Trombosi arteriosa indotta da cloruro ferrico e raccolta di campioni per l'analisi al microscopio elettronico 3D
17 marzo 2023
Il presente protocollo descrive come utilizzare una lesione mediata da FeCl3 per indurre trombosi arteriosa e come raccogliere e preparare campioni di lesioni arteriose nelle varie fasi della trombosi per l'analisi al microscopio elettronico.
Con questo metodo, è possibile determinare quali componenti delle piastrine e del sistema emostatico sono importanti per la trombosi. Inoltre, questo metodo può determinare come la crescita e l'architettura dei trombi sono influenzate a livello cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un modo riproducibile per studiare molte fasi della trombosi a livello strutturale.
Una persona nuova a questa tecnica dovrebbe evitare di manipolare eccessivamente il tessuto nell'area chirurgica. Questo può portare a sanguinamento e può complicare eccessivamente l'identificazione dell'arteria carotide. Iniziare a contrassegnare il sito della lesione dopo aver esposto l'arteria carotide circondando liberamente la regione tra due fili chirurgici con una dimensione di 0,1 millimetri.
Posizionare la sonda sotto l'arteria distale dal filo inferiore. Inserire il pezzo di plastica sotto l'arteria tra i due fili per contrassegnare il sito per lesioni da cloruro di ferro. Effettuare misurazioni del flusso prima di eseguire lesioni per annotare il flusso basale.
Eseguire la lesione posizionando carta da filtro imbevuta di cloruro di ferro sull'arteria per tre minuti. Rimuovere la carta da filtro dopo tre minuti per evitare l'entità variabile della lesione e per facilitare il conteggio del flusso da parte della sonda. Aggiungere soluzione salina nel sito della lesione per rimuovere qualsiasi eccesso di cloruro di ferro residuo.
Monitorare la lettura del flusso. Quando il flusso scende al di sotto del 50% del valore iniziale, rimuovere la sonda. Asciugare rapidamente l'area e aggiungere il fissativo per fissare l'area della lesione esternamente.
Quindi, tenere prontamente l'arteria vicino all'area della lesione con una pinza. Tagliare a valle della filettatura inferiore e a monte della filettatura superiore. Metti il tessuto sul piatto di coltura di tessuto di plastica nello stesso orientamento in cui è stato raccolto e aggiungi alcune gocce del fissativo.
Usando un bisturi, pulire il tessuto extra intorno all'arteria. Assicurarsi di registrare l'orientamento del flusso sanguigno tagliando un'estremità orizzontalmente e l'altra affusolata o obliqua. Posizionare il campione in fissativo per un'ora a temperatura ambiente, quindi conservare il campione in paraformaldeide all'1% a 4 gradi Celsius fino a quando non lo invia nel ghiaccio umido per l'analisi al microscopio elettronico.
I dati sono stati tracciati come una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier, un dot plot con barre che mostrano il flusso sanguigno terminale al momento della cessazione del flusso sanguigno o della fine di un esperimento, o come un grafico a linee. Il flusso sanguigno è aumentato improvvisamente in alcuni casi a seguito di una diminuzione graduale per alcuni minuti che indica lo spargimento parziale del trombo in crescita ed è stato considerato un evento di embolizzazione. Anche la morfologia occlusiva dei trombo è stata studiata con questo metodo.
La raccolta tempestiva del campione durante il processo di trombosi è il passo più importante poiché il ritardo in questo processo può portare a un'interpretazione errata della nostra analisi strutturale.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo mediato da FeCl3 per indurre trombosi arteriosa e raccogliere campioni da analizzare mediante microscopia elettronica. Consente ai ricercatori di studiare gli aspetti strutturali della crescita del trombo e della sua architettura in diverse fasi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Trombosi
- Emostasi
Sfondo
- Comprendere la trombosi è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti per le malattie cardiovascolari.
- I componenti delle piastrine e del sistema emostatico svolgono ruoli significativi nella formazione del trombo.
- La microscopia elettronica fornisce dettagliate informazioni strutturali sullo sviluppo del trombo.
- La riproducibilità nei metodi sperimentali è essenziale per ottenere risultati affidabili.
Scopo dello studio
- Identificare i componenti chiave coinvolti nella trombosi.
- Analizzare come la crescita del trombo è influenzata a livello cellulare.
- Stabilire un metodo riproducibile per lo studio delle fasi della trombosi.
Metodi Utilizzati
- Induzione di lesioni arteriose mediante FeCl3.
- Raccolta dei campioni in diverse fasi della trombosi.
- Preparazione dei campioni per la microscopia elettronica.
- Manipolazione accurata del tessuto per evitare complicazioni.
Risultati principali
- Identificazione dei cambiamenti strutturali nel trombo nel tempo.
- Informazioni sui meccanismi cellulari che guidano la formazione del trombo.
- Stesura di un protocollo affidabile per studi futuri.
- Raccomandazioni per ridurre al minimo la manipolazione dei tessuti durante le procedure.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un quadro riproducibile per lo studio della trombosi.
- La microscopia elettronica rivela dettagli fondamentali riguardo all'architettura del trombo.
- Ulteriori ricerche possono basarsi su questi risultati per approfondire la comprensione della trombosi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il modello di trombosi arteriosa indotta da FeCl3 fornisce una piattaforma riproducibile e quantitativa per analizzare i meccanismi molecolari e strutturali della formazione del trombo in vivo. Questo approccio consente una validazione affidabile dei bersagli e una riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci antitrombotici e antiaggreganti. La sua integrazione con la microscopia elettronica 3D supporta una continuità traslazionale dalla fase iniziale della scoperta fino alla valutazione preclinica di interventi vascolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi del contributo delle piastrine e delle vie della coagulazione alla trombosi in un contesto in vivo controllato.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica rivelando come perturbazioni genetiche o farmacologiche alterino l'architettura del trombo.
- Facilita la validazione funzionale degli obiettivi per agenti antitrombotici in fase di valutazione.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un saggio standardizzato e quantitativo per valutare la risposta al danno vascolare e la formazione di coaguli.
- Fornisce endpoint riproducibili come riduzione del flusso ematico ed eventi di embolizzazione per lo screening di composti.
- Genera campioni adatti all'analisi ultrastrutturale, supportando lo sviluppo di saggi successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la patologia della trombosi arteriosa, favorendo l'esplorazione traslazionale di biomarcatori.
- Consente un percorso continuo dalla scoperta dei meccanismi alla valutazione preclinica dell'efficacia e della sicurezza di strategie antitrombotiche.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, fornendo letture quantitative e strutturali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la validazione preclinica, permettendo test basati su ipotesi sui meccanismi della trombosi e sulle interazioni terapeutiche.
- Biologia della scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla riguardo al ruolo delle piastrine e dei fattori della coagulazione nella formazione del trombo.
- Screening: Fornisce metriche quantitative sul flusso sanguigno e sull'embolizzazione per la valutazione di composti.
- Analisi: Permette il confronto statistico della cinetica e della morfologia della formazione del trombo tra diversi gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vivo a endpoint clinici rilevanti per le malattie cardiovascolari.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma validata e scalabile per studi meccanicistici e farmacologici ripetuti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella comprensione meccanicistica della trombosi.
- Valore operativo: Standardizza il danno vascolare e il prelievo dei campioni per ottenere dati riproducibili e di alta qualità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione per i candidati antitrombotici fornendo solide evidenze in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione degli asset mirati alle vie trombotiche in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in tecniche microchirurgiche e modellizzazione di lesioni vascolari.
- Necessita di accesso a strumentazione per la misurazione del flusso e infrastrutture per microscopia elettronica.
- Esige una rigorosa standardizzazione dell'induzione delle lesioni e della manipolazione dei campioni per garantire la riproducibilità.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi distretti vascolari o modelli di specie.
- La raccolta rapida dei campioni è fondamentale per evitare artefatti nell'analisi ultrastrutturale.
