Name: Comprendere limpatto dei batteriofagi temperati sui loro lisogeni attraverso la trascrittomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri l'analisi trascrittomica dei batteriofagi temperati per studiare la regolazione dell'espressione genica nei lisogeni batterici. Questo metodo ottimizza le condizioni colturali per profilare l'impatto dei profagi sui loro ospiti.

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La creazione di un ospite indicatore selezionabile, precedentemente utilizzato nei saggi di placca per quantificare in modo più accurato l'induzione spontanea del fago Stx da E. coli MC1061 37,38,39, è stata descritta qui per il fago LESΦ2 di P. aeruginosa. Questo intervento ha l'ulteriore vantaggio di ridurre le fasi e i tempi di elaborazione del campione, consentendo così la valutazione simultanea dei tassi di induzione spontanea in più condizioni di coltura. C'è il rischio di generare altre mutazioni durante la creazione di varianti resistenti alla rifampicina40; Tuttavia, in questo lavoro, il ceppo evoluto è stato utilizzato solo come ospite indicatore per l'enumerazione di placche da colture di interesse e non è stato incluso nell'analisi trascrittomica. Finché il ceppo indicatore selezionabile rimane ugualmente suscettibile all'infezione da parte del fago di interesse, non c'è preoccupazione per altre mutazioni acquisite. Ciononostante, non sono state rilevate differenze nei profili di polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione mediante l'analisi dell'elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE) di PAO1WT e PAO1RIF (dati non mostrati).
Quando si scelgono le cellule ospiti, è raro trovare un ceppo indicatore che non ospiti già profagi. Ad esempio, PAO1 ospita il profago filamentoso Pf4. I controlli sperimentali per questo studio sono stati progettati per essere in grado di esaminare direttamente l'espressione genica di fagi specifici (in questo caso, il profago LES 2) e gli effetti che questo fago ha sull'espressione genica batterica. Nel confronto dei trascritti di PAO1 portatori del profago LES 2 e mancanti del profago LES 2 (sia il lisogeno che il non lisogeno portano il Pf4 endogeno), che fungono da controlli interni per escludere l'impatto di Pf4 sull'ospite. Inoltre, è stato dimostrato che Pf4 di solito non causa lisi nella sua cellula ospite41 e non è, quindi, in grado di confondere i risultati di questi esperimenti.
È assodato che un attento controllo di qualità è fondamentale nella preparazione dei campioni per produrre dati omici significativi42. Tuttavia, come descritto in precedenza11, l'attenta caratterizzazione dell'attività dei profagi nella preparazione di colture di lisogeni per tali studi viene eseguita raramente. Qui, descriviamo in dettaglio i nostri protocolli sistematici per la preparazione di un set di colture ben controllato e ottimizzato per gli studi trascrittomici per esplorare meglio le interazioni tra batteri e fagi temperati. La sincronicità della popolazione è stata controllata sottoponendo la coltura ad almeno quattro raddoppiamenti prima di trattarla con l'antibiotico induttore norfloxacina. Determinando la MIC di norfloxacina per il ceppo nello studio, abbiamo potuto garantire che la concentrazione dell'agente induttore fosse appena al di sopra della MIC per il trattamento di "induzione". Le cellule trattate sono state quindi diluite 1:10 per abbassare la concentrazione di norfloxacina al di sotto della MIC dopo il trattamento di 1 ora al fine di consentire alle cellule di recuperare e completare il processo di replicazione dei fagi, terminando con la lisi della cellula e il rilascio della progenie fagica infettiva. Le cellule entrano nel ciclo di replicazione litica dopo lo stimolo di induzione solo una volta che la concentrazione di norfloxacina è stata portata al di sotto della MIC durante il periodo di recupero. In questo caso, superare 1 μg·mL−1 di norfloxacina significa che il farmaco non può essere efficacemente diluito al di sotto del MIC, poiché la MIC per la norfloxacina per PAO1 è di 0,19 μg·mL−1. Il livello di diluizione dell'induttore deve essere bilanciato con la necessità di recupero del lisogeno e il mantenimento della densità di coltura per la raccolta dell'RNA. I dati qui discussi dimostrano che è possibile sincronizzare le colture per creare campioni in cui domina la lisogenia, riducendo così il rumore dell'induzione spontanea e consentendo il rilevamento di veri cambiamenti guidati dalla lisogenia nell'espressione genica. Poiché lo stato lisogenico è predominante nella fase esponenziale iniziale della crescita, quando la densità cellulare batterica è bassa, suggeriamo di aumentare le colture per raccogliere abbastanza RNA per i successivi studi di espressione genica come RNA-Seq.
L'uso della norfloxacina come agente induttore per forzare le colture nel ciclo litico è ben segnalato43,44; Tuttavia, questo influenzerà anche l'espressione di altri geni batterici nel processo45,46. Per mitigare questo problema, le librerie di RNA provenienti da colture wild-type di controllo coltivate nelle stesse condizioni di induzione e non induzione dovrebbero essere incluse negli esperimenti di RNA-Seq. Anche l'uso di controlli interni e geni marcatori chiave per convalidare le fasi della replicazione dei fagi mediante qRT-PCR è fondamentale per confronti accurati. La profilazione quantitativa della RT-PCR non può essere interpretata confrontando il numero assoluto di trascritti per ciascun gene in vari punti temporali; È la forma del profilo che conta. In primo luogo, è stata campionata solo una piccola regione nel trascritto per qualsiasi gene, quindi nonsi sa se si tratti di un elemento di breve o più lunga durata. Certamente, la mappatura RNA-Seq dei trascritti mostra che la densità dei dati di mappatura varia significativamente sulla lunghezza di un gene. In secondo luogo, è la forma del profilo di espressione genica che dovrebbe essere interpretata per un gene marcatore associato al ciclo litico o allo stile di vita lisogenico o addirittura disaccoppiato dai circuiti regolatori fagici11. L'induzione spontanea è un problema reale nella coltura del lisogeno e si tradurrà sempre nell'espressione di geni associati al ciclo litico. Tuttavia, la profilazione mostra che i geni associati al ciclo di replicazione litica sono soppressi nella loro pre-induzione di espressione (almeno due pieghe logaritmiche) e post-induzione up-regolata.
Le analisi trascrittomiche condotte in precedenza sulle interazioni dei fagi Stx con E. coli supportano una comprensione approfondita dei geni fagici coinvolti nel mantenimento della lisogenia e nell'innesco del ciclo litico11,17. Attualmente, i fagi LES di P. aeruginosa sono stati annotati, ma le loro funzioni geniche chiave sono meno ben comprese. Gli studi trascrittomici consentiranno la ri-annotazione dei profagi LES e miglioreranno la nostra comprensione dei geni coinvolti nella lisogenia e nel ciclo litico. Collegare la sequenza genica alla funzione rappresenta una sfida importante nello studio di nuovi profagi, il che evidenzia ulteriormente la necessità di ulteriori studi per confermare le funzioni del gene fago per la produzione di migliori strumenti di annotazione47. L'applicazione e l'adattamento più ampi dei protocolli e delle misure di controllo della qualità aggiuntive descritte in questo articolo video potrebbero aiutare a svelare varie funzioni dei profagi e, quindi, a migliorare le pipeline di annotazione e a trasformare la nostra comprensione della biologia dei fagi e dei batteri.

Recentemente, la terapia fagica per affrontare la resistenza antimicrobica1 e l'editing genetico basato su CRISPR-Cas2 hanno generato un rinnovato interesse per la ricerca sui batteriofagi. Ancora una volta, i progressi della biotecnologia hanno permesso di studiare più a fondo le interazioni tra batteri e fagi3. Tuttavia, l'uso terapeutico dei fagi ("terapia fagica") è ostacolato dalle preoccupazioni sui fagi che agiscono come elementi genetici mobili con la capacità di trasferire orizzontalmente geni di virulenza e resistenza4. La distesa di "materia oscura"5 (geni con funzioni sconosciute) è sia preoccupante che allettante. La materia oscura è considerata una lacuna nella nostra comprensione della biologia dei fagi e una risorsa in gran parte non sfruttata per gli strumenti molecolari e le potenziali nuove terapie. Lo sviluppo di tecniche di sequenziamento ad alto rendimento, insieme a una migliore annotazione genica 7,8,9 e a nuovi algoritmi di ripiegamento peptidico10, sta migliorando il rilevamento, la descrizione e la predizione funzionale dei geni fagici. Tuttavia, la scienza è ancora lontana dal convalidare le funzioni genetiche della maggior parte dei fagi in coltura o nel mondo reale.
Il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq) è in grado di mappare globalmente l'espressione genica durante l'infezione fagica e ha migliorato significativamente la comprensione degli elementi fagici e batterici coinvolti nei cicli litici e lisogenici11,12. Durante i processi lisogenici, i genomi dei fagi temperati vengono integrati nel DNA batterico per diventare profagi13. Gli esperimenti di profilazione dell'espressione genica globale possono essere utilizzati per identificare i geni ristretti dai profagi che sono codificati sui genomi dei fagi temperati ma espressi solo durante lo stato lisogenico11. Tali geni non codificano proteine strutturali dei fagi e non sono coinvolti in alcun processo di infezione dei fagi. RNA-Seq può essere utilizzato per identificare quei geni che hanno maggiori probabilità di influenzare la biologia dell'ospite batterico, inducendo un guadagno di funzione o regolando i geni batterici esistenti, consentendo così spesso ai batteri di adattarsi ai cambiamenti ambientali. Pertanto, potrebbe essere studiata la capacità dei profagi di agire come burattinai microbici, controllando una serie di funzioni batteriche.
Ci sono due principali ostacoli all'analisi efficace dell'espressione genica limitata ai profagi. In primo luogo, la disponibilità di host suscettibili è una questione chiave. Per definizione, i profagi sono già incorporati nel loro genoma specifico dell'ospite, quindi è difficile trovare un ospite wild-type suscettibile per confrontare l'espressione genica globale in presenza e in assenza del profago. Ciò può essere ottenuto attraverso l'infezione de novo di un altro ospite suscettibile o la delezione del profago dall'isolato wild-type originale, senza interrompere il resto del genoma dell'ospite. La seconda barriera risiede nella natura eterogenea delle popolazioni lisogeniche. Alcuni profagi si degradano attraverso la mutazione o la ricombinazione per diventare "criptici", il che significa che sono fissati in una posizione specifica del genoma batterico. Tuttavia, altri profagi sono "attivi" e possono essere indotti in un ciclo litico replicativo spontaneamente o dopo l'esposizione a fattori induttori. In molte colture lisogeniche, il tasso di induzione spontanea significa che una parte delle cellule batteriche è sempre sottoposta a replicazione fagica litica14,15,16. Un alto livello di espressione dei geni fagici tardivi in queste popolazioni maschera l'espressione genica di basso livello associata all'espressione genica ristretta al lisogeno11,17. La proporzione di lisogeni sottoposti a induzione spontanea dei profagi può variare in base allo stato di crescita, alle condizioni di crescita o ad altri fattori scatenanti. Pertanto, per studiare gli impatti dei profagi sul lisosogeno, gli eventi spontanei di induzione dei profagi devono essere minimizzati il più possibile ottimizzando le condizioni di crescita per favorire lo stato lisogenico.
Questo studio riporta il lavoro preparatorio svolto per studiare l'influenza di una serie di profagi conviventi del ceppo epidemico di Liverpool (LES) di Pseudomonas aeruginosa. I profagi attivi sono stati indotti e isolati da LES e utilizzati per infettare il ceppo ospite modello di P. aeruginosa, PAO116,18,19. L'intero genoma del ceppo wild-type di P. aeruginosa, PAO1, e del suo lisosogeno, PAO1Φ2, è stato sequenziato (ad una profondità di copertura 30x) per garantire l'identità del ceppo wild-type e per confermare che il lisogeno era isogenico. Il LES è stato associato ad un aumento della morbilità e della mortalità nei pazienti con fibrosi cistica e i fagi LES 19 sono stati suggeriti per aiutare l'adattamento all'ambiente polmonare della fibrosi cistica16,19,20. Nonostante la forte evidenza che questi profagi influenzano la biologia del loro ospite20,21, la maggior parte delle loro funzioni geniche devono ancora essere caratterizzate e i meccanismi specifici di interazione sono poco compresi. Un approccio trascrittomico può scoprire empiricamente le funzioni del gene profago in un contesto ospite controllato. Poiché l'induzione spontanea può influenzare i profili di espressione, questo articolo descrive come ottimizzare le condizioni di crescita per favorire lo stato lisogenico. Tale sincronizzazione delle colture può essere convalidata mediante PCR in tempo reale per quantificare i livelli di espressione di marcatori genetici chiave associati a fasi cruciali della replicazione dei fagi LES in PAO1. Lo stesso approccio è stato utilizzato in precedenza per identificare le funzioni profagiche dei fagi tossigeni Shiga che influenzano la motilità, la resistenza agli acidi e la resistenza antimicrobica in Escherichia coli11,17,21,22.

<table><tbody><tr><td>PAO1</td><td></td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>LESB58</td><td></td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>LES fagi</td><td>Indotti e purificati da LESB58 utilizzando Norfloxacina.</td><td>Questo studio</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di lisogenesi (LB)</td><td>Merck</td><td>1.10285.500</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.500</td><td></td></tr><tr><td>Agar Agar</td><td>Fisher</td><td>A/1080/53</td><td></td></tr><tr><td>Top Agar</td><td>0,4 g Agar Agar+2,5 g LB Brodo in 100 ml di acqua; autoclave e uso.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma (Stock: 50 mg/mL in metanolo- Mescolare bene e utilizzare 0,22&micro; m filtro per sterilizzarlo e conservarlo a -20 gradi C fino all'uso)</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher 1% (v/v) in acqua</td><td>10060000</td><td></td></tr><tr><td>Norfloxacina</td><td>Sigma (Stock: 25 mg/mL di acido acetico glaciale all'1%-Mescolare bene e utilizzare 0,22&micro; m filtro per sterilizzarlo e conservarlo a -20 gradi C fino all'uso; Per evitare cicli di gelo e disgelo, conservare in piccole aliquote)</td><td>N9890</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo saturo con tampone citrato pH 4,3</td><td>Sigma</td><td>P-4682</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo di biologia molecolare</td><td>Fisher</td><td>16695992</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>12044977</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher</td><td>11398187</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher</td><td>17150576</td><td></td></tr><tr><td>H2O senza nucleasi</td><td>Invitrogen</td><td>10526945</td><td></td></tr><tr><td>10X TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA HS, BR Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q10210</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptIII kit di sintesi del primo filamento</td><td>Reagenti Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Bioline Mytaq Red 2X</td><td>BIO-25043</td><td></td></tr><tr><td>reagenti qPCR</td><td>Sensifast SYBR Hi Rox</td><td>BIO-92020</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR</td><td>Isolate II PCR e Gel Kit</td><td>BIO-52060</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione TA</td><td>Kit di clonazione TA, con vettore pCR 2.1, senza cellule competenti</td><td>K202040</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Sistema di PCR in tempo reale Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

comprendere l'impatto dei batteriofagi temperati sui loro lisogeni attraverso la trascrittomica

Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics

I fagi temperati si trovano integrati come profagi nella maggior parte dei genomi batterici. Alcuni profagi sono criptici e fissati nel cromosoma batterico, ma altri sono attivi e possono essere innescati in una forma replicativa spontaneamente o per esposizione a fattori induttori. I profagi sono comunemente associati alla capacità di conferire la produzione di tossine o altri tratti associati alla virulenza sulla loro cellula ospite. Studi più recenti hanno dimostrato che possono svolgere un ruolo molto più importante nell'alterare la fisiologia dei loro ospiti. La tecnica qui descritta ci ha permesso di studiare come i profagi influenzano l'espressione genica nel batterio opportunista Pseudomonas aeruginosa.
In questo lavoro, la crescita del ceppo wild-type PAO1 di P. aeruginosa è stata confrontata con quella dei lisogeni isogenici che trasportano diverse combinazioni di profagi dal ceppo epidemico di Liverpool (LES) LESB58. In una coltura di lisogena, una parte delle cellule batteriche supporterà la replicazione dei batteriofagi litici (induzione spontanea) con un alto livello di espressione per cellula di geni fagici tardivi, come quelli associati all'assemblaggio di particelle fagiche, mascherando così l'espressione genica di basso livello associata all'espressione genica ristretta al lisogeno. L'impatto dell'induzione spontanea può quindi oscurare l'espressione genica dei profagi in una popolazione lisogena.
Gli esperimenti di profilazione della crescita sono stati utilizzati per identificare l'induzione spontanea, che era minima durante la prima fase di crescita esponenziale. Questo studio illustra come preparare le colture campione durante la fase iniziale di crescita esponenziale e come impostare controlli adeguati nonostante il basso numero di cellule. Questi protocolli garantiscono il confronto affidabile e riproducibile di batteri wild-type e lisogeni in varie condizioni, migliorando così il profilo trascrittomico dei genomi dei profagi e aiutando nell'identificazione di funzioni profagiche precedentemente non riconosciute.

In questo lavoro, l'enumerazione temporale diretta della produzione di fagi da una coltura di lisogeno PAO1 LESΦ2 coltivata in condizioni non inducenti è stata utilizzata per determinare l'impatto dell'induzione spontanea di LESΦ2. La densità dei fagi era al suo punto più basso con una media di ~2,61 x 106 unità formanti placca (PFU)·mL−1 2 h dopo la subcoltura in terreno fresco durante la prima fase esponenziale di crescita, suggerendo che la lisogenia era lo stato dominante. Il titolo LESΦ2 è aumentato rapidamente fino a una media di ~2,4 x 108 PFU·mL−1 entro 4 ore e ha raggiunto la massima densità dopo 6 ore (media di ~5,83 x 109 PFU·mL−1; Figura 4).
Un'induzione spontanea minima è stata osservata durante la fase logaritmica iniziale della crescita del lisogeno (dopo 2 ore). Tuttavia, la presenza misurabile di fagi nel terreno di coltura era il risultato di molti eventi precedenti, tra cui i seguenti: l'impacchettamento degli acidi nucleici in teste proteiche, l'assemblaggio di proteine in particelle fagiche e l'espressione di geni fagici tardivi, geni fagici in stadio intermedio e geni fagici regolatori precoci. Era importante catturare le cellule infette prima dell'espressione degli eventi di replicazione associati ai fagi; Quindi, 90 min è stato scelto per far crescere la coltura prima dell'induzione. Per catturare il profilo di espressione genica della PAO1, i campioni di lisogeno LESΦ2 da una coltura sono stati raccolti prima e dopo l'induzione per un periodo di 90 minuti, come indicato nel punto 3.4. Questo lasso di tempo di 90 minuti è ben prima che alti livelli di induzione spontanea del profago residente vengano rilevati dal test della placca dal punto 2.3.2. Poiché la densità delle cellule batteriche era bassa durante la crescita esponenziale iniziale, i volumi di coltura sono stati scalati fino a 800 mL per garantire un ampio materiale per gli studi di espressione genica. I campioni sono stati raccolti dalla coltura non indotta e dalle colture indotte ogni 10 minuti e l'RNA è stato estratto per mappare il profilo di espressione dei marcatori chiave per la lisogenia e la replicazione litica durante la crescita batterica. L'RNA totale è stato purificato e convalidato per l'assenza di DNA genomico utilizzando saggi qPCR mirati al gene rRNA 16S (fase 6.1). I campioni che hanno raggiunto un RIN ≥ 9 hanno superato il controllo di qualità e sono stati convertiti in cDNA.
Il genoma LESΦ2 annotato è stato esaminato per identificare i geni che sono ben noti nei cicli di replicazione lisogenica e litica dei fagi temperati. Questi geni identificati sono stati poi utilizzati per convalidare la qRT-PCR per il profilo di espressione dei geni a ciclo ristretto del lisogeno e dei geni associati al ciclo litico da colture indotte e non indotte. Abbiamo quantificato il numero assoluto di copie del DNA e condotto un test di Wilcoxon signed-rank utilizzando R36 per confrontare i livelli di espressione in colture non indotte e indotte (Figura 5). È stato osservato un marcato aumento dell'espressione del gene cro (un marcatore precoce di replicazione litica) da ~ 2,31 x 109 copie in colture non indotte a ~ 3,02 x 1011 copie 30 minuti dopo l'induzione (test di Wilcoxon signed-rank: p < 0,01). Allo stesso modo, le proteine O e le proteine P, che sono marcatori di fase intermedia della replicazione litica (e si prevede che siano coinvolte nella replicazione del genoma del fago), hanno anche mostrato una significativa sovraregolazione da ~ 1,74 x 108 a ~ 1,25 x 10 10 copie (test di Wilcoxon signed-rank: p < 0,01) e da ~ 6,05 x 102 a ~ 5,68 x10 5 copie (test di Wilcoxon signed-rank: p < 0,01), rispettivamente. Infine, i geni strutturali associati alla coda sono stati utilizzati come marcatori tardivi del ciclo di replicazione litica. Ancora una volta, abbiamo osservato un aumento significativo dell'espressione da ~ 2,31 x 106 copie in colture non indotte a ~ 4,38 x 108 copie 30 minuti dopo l'induzione (test di Wilcoxon signed-rank: p < 0,01). Pertanto, i dati quantitativi della RT-PCR hanno confermato che l'espressione genica di geni marcatori ben consolidati per la replicazione litica ha seguito la tendenza prevista, con i marcatori precoci, medi e tardivi che hanno mostrato un'espressione differenziale multipla nell'ordine previsto (Figura 5). Poiché l'espressione dei marcatori per la replicazione litica è stata sovraregolata 30 minuti dopo il recupero, questo è considerato un punto temporale rappresentativo appropriato per lo studio del panorama trascrittomico dei fagi temperati attivi e dei loro ospiti batterici durante il ciclo litico.
Abbiamo osservato una certa espressione di geni litici in condizioni non indotte, confermando che si verifica sempre una certa induzione spontanea, anche in colture ottimizzate in cui i numeri di lisogeni sono rappresentati con il più alto rapporto tra CFU e PFU rilasciata nella fase logaritmica iniziale. Ciò significa che ci sarà sempre un certo livello di "rumore" nei dati di trascrittomica, il che rafforza l'importanza di controlli accuratamente preparati, comprese le colture indotte e non indotte. La scelta appropriata dei geni di controllo interno per determinare i cambiamenti di espressione si basa sull'attento esame dei dati trascrittomici per identificare i geni che sono espressi allo stesso livello sia nei campioni non indotti che in quelli indotti. I nostri risultati preliminari suggeriscono che rpoD era il gene di controllo più affidabile testato e aveva l'espressione più stabile (~1,71 x 10 5 copie prima dell'induzione e ~3,33 x 105 copie 30 minuti dopo l'induzione; Test di Wilcoxon con segno: p = 0,3594) rispetto ai geni 16S rRNA o proC (Figura 5). La variabilità dell'espressione dei controlli interni ha portato alla misurazione del numero assoluto di trascrizioni. L'esame futuro dei dati trascrittomici supporterà la scelta di appropriati controlli interni per un'ulteriore convalida.
Il gene cI è stato utilizzato nel nostro esercizio di profilazione genica, in quanto è un marcatore ben noto di lisogenia. Rispetto ai marcatori per la replicazione litica, l'espressione del gene cI era relativamente stabile (Figura 5), ma il numero di copie di questo gene era rassicurante nelle colture non indotte rispetto a quelle dei marcatori per la replicazione litica. Questi dati sono in accordo con i bassi numeri di PFU negli stessi campioni, confermando così che un'elevata espressione del repressore era associata a livelli più bassi di produzione di fagi. I dati qui riportati dimostrano che l'espressione del trascritto cI per questo particolare fago non è significativamente sottoregolata dopo l'induzione, come si vede nei fagi Stx11,17. L'attività del repressore è normalmente controllata sia a livello trascrizionale che post-traduzionale, quindi il gene repressore può essere trascritto, ma la proteina risultante è immediatamente soggetta ad autoclivaggio. Sono necessarie ulteriori sperimentazioni per convalidare i controlli trascrizionali e post-traduzionali. Inoltre, dalla nostra curva standard, il limite minimo di rilevamento della qPCR sembra essere ~102 copie.
Insieme, i nostri risultati dei saggi di placca e qRT-PCR convalidano la nostra strategia per la coltura e la preparazione del campione di RNA per generare un input ben controllato per gli esperimenti di RNA-Seq. Le colture non indotte nella fase esponenziale precoce hanno mostrato bassi livelli di induzione spontanea e di espressione genica litica, suggerendo la dominanza della lisogenia. Al contrario, le colture isolate 30 minuti dopo l'induzione hanno mostrato aumenti significativi nell'espressione dei geni marcatori che indicano la dominanza della replicazione litica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig01.jpg"> Figura 1: Il protocollo per la creazione dell'host indicatore resistente alla rifampicina (creato con BioRender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig02.jpg"> Figura 2: Il disegno sperimentale per l'enumerazione della PFU e della CFU di un lisogeno dello stesso campione. (Creato con BioRender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig03.jpg"> Figura 3: Il disegno sperimentale per il campionamento di colture indotte e non indotte per l'isolamento dell'RNA. (Creato con BioRender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig04.jpg"> Figura 4: Enumerazione temporale dell'induzione spontanea. Enumerazione temporale della produzione spontanea di profago LES utilizzando la PFU del lisogeno PAO1 Φ2 con la CFU concomitante, n = 8 (due repliche biologiche e quattro repliche tecniche); Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. I punti rosso scuro indicano CFU·mL−1 in LB; i punti blu scuro indicano PFU·mL−1 in LB. Il rilascio spontaneo del fago infettivo φ2 da parte dei lisogeni è al livello più basso misurabile a 2 ore dopo l'inoculazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig05.jpg"> Figura 5: Numero assoluto di copie dei geni marcatori bersaglio. Il numero assoluto di copie dei geni marcatori fagici conferma i modelli di espressione previsti, derivati utilizzando la RT-qPCR, di geni che dovrebbero svolgere ruoli importanti nella lisogenia e nei cicli litici. I punti rappresentano sia tre repliche biologiche che tre repliche tecniche (n = 9). (A) Il riquadro rosso rappresenta il marcatore di lisogenia, cI; (B) il verde rappresenta il marcatore litico precoce, cro; (C,D) il blu rappresenta i marcatori litici medi, i geni di replicazione del DNA; (E) il magenta rappresenta il marcatore litico tardivo, i geni strutturali della coda; (F-H) il grigio rappresenta i marcatori dell'ospite che sono stati utilizzati come controlli interni e (I) il bianco rappresenta la DNA girasi B, che è stata utilizzata come controllo di induzione. Le linee orizzontali continue mostrano la mediana della distribuzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Primer progettati in questo studio. Vengono fornite le sequenze di primer specifici per i geni marcatori e i controlli interni utilizzati in questo studio, insieme ai corrispondenti ID di accesso all'NCBI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Efficienza dei primer utilizzati in questo studio calcolata utilizzando la curva standard qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Questo protocollo consente di rivelare l'impatto dei profagi sui loro ospiti. Le colture batteriche sono sincronizzate utilizzando le condizioni che meglio supportano lo stato lisogenico, limitando l'induzione spontanea. La RT-qPCR distingue inequivocabilmente i geni ristretti dai profagi e quelli disaccoppiati dal controllo fagico da quelli espressi durante il ciclo di replicazione litica.

Comprendere l'impatto dei batteriofagi temperati sui loro lisogeni attraverso la trascrittomica

Temperate phages are found integrated as prophages in the majority of bacterial genomes. Some prophages are cryptic and fixed in the bacterial chromosome, ...

I profagi sono fagi batterici, che si sono integrati nei genomi batterici. Stiamo utilizzando un approccio trascrittomico per esplorare in modo completo l'impatto dei profagi sulla biologia dei loro ospiti batterici. I metodi qui descritti affrontano la sfida chiave dell'induzione spontanea del ciclo litico profago.Un'attenta ottimizzazione delle condizioni di coltura consente una profilazione pulita dell'espressione genica durante lo stato profago. I profagi si trovano nella maggior parte dei patogeni batterici, ma il significato di solito non è compreso. Questi strumenti possono illuminare il ruolo dei profagi come regolatori di molteplici funzioni batteriche.Ci sono relazioni quasi illimitate con l'ospite del profago che rimangono non studiate. Ciò rappresenta un'enorme risorsa non sfruttata di potenziali bersagli terapeutici che questi protocolli possono aiutare a prevedere. La sfida principale è trovare la giusta condizione di coltura per bilanciare la crescita del lisogeno e l'induzione spontanea dei profagi.La sfida secondaria ben nota, lyson, è il mantenimento dell'integrità dell'RNA per gli studi a valle. Per iniziare, preparare nuove colture di lisogeni e indicatori dell'ospite inoculando le colture notturne in 100 millilitri di LB in un rapporto di uno a 100. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 RPM.Per monitorare la crescita del lisogeno, raccogliere un campione di un millilitro ogni ora dal punto di inoculazione per otto ore. In serie, diluire la coltura aggiungendo 100 microlitri in 900 microlitri del terreno LV. Vorticare alla massima velocità e continuare la serie di diluizione da 10 a meno uno a 10 a meno nove.Versare 10 microlitri della diluizione richiesta su una piastra a coclea LB. Lasciare asciugare e incubare a 30 gradi Celsius per 18-24 ore. Dopo l'incubazione, contare il numero di colonie e calcolare il numero di cellule batteriche vitali utilizzando la formula data.Successivamente, per enumerare le particelle fagiche infettive nel campione temporale, aggiungere 100 microlitri di cellule ospiti dell'indicatore resistente alla rifampicina in fase logaritmica alla coclea superiore fusa, insieme alla rifampicina. Individuare 10 microlitri di coltura lisogena diluita in serie sullo strato superiore della coclea inoculata. Lasciato asciugare e incubare a 37 gradi Celsius per 18-24 ore.Dopo l'incubazione, contare il numero di placche e calcolare le particelle fagiche infettive utilizzando la formula fornita. Etichettare il primo matraccio come non indotto e gli altri come indotti, insieme ai punti temporali in cui ciascun campione deve essere raccolto. Quindi sottocoltura le colture lisogeniche cresciute durante la notte in 80 millilitri di LB con un rapporto di uno a 100 in otto fiasche da 250 millilitri.Incubare i palloni a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 giri/min. Dopo 90 minuti, quando la densità ottica a 600 nanometri è compresa tra 0,1 e 0,2, aggiungere quattro microlitri di acido acetico glaciale all'1% nel pallone non indotto. Aggiungere la coltura da 80 millilitri dal pallone non indotto a 720 millilitri di LB e aggiungere immediatamente 160 millilitri di soluzione di arresto prima di posizionare il pallone su ghiaccio per 30 minuti per stabilizzare i trascritti dell'RNA.Successivamente, aggiungere norfloxacina a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro al matraccio marcato indotto contenente 80 millilitri di coltura. Mescolare bene e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 RPM per un'ora. Lasciare che le cellule si riprendano aggiungendo 80 millilitri di coltura indotta a 720 millilitri di LB. Prelevare le cellule batteriche da ciascun pallone ogni 10 minuti da zero a un'ora aggiungendo una soluzione di arresto.Centrifugare a 10.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Prima di risospendere delicatamente il pellet nel liquido residuo utilizzando la pipetta automatica regolabile. Trasferire la sospensione in una microprovetta da centrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 13.000 G per un minuto a quattro gradi Celsius.Scartare il surnatante residuo e sigillare il tubo del microfugo, prima di congelare i pellet in azoto liquido. Aggiungere un millilitro di Trizol a ciascun pellet congelato e omogeneizzare la sospensione mediante pipettaggio. Dopo aver identificato una serie di geni bersaglio che possono fungere da marcatori per ogni fase di replicazione del fago di interesse, amplificare ciascuno dei geni bersaglio dal DNA genomico utilizzando primer pertinenti.Eseguire la PCR utilizzando le condizioni di amplificazione descritte nel manoscritto del testo. Dopo la PCR, utilizzando un kit di purificazione PCR, purificare ogni amplicone e clonarlo in un vettore di clonazione TA secondo le istruzioni del produttore. Verificare la sequenza di ciascun prodotto clonato mediante sequenziamento Sanger.Dopo aver calcolato il numero di copie di quattro singoli plasmidi, preparare un modello standard per ciascun gene marcatore diluendo in serie il DNA plasmidico in acqua priva di nucleasi. Aggiungere un microlitro di CDNA e i rispettivi standard plasmidici per ciascun target in una piastra a 96 pozzetti. Ed eseguire la PCR quantitativa secondo le istruzioni del produttore.Dopo la PCR, utilizzare il programma Excel per tracciare il numero di copie di DNA logaritmico rispetto alla soglia del ciclo. Eseguire un calcolo di regressione lineare per visualizzare il coefficiente di determinazione e un'equazione lineare. Successivamente, stimare il numero di copie per ogni destinazione utilizzando l'equazione lineare derivata dalla regressione lineare.Quindi calcolare l'efficacia dell'amplificazione PCR utilizzando i parametri della regressione lineare della curva standard e l'equazione data. Dopo aver convalidato i primer in termini di efficienza percentuale, calcolare il numero assoluto di copie del DNA. L'enumerazione temporale della produzione spontanea di meno profagi ha suggerito i numeri più bassi di PFU per cellula a due ore e i numeri più alti di PFU per cellula a sei ore.Il lisogeno era allora più stabile a due ore. Quindi questa condizione è stata utilizzata per la profilazione QRTPCR. È stato osservato un marcato aumento dell'espressione del gene cro, un marcatore precoce di replicazione litica da 2,31 volte 10 alla nona copia in colture non indotte a 3,02 volte 10 all'undicesima copia 30 minuti dopo l'induzione.Allo stesso modo, anche le proteine P e O, il marcatore di fase intermedia della replicazione litica, hanno mostrato una significativa sovraregolazione da 1,74 volte 10 all'ottava a 1,25 volte 10 alla decima copia e da 6,05 volte 10 alla seconda a 5,68 volte 10 alla quinta copia. Il marcatore tardivo del ciclo di replicazione litica ha mostrato un notevole aumento dell'espressione nelle colture non indotte a 30 minuti dopo l'induzione. Tra i controlli interni testati, RPOD ha avuto l'espressione più stabile rispetto a 16 geni SRNA o ProC.Rispetto ai marcatori per la replicazione litica, l'espressione del gene C-one era relativamente stabile. Tuttavia, il numero di copie del gene C-one era rassicurante nelle colture non indotte, rispetto ai marcatori per la replicazione litica. Nessun buon dato o interpretazione può provenire da una libreria di RNA mal preparata.Il controllo dell'induzione spontanea e l'integrità dell'RNA sono le cose più importanti. La dinamica temporale di qualsiasi gene può essere studiata utilizzando il profilo di espressione. Adattare le giuste condizioni sperimentali e i giusti punti temporali è importante per mappare correttamente le risposte biologiche a qualsiasi stimolo.Questa tecnica ha identificato interazioni precedentemente sconosciute tra due distinte partnership di ospiti dei profagi. Poiché la maggior parte dei batteri ospita profagi non studiati, questo approccio potrebbe aiutare a scoprire molti nuovi bersagli terapeutici o applicazioni.

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