Name: Ottimizzazione della resa di tubulina dal tessuto cerebrale suino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Impara a isolare la tubulina con resa superiore al 99% dal tessuto cerebrale suino. Questo metodo biochimico preserva la dinamica naturale della proteina per studi di neurobiologia e sviluppo di terapie mirate.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento efficiente della tubulina dal tessuto neurale

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
<li>Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+microtubule+protein+from+beef+brain+and+comparison+of+the+assembly+requirements+for+neuronal+microtubules+isolated+from+beef+and+hog%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog.</a> Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).</li>
<li>Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+and+associated+high+molecular+weight+proteins+from+porcine+brain+and+characterization+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro.</a> Ann NY Acad Sci. 253, 1 The Biology o 107-132 (1975).</li>
<li>Weisenberg, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+formation+in+vitro+in+solutions+containing+low+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations.</a> Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).</li>
<li>Roychowdhury, S., Gaskin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+assembly-competent+tubulin+from+brain+microtubule+protein+preparations+using+a+fast-performance+liquid+chromatography+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure.</a> J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).</li>
<li>Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+depolymerization+products+of+microtubules+from+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain.</a> Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).</li>
<li>Jacobs, M., Huitorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-associated+nucleoside+diphosphokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase.</a> Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).</li>
<li>Munguía, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+native+M.+vogae+and+H.+contortus+tubulin+by+TOG+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography.</a> Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+ExpPurif%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+%CE%B1-+and+%CE%B2-tubulin+from+Echinococcus+granulosus%3A+Expression%2C+purification+and+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization.</a> Parasite. 25, 62(2018).</li>
<li>Ti, S. -C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+affinity+tag-free+recombinant+tubulin+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells.</a> STAR protoc. 1 (1), 100011(2020).</li>
<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22JVisExp%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> JVisExp. (165), e61826(2020).</li>
<li>Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+tubulin+from+nonneural+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolating tubulin from nonneural sources.</a> Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).</li>
<li>Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+stability+of+posttranslationally+modified+brain+microtubules+isolated+from+cold-temperate+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish.</a> Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).</li>
<li>Fourest-Lieuvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+limited+volumes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Exp+Purif%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells.</a> Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).</li>
<li>MacRae, T. H., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+assembly+in+vitro+of+tubulin+from+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei.</a> Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).</li>
<li>Lazar, I. GelAnalyzer 19.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.gelanalyzer.com">www.gelanalyzer.com</a> (2024).</li>
<li>Jansen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+microtubule-associated+protein+2c+%28MAP2c%29+phosphorylation+and+regulatory+protein+14-3-3%CE%B6-binding+sites+reveals+key+differences+between+MAP2c+and+its+homolog+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22JBiol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau.</a> JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+microtubule+associated+proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences.</a> Biomolecules. 9 (3), E105(2019).</li>
<li>Herzog, W., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+brain+microtubule-associated+proteins%3A+Isolation+of+two+different+proteins+which+stimulate+tubulin+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro.</a> Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).</li>
<li>Castle, A. G., Crawford, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tubulin+from+pig+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of tubulin from pig platelets.</a> FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> Int J Mol Sci. 18 (10), E2207(2017).</li>
<li>Lafanechère, L., Job, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+tubulin+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">The third tubulin pool.</a> Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).</li>
<li>Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+bovine+brain+and+its+interaction+with+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides.</a> J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).</li>
<li>Mahaddalkar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigations+into+the+binding+mode+of+a+novel+noscapine+analogue%2C+9-%284-vinylphenyl%29+noscapine%2C+with+tubulin+by+biochemical+analyses+and+molecular+dynamic+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations.</a> J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+6-Aryl-2-benzoyl-pyridines+as+tubulin+polymerization+inhibitors+with+potent+antiproliferative+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties.</a> J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).</li>
<li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferulin+C+triggers+potent+PAK1+and+p21-mediated+anti-tumor+effects+in+breast+cancer+by+inhibiting+Tubulin+polymerization+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo.</a> Pharmacol Res. 152, 104605(2020).</li>
<li>Sweetnam, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor+binding+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22JNat+Prod%22%5BJournal%5D)">The role of receptor binding in drug discovery.</a> JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).</li>
<li>Qi, Z. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+1-%28benzofuran-3-yl%29-4-%283%2C4%2C5-trimethoxyphenyl%29-1H-1%2C2%2C3-triazole+derivatives+as+tubulin+polymerization+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorg Chem. 94, 103392(2020).</li>
<li>Sáez-Calvo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triazolopyrimidines+are+microtubule-stabilizing+agents+that+bind+the+vinca+inhibitor+site+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin.</a> Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).</li>
<li>Bellocq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+assembly-competent+tubulin+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EurJ+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae.</a> EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>---</td><td>---</td><td>Materiale comune</td></tr><tr><td>Provette da 10 mL</td><td>---</td><td>---</td><td>Materiale comune</td></tr><tr><td>Provette da 50 mL</td><td>---</td><td>---</td><td>Materiale comune</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore in vetro Dounce</td><td>P-LAB</td><td>H244043</td><td>omogeneizzatore</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>PENTA</td><td>70390-11001</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Bicchieri graduati</td><td>---</td><td>---</td><td>Attrezzatura comune</td></tr><tr><td>Cilindri graduati</td><td>---</td><td>---</td><td>Attrezzatura comune</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td><td>Scatola</td></tr><tr><td>izolata di altissima qualità per il trasporto di tessuti</td><td>---</td><td>---</td><td>Attrezzatura comune Frullatore</td></tr> da <tr><td>cucina</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>Recipiente in vetro o plastica</td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>---</td><td>---</td><td>Materiale comune</td></tr><tr><td>MES&nbsp;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERCK</td><td>814733&nbsp;</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>A94469</td> Colonna di fosfocellulosa <td>per ultracentrifuga</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>Colonna vuota</td></tr><tr><td>Resina di fosfocellulosa</td><td>Creative - Biomart, inc</td><td>Phosphate-001C</td><td>Resina a scambio ionico</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>PENTA</td><td>24970-31000</td><td>Grado analitico</td></tr><tr><td>Scale</td><td>------</td><td> </td><td>Attrezzatura comune</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>---</td><td>---</td><td>Attrezzatura comune</td></tr><tr><td>Cucchiai&nbsp;</td><td>---</td><td>---</td>Rotore Ti45 <td>in plastica o vetro</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>339160</td><td>Rotore per</td></tr><tr><td>pinzette per ultracentrifuga</td><td>---</td><td>---</td><td>Attrezzatura comune</td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 basic</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>Dispenser da laboratorio</td></tr><tr><td>Bagnomaria 37 &deg; C</td><td>---</td><td>---</td><td>Mescolato</td></tr></tbody></table>

ottimizzazione della resa di tubulina dal tessuto cerebrale suino

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

Durante le fasi di separazione e purificazione, sono stati prelevati campioni per l'elettroforesi SDS-PAGE e successivamente analizzati utilizzando la colorazione Coomassie-blue (Figura 2). 20 μL di ciascun campione sono stati miscelati con 10 μL di tampone campione Laemmli (188 mM Tris-HCl pH 6,8, 3% SDS (p/p), glicerolo 30% (v/v), 0,01 blu di bromofenolo (p/p), 15% β-mercaptoetanolo) e incubati a 95 °C per 15 min. 4 μL di ciascun campione sono stati caricati su gel SDS di acrilammide al 12,5% e separati sotto una corrente costante di 30 mA per gel in condizioni riducenti e denaturanti.
I risultati hanno confermato un aumento incrementale della concentrazione relativa di tubulina accompagnato da una riduzione delle proteine contaminanti. Inoltre, non c'è stata alcuna perdita significativa di tubulina nel lisato chiarificato nella prima centrifugazione (fase 3.2.7) rispetto all'omissione di questa fase (Figura 2A, B).
La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando tre metodi indipendenti: saggio BCA, saggio proteico Bradford e analisi densitometrica su gel SDS-PAGE19 (Figura 3). La resa complessiva di tubulina utilizzando la procedura descritta è stata di 123 mg di tubulina purificata da 250 g di tessuto neurale. Durante le misurazioni, è necessario tenere conto del fatto che l'elevata concentrazione di DTT nel tampone di conservazione ha un impatto significativo sul saggio BCA. Sia il tampone PEM che il tampone PBS, con l'aggiunta di DTT, aumentano l'assorbanza di fondo di circa 0,900 A595, il che riduce significativamente la capacità del saggio BCA (Figura 3A). L'effetto negativo della DTT è rilevabile anche dopo una diluizione dieci volte con acqua pura (dati non mostrati). Il test di Bradford non sembra essere influenzato dal buffer di conservazione (Figura 3B), come confermato dall'analisi densitometrica.
La purezza della preparazione di tubulina è stata verificata mediante analisi di spettrometria di massa presso due strutture indipendenti (VRI Brno, Repubblica Ceca; CEITEC MU Brno, Repubblica Ceca) utilizzando la ionizzazione elettrospray e MALDI-TOF. Entrambe le analisi hanno confermato la presenza di tubuline suine alfa e beta in diverse isoforme. La purezza complessiva è stata superiore al 97,07% (PSMs 1065), con le impurità più diffuse originate dalla cheratina di tipo II dell'Homo sapiens (PSMs 246, 2,24% delle impurezze) che sono state introdotte molto probabilmente durante l'isolamento della tubulina e la preparazione del campione per l'analisi MS/MS. Altre impurità composte da 322 PSM e solo albumina sierica, actina gamma e tripsinogeno originate da Sus scrofa sono state identificate con una risoluzione peptidica (0,0069%).
Negli esperimenti successivi, è stata verificata la conservazione della capacità di polimerizzazione dopo il congelamento rapido e lo stoccaggio in azoto liquido. L'aliquota di 10 mg/mL è stata rimossa dall'azoto liquido e scongelata lentamente con ghiaccio. Campioni di diverse concentrazioni (10 mg/mL, 8 mg/mL, 6 mg/mL, 4 mg/mL e 2 mg/mL) sono stati preparati diluendo le aliquote nel tampone PEM contenente DTT, ATP e GTP per l'esperimento di autoassemblaggio. Una serie di diluizioni è stata incubata a 37 °C per 60 minuti e la seconda è stata incubata su ghiaccio per 60 minuti. Entrambe le serie sono state centrifugate per 60 minuti a 21.000 x g e alla temperatura corrispondente (4 °C o 37 °C). 30 μL di surnatante sono stati rimossi e utilizzati per SDS-PAGE. Il surnatante rimanente è stato accuratamente rimosso utilizzando una pipetta e scartato. I pellet sono stati brevemente lavati aggiungendo 100 μM di tampone PEM, seguiti da una rimozione immediata con una pipetta. Successivamente, i pellet sono stati risospesi in 50 μL di tampone di caricamento SDS concentrato 1x in modo da preservare la concentrazione relativa di pellet e surnatante. A ciascun surnatante sono stati aggiunti 10 μL di tampone di caricamento SDS. Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando la SDS-PAGE e la colorazione Coomassie (Figura 4). Il volume di ciascun campione caricato su SDS-PAGE è stato regolato in base alla concentrazione iniziale, quindi la differenza di precipitazione dovuta alla concentrazione è più evidente. Il test di autoassemblaggio della tubulina nel tampone PEM ha confermato la capacità di formare fibre di tubulina in modo dipendente dalla temperatura.
È stato eseguito il test di assemblaggio della tubulina20,21 guidato da MAP2c che verifica la capacità della tubulina di interagire con altre proteine22. Le diluizioni seriali di MAP2c sono state preparate in cui 100 μL di aliquote di tubulina da 1 mg/mL sono stati miscelati con MAP2c alla concentrazione finale compresa tra 0 μM e 8 μM. Tutti i campioni sono stati preparati su ghiaccio diluendo in tampone PEM appena preparato con 1 mM DTT e 1 mM GTP. La tubulina è stata incubata per 15 minuti a 37 °C con diverse concentrazioni di MAP2c e centrifugata per 60 minuti a 21.000 x g e 37 °C. Il lavaggio finale del pellet è stato eseguito due volte con 100 μL di tampone PEM. L'esperimento ha confermato la capacità della tubulina preparata di subire la polimerizzazione guidata da MAP2c, poiché solo il campione senza MAP2c non formava un pellet (Figura 5).
La microscopia elettronica a trasmissione è stata ulteriormente utilizzata per confermare la presenza di filamenti di tubulina da esperimenti di co-polimerizzazione. Sospensioni di tubulina purificata precipitata con MAP2c sono state preparate per la microscopia elettronica a trasmissione mediante colorazione negativa. I campioni sono stati adsorbiti su griglie di rame rivestite di Formvar e stabilizzate al carbonio. Le griglie sono state quindi colorate negativamente con NH4MoO4 al 2% ed esaminate al microscopio elettronico con un ingrandimento di 18.000x e una tensione di accelerazione di 80 kV. La presenza di microtubuli omogenei con una chiara struttura filamentosa e dimensioni adeguate ha mostrato la capacità di formare microtubuli in conformazione nativa (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg"> Figura 1: Un diagramma schematico della separazione e della purificazione delle tubuline. Il numero tra parentesi si riferisce al passaggio del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg"> Figura 2: Separazione e purificazione della tubulina. (A) L'analisi SDS-PAGE di campioni prelevati durante la separazione della tubulina utilizzando la polimerizzazione guidata dalla temperatura (3 μL per linea). È visibile la diminuzione delle impurità con un aumento stabile dell'abbondanza relativa di tubuline (circa 50 kDa). I numeri sopra ogni riga corrispondono al numero di passaggio nel protocollo. (B) L'analisi SDS-PAGE di frazioni ottenute dopo cromatografia proteica su resina fosfo-cellulosica (4 μL per linea). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg"> Figura 3: Concentrazione proteica. La serie di diluizione dell'albumina sierica bovina fino a 1 mg/mL in tampone PEM o PBS è stata confrontata con la serie di diluizione BSA contenente 0,1 ATP, 1 mM GTP, 1 mM DTT separatamente o in combinazione (0,1 mM ATP, 1 mM GTP e 1 mM DTT) nel tampone PEM o PBS. (A) Quando è stato utilizzato il test BCA, si è verificato un cambiamento significativo nello sfondo dei campioni contenenti DTT (simboli solidi). (B) Questo effetto non è stato rilevato quando le concentrazioni sono state misurate nel saggio di Bradford. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg"> Figura 4: Saggio di autoassemblaggio della tubulina. L'analisi SDS-PAGE del saggio di autoassemblaggio ha confermato la capacità della tubulina immagazzinata incubata a (A) 4 °C o (B) 37 °C di polimerizzare in modo dipendente dalla temperatura in un ampio spettro di concentrazioni. (P - pellet, S - surnatante; la rispettiva concentrazione di tubulina è indicata sopra ogni coppia di linee; la quantità di ciascun campione caricato era di 10 μg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg"> Figura 5: Saggio di co-sedimentazione della tubulina. L'analisi SDS-PAGE dell'assemblaggio della tubulina MAP2c-assisted ha confermato la capacità della tubulina immagazzinata di subire polimerizzazione guidata dall'interazione con la proteina associata ai microtubuli in modo concentrazione-dipendente. La concentrazione molare di MAP2c è indicata sopra ogni riga. (P - pellet, S - surnatante). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg"> Figura 6: Microscopia elettronica a trasmissione. Le microfotografie TEM hanno mostrato che la tubulina si assembla (A) in microtubuli di diametro appropriato (B) costituiti da filamenti omogenei di tubulina decorati con proteine MAP2c. La barra corrisponde a 1000 nm (A) e 200 nm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Ottimizzazione della resa di tubulina dal tessuto cerebrale suino

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

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Il video dimostra l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il tumore dal cervello di un topo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica. Segue la centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere le cellule immunitarie per ulteriori analisi.

Isolamento delle cellule immunitarie infiltranti il tumore da un cervello murino

Questo video dimostra l'isolamento dei capillari dai cervelli suini freschi. Il processo prevede la rimozione delle meningi, l'isolamento della materia grigia dal tessuto cerebrale, l'omogeneizzazione e il filtraggio della materia grigia per isolare i capillari e, infine, l'utilizzo della digestione enzimatica per purificare ulteriormente i capillari.

Purificazione dei capillari da un cervello suino

Questo video mostra il processo di isolamento dei microvasi cerebrali dai ratti soppressi. Comprende la dissezione del cervello, la pulizia del tessuto e la digestione meccanica, seguita da centrifugazione ripetuta per isolare la frazione pura dei microvasi.

Un metodo per l'isolamento delle unità neurovascolari dal cervello di ratto

Sebbene la struttura dei ribosomi sia stata ampiamente caratterizzata, l'organizzazione dei polisomi è ancora poco studiata. Per ovviare a questa mancanza di conoscenza, presentiamo qui un protocollo di preparazione dettagliato per l'imaging accurato dei polisomi dei mammiferi mediante microscopia a forza atomica (AFM) in aria e liquidi.

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Vi presentiamo un protocollo per l'estrazione di murini periciti cerebrali. Basato su un'estrazione pericito orientata all'arricchimento senza antibiotici, questo protocollo è uno strumento prezioso per gli studi in vitro che forniscono un'elevata purezza e un'alta resa, diminuendo così il numero di animali sperimentali utilizzati.

Un metodo ad alta uscita per isolare i periciti cerebrali dal mouse

Questo protocollo descrive la purificazione della tubulina da fonti di piccole/medie dimensioni come cellule coltivate o cervelli di topo singolo, utilizzando cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. La tubulina purificata è arricchita in specifici isotipi o ha specifiche modifiche posttraslazionali e può essere utilizzata in saggi di ricostituzione in vitro per studiare la dinamica e le interazioni dei microtubuli.

Purificazione della tubulina con modifiche e isotipi posttraslazionali controllati da fonti limitate mediante cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

I microtubuli, che sono polimeri di tubulina, svolgono un ruolo cruciale come componente del citoscheletro nelle cellule eucariotiche e sono noti per la loro instabilità dinamica. Questo studio ha sviluppato un metodo per frazionare i microtubuli per separarli in microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera per valutare la stabilità dei microtubuli in vari tessuti di topo.

Tecnica di frazionamento quantitativo dei microtubuli per separare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti di topo

Riportiamo una tecnica che consente l'imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L'accoppiamento dell'iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l'invasione del cancro in situ .

Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra

Impara a isolare la tubulina con resa superiore al 99% dal tessuto cerebrale suino. Questo metodo biochimico preserva la dinamica naturale della proteina per studi di neurobiologia e sviluppo di terapie mirate.

Ottimizzazione della resa di tubulina dal tessuto cerebrale suino

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