular+matrix-based+biomaterials+for+peripheral+nerve+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration.</a> Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).</li>
<li>Xia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+cartilage+as+a+prospective+scaffold+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering+C-Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair.</a> Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).</li>
<li>Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desktop-stereolithography+3D+printing+of+a+radially+oriented+extracellular+matrix%2Fmesenchymal+stem+cell+exosome+bioink+for+osteochondral+defect+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration.</a> Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+delivery+in+tissue-specific+hydrogel+enabled+meniscal+repair+in+an+orthotopic+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model.</a> Biomaterials. 132, 59-71 (2017).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensified+stiffness+and+photodynamic+provocation+in+a+collagen-based+composite+hydrogel+drive+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis.</a> Advanced Science. 6 (16), 1900099(2019).</li>
<li>Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.Nanoscale+and+mechanical+properties+of+the+physiological+cell-ECM+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).</li>
<li>Abdolghafoorian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heart+valve+decellularization+on+xenograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo fornisce un approccio sistematico per la preparazione di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata che imitano da vicino l'ECM nativa del tessuto cartilagineo. Il protocollo prevede una combinazione di disgregazione fisica, chimica ed enzimatica per rimuovere il materiale cellulare preservando la struttura e la composizione dell'ECM. I passaggi critici del protocollo includono la regolazione del tempo e dei metodi di decellularizzazione e la garanzia di una decellularizzazione...

L'ingegneria tissutale della cartilagine è un campo in rapido sviluppo che cerca di rigenerare il tessuto cartilagineo danneggiato o malato1. Una sfida chiave in questo campo è lo sviluppo di scaffold biomimetici in grado di supportare la crescita e la differenziazione dei condrociti, le cellule responsabili della produzione di cartilagine2. L'ECM del tessuto cartilagineo svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del comportamento dei condrociti. DC-ECM è un'impalcatura efficace per applicazioni di ingegneria tissutale3.
Sono state sviluppate diverse tecniche per produrre DC-ECM dal tessuto cartilagineo, inclusi metodi chimici, enzimatici e fisici. Tuttavia, questi metodi spesso portano alla generazione di idrogel ECM che non sono sufficientemente biomimetici, il che limita il loro potenziale per l'uso in applicazioni di ingegneria tissutale 4,5. Pertanto, è necessario un metodo più efficace per la produzione di idrogel DC-ECM.
Lo sviluppo di questa tecnica è importante perché può far progredire il campo dell'ingegneria tissutale fornendo un nuovo approccio per la creazione di scaffold biomimetici in grado di supportare la rigenerazione e la riparazione dei tessuti. Inoltre, questa tecnica potrebbe essere facilmente adattata per produrre idrogel ECM da altri tessuti, ampliando così le sue potenziali applicazioni.
Nel più ampio corpus della letteratura, c'è stato un crescente interesse per l'utilizzo di DC-ECM come impalcatura per applicazioni di ingegneria tissutale6. Numerosi studi hanno dimostrato l'efficacia degli idrogel DC-ECM nel promuovere la crescita e la differenziazione cellulare in vari tessuti, tra cui la cartilagine 7,8. Pertanto, lo sviluppo di un protocollo per la produzione di idrogel DC-ECM che imitano da vicino l'ECM naturale del tessuto cartilagineo è un contributo significativo al campo.
Il protocollo presentato in questo documento risponde a questa esigenza fornendo un nuovo metodo per la produzione di idrogel DC-ECM che imitano da vicino l'ECM naturale del tessuto cartilagineo. Il protocollo prevede la decellularizzazione del tessuto cartilagineo, l'isolamento dell'ECM risultante e la creazione di un idrogel reticolando l'ECM con un polimero biocompatibile. L'idrogel risultante ha mostrato risultati promettenti nel sostenere la crescita e la differenziazione dei condrociti.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl, pH7.6</td><td>Beyotime</td><td>ST776-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH8.0</td><td>Beyotime</td><td>ST780-500 mL-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Congelatore</td><td>Eppendorf</td><td>F440340034</td><td></td></tr><tr><td>desossiribonucleasi</td><td>Aladino</td><td>D128600-80KU</td><td></td></tr><tr><td>DNEasy Sangue & Kit fazzoletto</td><td>Qiagen</td><td>n. 69506</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rilevamento quantitativo colorimetrico GAG</td><td>Shanghai Haling</td><td>HL19236.2</td><td></td></tr><tr><td>HCP-2 essiccatore&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Spettrofotometro</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasi</td><td>Aladdin</td><td>R341325-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sigma500</td><td>ZIESS</td><td>N/A</td><td>Microscopio elettronico a scansione</td></tr><tr><td>Spectra S</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td></tr><tr><td>Setaccio in acciaio inossidabile</td><td>SHXB-Z-1</td><td>Shanghai Xinbu</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beyotime</td><td>P0096-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>Lampada a raggi ultravioletti</td><td>Omnicure 2000</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina B2</td><td>Gibco</td><td>R4500-5G</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Shanghai Qiasen</td><td>78HW-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

sintesi di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Gli idrogel della matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata (DC-ECM) sono biomateriali promettenti per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa grazie alla loro biocompatibilità e alla capacità di imitare le proprietà naturali dei tessuti. Questo protocollo mira a produrre idrogel DC-ECM che imitano da vicino l'ECM nativo del tessuto cartilagineo. Il protocollo prevede una combinazione di disgregazione fisica e chimica e digestione enzimatica per rimuovere il materiale cellulare preservando la struttura e la composizione dell'ECM. Il DC-ECM è reticolato utilizzando un agente chimico per formare un idrogel stabile e biologicamente attivo. L'idrogel DC-ECM ha un'eccellente attività biologica, struttura spaziale e funzione di induzione biologica, nonché una bassa immunogenicità. Queste caratteristiche sono utili per promuovere l'adesione, la proliferazione, la differenziazione e la migrazione cellulare e per creare un microambiente superiore per la crescita cellulare. Questo protocollo fornisce una risorsa preziosa per ricercatori e clinici nel campo dell'ingegneria tissutale. Gli idrogel biomimetici possono potenzialmente migliorare lo sviluppo di efficaci strategie di ingegneria tissutale per la riparazione e la rigenerazione della cartilagine.

Per preparare un migliore idrogel di cartilagine DC-ECM, abbiamo studiato e rivisto la letteratura precedente e confrontato i vari protocolli di decellularizzazione in termini di rapporto di decellularizzazione, immunogenicità e funzionalità meccanica9.
Su questa base, abbiamo preparato l'idrogel di cartilagine DC-ECM e abbiamo esplorato l'effetto di una matrice estrattiva orientata radialmente/bio-inchiostro di esosomi di cellule staminali mesenchimali nel trattamento ...

Questo articolo introduce un nuovo metodo per la sintesi di idrogel di matrice extracellulare di cartilagine decellularizzata (DC-ECM). Gli idrogel DC-ECM hanno un'eccellente biocompatibilità e forniscono un microambiente superiore per la crescita cellulare. Pertanto, possono essere scaffold cellulari ideali e sistemi di rilascio biologico.

Sintesi di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Il nostro protocollo è significativo in quanto consente la creazione di malattie in idrogel che assomigliano molto alla natura del tessuto cartilagineo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di produrre malattie in idrogel con evidente attività biologica nella struttura spaziale, bassa immunogenicità e funzione biologica industriale. Per iniziare, taglia la cartilagine raccolta usando un bisturi in pezzi di uno o due millimetri cubi di dimensione.In una provetta da centrifuga da 50 millimetri, immergere 20 grammi di cartilagine tritata in 20 millilitri di tampone ipotonico Tris-cloridrato. Metti il tubo a 80 gradi Celsius per tre ore, quindi in forno a 37 gradi Celsius per tre ore. Agitare la provetta da centrifuga per 30 secondi a 1000 giri/min.Quindi filtrare la cartilagine decellularizzata utilizzando un setaccio di plastica posto su una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Lavare la cartilagine tre volte con PBS sterile prima di raccoglierla. Aggiungere 10 millilitri di soluzione di tripsina alla cartilagine raccolta e incubarla su uno shaker a 37 gradi Celsius per 24 ore, sostituendo la tripsina ogni quattro ore.Dopo aver filtrato la sospensione, lavare la cartilagine tripsinizzata con tampone ipertonico. Una volta che la cartilagine è preservata, aggiungere 10 millilitri di soluzione di nucleasi e metterla su uno shaker a 37 gradi Celsius per quattro ore. Dopo il lavaggio con PBS sterile, aggiungere una soluzione ipertonica di Tris-cloridrato alla cartilagine e posizionarla sullo shaker come dimostrato.Una volta lavato con PBS sterile, immergere il tessuto in una soluzione di Triton X-100 all'1% per 24 ore. Dopo aver rimosso il Triton X-100, sciacquare la cartilagine decellularizzata con acqua distillata per tre giorni, cambiando l'acqua ogni 12 ore. Dopo tre giorni, aggiungere una soluzione di acido peracetico alla cartilagine e immergerla per quattro ore.Una volta lavata con PBS, raccogliere la cartilagine utilizzando un setaccio di plastica come precedentemente dimostrato. Utilizzando azoto liquido, preparare la polvere di cartilagine decellularizzata. Aggiungere 80 millilitri di acido acetico molare 0,5 e 20 milligrammi di pepsina a due grammi di polvere di cartilagine e digerire la miscela per 24 ore a 37 gradi Celsius.Dopo la digestione, centrifugare la sospensione a 400 G per 10 minuti e raccogliere il surnatante, che ora è chiamato soluzione DC-ECM Per conservare la soluzione DC-ECM, aggiungere un millilitro della soluzione a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e metterlo in un liofilizzatore. Una volta che la soluzione è liofilizzata, trasferirla in una provetta da centrifuga. Per formare un idrogel, sciogliere 20 milligrammi di soluzione DC-ECM liofilizzata in un millilitro di acqua distillata sterile.Una volta vortexato, aggiungere un milligrammo di vitamina B2 alla soluzione DC-ECM. Dopo l'incubazione, irradiarlo con luce UV per tre minuti. Aggiunga il tampone GTL e la proteinasi K a 20 milligrammi di polvere di cartilagine DC-ECM e mescoli accuratamente usando l'oscillazione del vortice.Per una completa dissoluzione della cartilagine, incubare la miscela a 56 gradi Celsius per quattro ore. Una volta vortexato, aggiungere 200 microlitri di tampone GTL seguito da etanolo anidro. Dopo il vortex, centrifugare il campione a 6000 G per un minuto a quattro gradi Celsius.Quindi raccogli e quantifica il DNA come descritto nel manoscritto. Per analizzare il collagene, acidificare cinque milligrammi di polvere DC-ECM in acido cloridrico a 100 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi neutralizzarlo con cinque millilitri di soluzione di idrossido di sodio a sei molari.Calcolare il contenuto di idrossiprolina del campione neutralizzato utilizzando l'assorbanza a 570 nanometri rispetto allo standard di idrossiprolina. Aggiungere 500 microlitri di reagente A a 200 milligrammi di polvere DC-ECM dopo la miscelazione. Incubare il campione a quattro gradi Celsius per 16 ore.Una volta centrifugato, raccogliere 50 microlitri di soluzione del campione e aggiungere 50 microlitri di reagente B, seguiti dal reagente C. Dopo aver incubato il campione per 10 minuti, aggiungere 750 microlitri di reagente D e incubare per 30 minuti al buio. Dopo la centrifugazione, aggiungere un microlitro di reagente E al pellet e mescolare bene prima della centrifugazione. Quindi dissociare il campione prima della misurazione del contenuto di GAG.Nella cartilagine DC-ECM preparata, il contenuto di DNA è stato significativamente eliminato. Tuttavia, il contenuto di collagene e GAG è stato mantenuto rispetto alla cartilagine nativa. L'analisi SEM e TEM ha dimostrato l'ultrastruttura del DC-ECM preparato.L'idrogel preparato nel tubo rovesciato non è fluito sul fondo, dimostrando così la gelificazione. Inoltre, rispetto alla sola soluzione DC-ECM, l'aggiunta di vitamina B2 ha ridotto il tempo di gelificazione a causa della reticolazione indotta durante la formazione dell'idrogel DC-ECM. La viscosità dell'idrogel DC-ECM era superiore alla viscosità della soluzione e l'aumento della velocità di taglio ha ridotto la viscosità della soluzione.Inoltre, l'elevato modulo di conservazione della soluzione DC-ECM e dell'idrogel indicava che entrambi avevano proprietà gelatinose piuttosto che liquide. L'analisi SEM ha dimostrato che la dimensione dei pori della soluzione DC-ECM è stata significativamente ridotta nella forma di idrogel dopo la reticolazione e la liofilizzazione. Il protocollo prevede una combinazione di disgregazione fisica e chimica e digestione enzimatica per rimuovere il materiale cellulare preservando la struttura e la conversazione dell'ECM.

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