Name: Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri la metodologia per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei per studiare la biologia della malaria. Questo protocollo aiuta i ricercatori a sviluppare nuovi strumenti contro l'infezione.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health AI168307 a SPK.  Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso UGA CTEGD e il nucleo di microscopia UGA CTEGD. Riconosciamo anche i contributi di Ash Pathak, Anne Elliot e dello staff di UGA Sporocore nell'ottimizzazione del protocollo. Vogliamo ringraziare il Dr. Daichi Kamiyama per le preziose intuizioni, la discussione e i plasmidi genitori contenenti GFP11 e GFP 1-10. Vorremmo anche ringraziare i membri del laboratorio Kurup per il loro costante supporto, pazienza e incoraggiamento.

Tutte le ricerche che hanno coinvolto animali vertebrati nel nostro laboratorio sono state eseguite in conformità con le linee guida e i protocolli per l'uso degli animali dell'Università della Georgia.
1. Generazione di topi infetti da P. berghei
<ol><li>Avviare l'infezione allo stadio ematico in topi C57BL/6 (B6) maschi o femmine di 6-8 settimane utilizzando parassiti selvatici di P. berghei. Per fare ciò, trasferire sangue crioconservato infetto da P. berghei (2 x 105 globuli rossi infetti), ricostituito in 400 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), in uno o due topi donatori intraperitoneali (i.p.).</li>
	<li>Trasferire il sangue fresco raccolto attraverso il sanguinamento retro-orbitale dai topi donatori a 5 giorni dopo l'infezione (d.p.i.) in due topi B6 naïve. Per fare ciò, raccogliere 200 μL di sangue, ricostituire con 300 μL di PBS e iniettare 200 μL i.p. nei topi riceventi. Assicurarsi che la parassitemia nei donatori in questo momento sia del 2%-5%19,20.</li>
	<li>Monitorare la parassitemia come descritto in precedenza19,20, a partire da 2 d.p.i. nei riceventi. Quando la parassitemia varia dal 3% al 5% (circa 5 d.p.i.), sopprimere i topi riceventi e poi raccogliere il sangue attraverso la puntura cardiaca o il sanguinamento retro-orbitale. Sopprimere i topi usando l'inalazione di anidride carbonica seguita da lussazione cervicale, o secondo le linee guida istituzionali. NOTA: Una volta che la parassitemia supera il 5%, l'efficienza di trasfezione può essere ridotta a causa dell'aumento della prevalenza di globuli rossi infetti multipli.</li>
</ol>2. Generazione di schizonti nella cultura
<ol><li>Raccogliere il sangue dei topi infetti nella fase 1.3 (circa 2 mL in totale da due topi) in 5 mL di soluzione di Alsever (vedere Tabella dei materiali) in un ambiente sterile. Eseguire i passaggi da 2.1 a 3.12 in condizioni sterili. NOTA: Le condizioni sterili includono l'uso di guanti, la pulizia di guanti e superfici con etanolo al 70%, l'utilizzo di materiali di consumo e materiali sterili e il lavoro all'interno di un armadio di biosicurezza.</li>
	<li>Centrifugare il sangue per 8 minuti a 450 x g a temperatura ambiente (RT). Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno RPMI completo (RPMI 1640 con il 20% di siero fetale bovino [FBS] e l'1% di penicillina-streptomicina, v/v).</li>
	<li>Centrifugare per 8 minuti a 450 x g a RT. Risospendere il pellet in 25 mL di terreno RPMI completo e trasferirlo in un matraccio di coltura T75 con tappo filtrante.</li>
	<li>Porre in un incubatore a 36,5 °C e 5% di CO2 , agitando delicatamente per mantenere le cellule in sospensione per 16 ore.</li>
	<li>Al punto di tempo di 16 ore, controlla lo sviluppo di schizont. A tale scopo, raccogliere 500 μL del campione, centrifugare a 450 x g per 8 minuti, risospendere il pellet in 10 μL di terreno RPMI completo e preparare uno striscio di sangue sottile. Colorare lo striscio di sangue con la colorante di Giemsa19 (vedere la tabella dei materiali) e determinare la frequenza degli schizonti (Figura 1).</li>
	<li>Per un'efficienza di trasfezione ottimale, il 60%-70% dei parassiti dovrebbe essere allo stadio di schizont. Se viene determinato un numero inferiore a questa soglia, continuare la coltura come nel passaggio 2.4 e controllare ogni ora per assicurarsi che la soglia di cui sopra venga superata prima di procedere.</li>
</ol>3. Trasfezione di Plasmodium schizonts
<ol><li>Preparare un tampone di centrifugazione a gradiente ricostituendo 13 mL di terreno di prova a gradiente di densità (vedere Tabella dei materiali) con 1,44 mL di NaCl da 1,5 M e 5,6 mL di NaCl 0,15 M in una provetta da centrifugazione da 50 mL.</li>
	<li>Trasferire 25 mL di emocoltura in una nuova provetta da centrifugazione da 50 mL. Stratificare con cura 20 mL di tampone di centrifugazione a gradiente sul fondo della provetta di centrifugazione utilizzando una pipetta di vetro stretta per creare una colonna a gradiente. Fare attenzione a non disturbare gli strati e le interfacce del liquido e garantire una chiara divisione tra il tampone e il fluido.</li>
	<li>Centrifugare per 20 minuti a 450 x g senza freno a RT. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere con cautela lo strato di schizont15 situato all'interfaccia tra il terreno di coltura e il tampone di centrifugazione a gradiente e inserirlo in una nuova provetta di centrifugazione da 50 mL.</li>
	<li>Risospendere gli schizonti isolati in un terreno RPMI completo e portare il volume totale a 40 mL. Centrifugare a 450 x g per 8 minuti a RT ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere gli schizonti in 10 mL di terreno RPMI completo. Quindi, trasferire 1 mL di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per ogni trasfezione e centrifugare a 16.000 x g per 5 s per pellettare i globuli rossi infetti. I globuli rossi infetti derivati da due topi nel modo sopra descritto possono essere utilizzati per un massimo di 10 trasfezioni separate.</li>
	<li>Combinare 100 μL di tampone per elettroporazione (soluzione nucleofettrice dal kit di elettroporazione; vedere Tabella dei materiali) a RT con 5 μg di DNA plasmidico bersaglio circolare o linearizzato (fino a un volume massimo di 10 μL), a seconda dei casi per ciascuna trasfezione in provette separate per microcentrifuga da 1,5 mL. Un campione "senza plasmide" deve essere incluso come controllo per la trasfezione e la selezione degli antibiotici.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione dal punto 3.5 e risospendere con cautela i globuli rossi infetti nella soluzione nucleofettrice preparata + DNA plasmidico (dal passaggio 3.6).</li>
	<li>Trasferire la sospensione (soluzione nucleofettore + plasmide + schizonti; massimo 110 μL) in cuvette per elettroporazione. Trasfettare utilizzando un programma nucleofettore adatto (U-033, vedi Tabella dei materiali). NOTA: Assicurarsi che i passaggi da 3.8 a 3.10 vengano eseguiti a RT.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di terreno RPMI completo alla cuvetta e trasferire l'intera soluzione (ora 200 μL di volume totale) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e mantenere a RT.</li>
	<li>Iniettare la soluzione da 200 μL di parassiti trasfettati nei topi per via endovenosa (e.v.), lavorando per ridurre al minimo il tempo tra la trasfezione e l'iniezione finale nei topi. NOTA: Gli schizonti trasfettati vengono iniettati nei topi meno di 5 minuti dopo l'elettroporazione per massimizzare l'efficienza del protocollo.</li>
</ol>4. Selezione dei parassiti trasfettati
<ol><li>Controllare i livelli di parassitemia nei topi inoculati con gli schizonti trasfettati giornalmente a partire da 2 d.p.i. per verificare l'infezione.</li>
	<li>Una volta verificata l'infezione, iniziare la selezione del farmaco utilizzando la somministrazione orale del farmaco in acqua potabile, offerta ad libitum. NOTA: La pirimetamina è stata impiegata come marcatore farmacologico selezionabile per il plasmide. In questo caso, 17,5 mg di pirimetamina sono stati aggiunti a 250 mL di acqua pulita (concentrazione finale di 70 mg/L). Inoltre, 10 g di zucchero sono stati aggiunti a quest'acqua per incoraggiare un adeguato consumo dell'acqua contenente pirimetamina da parte dei topi.</li>
	<li>Monitorare la parassitemia ogni due giorni utilizzando strisci di sangue realizzati con 5 μl di sangue, a partire da 6 giorni dopo l'inizio del trattamento con pirimetamina. La mancanza di parassiti rilevabili dopo 15 giorni indica una trasfezione fallita; In questo caso, riavviare il processo dal passaggio 1.1 per un nuovo tentativo.</li>
	<li>Quando la parassitemia raggiunge almeno l'1%, trasferire i parassiti a topi B6 naïve per la creazione di ceppi di parassiti allo stadio ematico. Continuare la selezione nei topi appena infettati fino a quando la parassitemia non raggiunge il 2%-5%, a quel punto generare scorte e crioconservarle21.</li>
</ol>5. Infezione delle zanzare con le linee transgeniche
<ol><li>Infettare topi B6 con 200 μL di sangue contenente i parassiti selezionati (2 x 105 globuli rossi infetti/topo, e.v.). Determinare la parassitemia in questi topi il giorno dell'alimentazione e dell'infezione da zanzare. La parassitemia tra il 2% e il 5% è ottimale per l'infezione delle zanzare. Una volta verificata, trasferire immediatamente l'infezione alle zanzare femmine di zanzara Anopheles stephensi secondo i passaggi 5.2-5.4). NOTA: Le incubatrici contenenti zanzare per l'infezione devono essere mantenute a 20.5 °C, all'80% di umidità e con un ciclo luce/buio di 12 ore (luci accese tra le 07:00 e le 19:00).</li>
	<li>Il giorno prima dell'infezione da zanzare, separare le zanzare femmine posizionando una fonte di calore sopra la gabbia contenente zanzare sia maschi che femmine, come una sottile vescica di plastica o un guanto riempito con acqua riscaldata a 37 °C. Rimuovere le zanzare femmine, che sono attratte dalla fonte di calore, utilizzando un aspiratore per insetti e trasferirle in una gabbia separata e più piccola per l'infezione. NOTA: Le zanzare maschi possono essere distinte dalle zanzare femmine per le loro dimensioni corporee leggermente ridotte e le antenne piumose.</li>
	<li>Iniettare ai topi infetti un anestetico generale (ad es. tribromoetanolo al 2%/avertina). Garantire un'anestesia completa pizzicando saldamente il cuscinetto del piede di ciascun mouse. Se non reagiscono, sono sufficientemente sedati e pronti a trasferire l'infezione nelle zanzare.</li>
	<li>Posizionare i topi anestetizzati sopra le zanzare femmine in gabbia (dal punto 5.2) sotto il decubito sternale. Allargare manualmente le zampe anteriori e posteriori per fornire la massima superficie per l'alimentazione delle zanzare. Lasciare i topi infetti sopra ogni gabbia per un totale di 15 minuti, controllando ogni 5 minuti per assicurarsi che i topi non siano svegli. Una volta completata l'alimentazione, sopprimere i topi utilizzando la lussazione cervicale, o secondo il protocollo istituzionale per l'uso degli animali, e smaltirli in modo sicuro.</li>
</ol>6. Raccolta di sporozoiti
<ol><li>Controllare l'intestino medio della zanzara per le oocisti a circa 10 d.p.i. per verificare l'avvenuta infezione e lo sviluppo di Plasmodium all'interno delle zanzare. Isolare l'intestino medio della zanzara dall'addome rimuovendo il segmento addominale terminale utilizzando una pinza. Visualizzare l'intestino medio sotto la luce polarizzata per la presenza di oocisti22.</li>
	<li>Si prevede che gli sporozoiti selvatici siano presenti nelle ghiandole salivari delle zanzare 18-21 giorni dopo essersi nutriti di topi infetti. Al 18° giorno, sezionare 5-10 zanzare per valutare il numero di sporozoiti. NOTA: Le zanzare vengono lavate e uccise nell'etanolo. Successivamente, le zanzare morte vengono lavate due volte con PBS per rimuovere i detriti prima della dissezione.</li>
	<li>Per isolare e contare gli sporozoiti, rimuovere con cautela la testa della zanzara esercitando una pressione sul torace della zanzara utilizzando una pinza o un ago da dissezione fine. Le ghiandole salivari rimangono attaccate alla testa rimossa (Figura 2).</li>
	<li>Rimuovere eventuali ulteriori detriti di zanzare dalle ghiandole salivari e metterli in una provetta per microcentrifuga contenente 400 μL di terreno di dissezione delle zanzare (terreno Ealge modificato di Dulbecco [DMEM] con l'1% di siero di topo, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina; vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Distruggere le ghiandole salivari isolate passando attraverso una siringa con ago da 30 G 15-20 volte. Mettere 10 μL delle ghiandole salivari interrotte nei terreni di dissezione delle zanzare in un emocitometro e contare. Risospendere nella concentrazione desiderata di terreno di dissezione delle zanzare o PBS per l'iniezione nei topi, l'inoculazione in colture cellulari o la crioconservazione a lungo termine23,24.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Abbiamo utilizzato il protocollo di cui sopra nel nostro laboratorio per creare diverse linee di parassiti transgenici P. berghei. Sebbene ottimizzato per P. berghei, abbiamo anche utilizzato con successo questo protocollo per generare sporozoiti transgenici di P. yoelii. Dopo aver iniettato gli schizonti trasfettati nei topi, i parassiti sono rilevabili in genere non più tardi di 3 d.p.i. in tutti i gruppi, compreso il controllo senza plasmidi. La selezione viene avviata solo una volta che la ...

Nonostante i progressi nello sviluppo di farmaci e nella ricerca sulla prevenzione e il trattamento della malaria, il carico globale di malattia della malaria rimane elevato. Oltre mezzo milione di persone muoiono di malaria ogni anno, con i più alti livelli di mortalità osservati tra i bambini che vivono in regioni endemiche per la malaria, comel'Africa sub-sahariana. La malaria è causata dal parassita Plasmodium, che viene trasmesso all'uomo attraverso la puntura di zanzare Anopheles femmine che portano il parassita nelle loro ghiandole salivari. Lo stadio infettivo del Plasmodium, gli sporozoiti, si deposita nella pelle dei vertebrati ospiti durante un pasto di sangue e viaggia attraverso il flusso sanguigno per infettare le cellule del fegato, dove subiscono uno sviluppo obbligatorio (costituendo la malaria pre-eritrocitica) prima di infettare gli eritrociti. L'infezione degli eritrociti dà inizio allo stadio ematico della malaria ed è responsabile della totalità della morbilità e della mortalità associate alla malattia 2,3.
La natura obbligata dello sviluppo pre-eritrocitario del Plasmodium lo ha reso un bersaglio attraente per gli sforzi di profilassi di vaccini e farmaci4. Un prerequisito per studiare la biologia della malaria pre-eritrocitica, così come lo sviluppo di vaccini o farmaci mirati allo stadio epatico, è l'accesso agli sporozoiti di Plasmodium. Inoltre, la nostra capacità di generare sporozoiti di Plasmodium geneticamente modificati è stata determinante per il successo di tali sforzi di ricerca 5,6,7,8,9. Linee transgeniche di Plasmodium che esprimono proteine reporter fluorescenti o luminescenti ci hanno permesso di seguirne lo sviluppo in vivo e in vitro10,11. I parassiti geneticamente attenuati (GAP), generati attraverso la delezione di più geni nel Plasmodium, sono anche alcuni dei candidati vaccini più promettenti12,13.
I modelli di malaria di roditori e primati non umani ci hanno aiutato a comprendere i meccanismi delle interazioni ospite-parassita nella malaria umana a causa delle somiglianze nella biologia e nel ciclo vitale tra le specie di Plasmodium 14. L'uso di specie di Plasmodium che infettano i roditori, ma non gli esseri umani (ad esempio, P. berghei) consente il mantenimento dell'intero ciclo di vita del parassita e la generazione di sporozoiti infettivi per lo studio della malaria allo stadio epatico in un ambiente controllato di livello 1 di biosicurezza. Esiste già una varietà di protocolli separati per la generazione di parassiti transgenici del Plasmodium 15, l'infezione delle zanzare16 e l'isolamento degli sporozoiti17. In questo articolo, delineiamo un protocollo completo che combina queste metodologie al fine di generare e isolare sporozoiti transgenici di P. berghei, utilizzando il nuovo ceppo transgenico PbGFP11 come esempio. PbGFP 11 traffica l'undicesimo filamento β della proteina fluorescente verde (GFP), GFP11, nel vacuolo parassitoforo (PV) generato negli epatociti ospiti. PbGFP 11 è usato in combinazione con epatociti transgenici (Hepa1-6 background) che esprimono residui che costituiscono il frammento GFP 1-10 (GFP 1-10) nel citoplasma (cellule Hepa GFP 1-10). PbGFP11 riporta la lisi PV negli epatociti ospiti attraverso l'auto-complementazione e la riformazione della GFP funzionale e il segnale di fluorescenza verde18. Da notare che GFP 11 è codificato come una serie di sette sequenze tandem in PbGFP11 per migliorare il segnale di fluorescenza risultante. Dopo aver colorato gli sporozoiti PbGFP11 con il colorante citoplasmatico CellTrace Violet (CTV), possiamo rintracciare i parassiti. La lisi di tali parassiti intracellulari colorati con CTV provoca di per sé la fuoriuscita di CTV nel citoplasma della cellula ospite e la colorazione della cellula ospite. Oltre a visualizzare e distinguere la lisi di Plasmodium PV e/o del parassita negli epatociti dell'ospite, questo sistema può essere utilizzato in modo affidabile per studiare le vie immunitarie responsabili di uno di questi processi, attraverso la perturbazione genetica o terapeutica delle componenti molecolari di tali vie.

<table><tbody><tr><td>30 G x 1/2" Ago per siringa</td><td>Exel international</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Alsever</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>A3551-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2</td><td>Lonza</td><td>VMI-1021</td><td></td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromoetanolo)</td><td>TCI America</td><td>T1420</td><td></td></tr><tr><td>Provette per la raccolta del sangue</td><td>BD</td><td>bioscience 365967</td><td>per prelievo di siero</td></tr><tr><td>Ematocitometro monouso C-Chip</td><td>INCYTO</td><td>DHC-N01-5</td><td></td></tr><tr><td>CellVeiw Piatto per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627860</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5425</td><td>Eppendorf</td><td>5405000107</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5910R</td><td>Eppendorf</td><td>5910R</td><td>Per centrifugazione in gradiente</td></tr><tr><td>Delta Vision II - Sistema di microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido Sigma</td><td></td><td>D5879-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GenClone</td><td>25-525</td><td></td></tr><tr><td>GFP11 plasmide</td><td>Kurup Lab</td><td>pSKspGFP11</td><td>Generato da PL0017</td></tr><tr><td>plasmide Giemsa Stain</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>48900-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Hepa GFP1-10 cellule</td><td>Kurup Lab</td><td>Hepa GFP1-10</td><td>Generato da cellule Hepa 1-6 (ATCC Cat# CRL-1830)</td></tr><tr>Siero <td></td><td></td><td>di topo</td><td>utilizzato per terreni di dissezione delle zanzare</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SX0420-5</td><td>1,5 M e 0,15 M per soluzione di percoll</td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems (Lonza)</td><td></td><td>Programma U-033 utilizzato per l'elettroporazione dei globuli rossi</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Gradiente di densità)</td><td>Cytivia</td><td>17-0891-02</td><td>Dettagli nel protocollo</td></tr><tr><td>PL0017 Plasmide</td><td>BEI Resources</td><td>MRA-786</td><td></td></tr><tr><td>Pirimetamina (per somministrazione orale)</td><td>Sigma</td><td>46706</td><td>Dettagli di preparazione: Aggiungere 17,5 mg di pirimetamina a 2,5 mL di DMSO. Vortice, se necessario per sciogliersi completamente; Regolare il pH di 225 mL di dH2O a 4 utilizzando HCL. Aggiungere la pirimetamina in DMSO all'acqua e portare a 250 ml. Aggiungere 10 g di zucchero per incoraggiare il consumo regolare di acqua drogata. La pirimetamina è sensibile alla luce. Usa una bottiglia scura o una bottiglia ricoperta di foglio di alluminio quando tratti i topi.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Software per microscopia SoftWoRx</td><td>Precisione applicata</td><td>v6.1.3</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di sporozoiti geneticamente modificati di plasmodium berghei

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

La malaria è una malattia mortale causata dal parassita Plasmodium e si trasmette attraverso la puntura delle zanzare femmine di zanzara Anopheles . Lo stadio sporozooitico di Plasmodium depositato dalle zanzare nella pelle degli ospiti vertebrati subisce una fase di sviluppo obbligatorio nel fegato prima di iniziare la malaria clinica. Sappiamo poco sulla biologia dello sviluppo del Plasmodium nel fegato; l'accesso allo stadio di sporozoite e la capacità di modificare geneticamente tali sporozoiti sono strumenti fondamentali per studiare la natura dell'infezione da Plasmodium e la conseguente risposta immunitaria nel fegato. Qui presentiamo un protocollo completo per la generazione di sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei . Modifichiamo geneticamente P. berghei allo stadio sanguigno e usiamo questa forma per infettare le zanzare Anopheles quando assumono un pasto di sangue. Dopo che i parassiti transgenici si sono sviluppati nelle zanzare, isoliamo lo stadio di sporozoite del parassita dalle ghiandole salivari della zanzara per la sperimentazione in vivo e in vitro . Dimostriamo la validità del protocollo generando sporozoiti di un nuovo ceppo di P. berghei che esprime la subunità 11 della proteina fluorescente verde (GFP) (GFP11) e mostriamo come potrebbe essere utilizzato per studiare la biologia della malaria allo stadio epatico.

Determinare la frequenza e lo sviluppo degli schizonti è fondamentale per garantire che un numero sufficiente di parassiti vitali si trovi nella fase ottimale per la trasfezione. Gli schizonti immaturi possono essere differenziati dagli schizonti completamente maturi per la presenza di un minor numero di merozoiti che non riempiono l'intero spazio intracellulare dei globuli rossi (Figura 1B). È importante notare che quando si eseguono strisci di sangue da sangue coltivato, i globuli rossi in...

La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .

Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Attualmente abbiamo una comprensione limitata della biologia dell'infezione da plasmodio del fegato. Questo protocollo ci ha aiutato a generare molte linee transgeniche che ci hanno aiutato a rispondere ad alcune domande critiche sulla biologia dell'organismo. Una conoscenza di base del parassita e della sua biologia è necessaria per sviluppare nuovi strumenti e approcci per combattere l'infezione da malaria.Il metodo di transgenesi che stiamo descrivendo qui ci ha aiutato a decifrare alcune caratteristiche chiave e complesse della biologia dell'organismo e dell'ospite. A dimostrare questa procedura sarà Carson Bowers, il mio responsabile di laboratorio. Dopo aver generato topi infetti da P.Bergehei e averli sottoposti a eutanasia, raccogliere due millilitri di sangue da due topi infetti in cinque millilitri di soluzione Elsevier in un ambiente sterile.Centrifugare il sangue a 450 g per otto minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno RPMI completo. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare e risospendere il pellet in 25 millilitri di terreno RPMI completo.Trasferire la sospensione cellulare in un matraccio da coltura T75 con tappo filtrante e incubare agitando delicatamente per mantenere le cellule in sospensione. Al termine dell'incubazione, raccogliere 500 microlitri del campione. Centrifugare e risospendere il pellet in 10 microlitri di terreno RPMI completo.Quindi, prepara uno striscio di sangue sottile. Macchia lo striscio di sangue con la macchia di Giemsa e determina la frequenza degli schizonti. Per un'efficienza di trasfezione ottimale, il 60-70% dei parassiti dovrebbe essere allo stadio di schizonto.Preparare un tampone di centrifugazione a gradiente ricostituendo 13 millilitri di terreno di prova a gradiente di densità in una provetta di centrifugazione da 50 millilitri. Trasferire 25 millilitri di emocoltura in una nuova provetta da centrifugazione da 50 millilitri. Quindi stratificare con cura 20 millilitri di tampone di centrifugazione a gradiente sul fondo della provetta di centrifugazione, utilizzando una pipetta di vetro stretta per creare una colonna a gradiente e garantire una chiara divisione tra il tampone e il terreno.Centrifugare il tampone preparato e il terreno per 20 minuti a 450 g senza interruzioni a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta da pascolo, rimuovere con cautela lo strato di schizont all'interfaccia tra il terreno di coltura e il tampone di centrifugazione a gradiente. Mettilo in una nuova provetta da centrifugazione da 50 millilitri.Risospendere gli schizonti isolati in un terreno RPMI completo e aumentare il volume totale a 40 millilitri. Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, risospendere lo schizont in 10 millilitri di terreno RPMI completo. Quindi trasferire un millilitro di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni trasfezione e pellettare le cellule infette mediante centrifugazione a 16.000 G per cinque secondi.Successivamente, combinare 100 microlitri di tampone per elettroporazione a temperatura ambiente con cinque microgrammi di DNA plasmidico target in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule infette, rimuovere il surnatante e risospendere con cautela le cellule nella soluzione nucleoefector preparata più DNA plasmidico. Quindi trasferire la sospensione in elettroporazione, cuvette e trasfetto utilizzando un programma nucleofettore adatto.Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno RPMI completo alla cuvetta. Trasferire l'intera soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e posizionarla sul ghiaccio. Verificare i livelli di parassitemia nei topi inoculati con lo schizont trasfettato giornalmente a partire da due giorni dopo l'inoculazione.Una volta confermata l'infezione, iniziare la selezione del farmaco somministrando il farmaco per via orale e bevendo acqua offerta ad libitum. Monitorare la parassitemia utilizzando strisci di sangue a partire da sei giorni dopo l'inizio del trattamento con pirometimmina. Quando la parassitemia raggiunge almeno l'1%, trasferisci i parassiti a topi B6 naïve per creare scorte di parassiti allo stadio sanguigno.Una volta che la parassitemia raggiunge il 2%-5%, generare scorte e crioconservarle. Un giorno prima dell'infezione da zanzare, separare le zanzare femmine mettendo un guanto pieno d'acqua riscaldata a 37 gradi Celsius sopra la gabbia contenente zanzare sia maschi che femmine. Usa un aspiratore per insetti per rimuovere le zanzare femmine attratte dalla fonte di calore e trasferiscile in una gabbia più piccola per l'infezione.Il giorno dell'alimentazione e dell'infezione delle zanzare, determinare la parassitemia nei topi B6 infetti. La parassitemia tra il 2% e il 5% è ottimale per l'infezione da zanzare. Dopo aver verificato la parassitemia, trasferire l'infezione alle zanzare femmine posizionando i topi anestetizzati sulle zanzare femmine in gabbia sotto decubito sternale.Allargare manualmente le zampe anteriori e posteriori per fornire la massima superficie per l'alimentazione delle zanzare. Lasciare i topi infetti in ogni gabbia per 15 minuti, controllando ogni cinque minuti per assicurarsi che i topi non siano svegli. Una volta che l'alimentazione è completa e i topi sono stati soppressi, smaltirli in modo sicuro seguendo le linee guida dell'istituto.Per verificare il successo dell'infezione all'interno delle zanzare, isolare l'intestino medio delle zanzare rimuovendo il segmento addominale terminale con una pinza 10 giorni dopo l'infezione. Quindi osserva l'intestino medio sotto la luce polarizzata per rilevare la presenza di oocisti. A 18 giorni dall'infezione, sezionare da cinque a 10 zanzare per valutare il numero di sporozoiti presenti.Per isolare e contare gli sporozoiti, rimuovere con cautela la testa della zanzara mentre si applica una pressione sul torace con una pinza o un ago da dissezione fine. Le ghiandole salivari rimarranno attaccate alla testa rimossa. Successivamente, rimuovere eventuali detriti di zanzare aggiuntivi dalle ghiandole salivari e metterli in una provetta da micro centrifuga contenente 400 microlitri di terreno di dissezione delle zanzare.Quindi interrompere le ghiandole salivari isolate facendole passare attraverso una siringa ad ago calibro 30 da 15 a 20 volte, Successivamente, posizionare 10 microlitri delle ghiandole salivari interrotte in un mezzo di dissezione delle zanzare in un emocitometro e contare. Infine, sospendere nuovamente le ghiandole salivari nella concentrazione desiderata di mezzi di dissezione delle zanzare o PBS per l'iniezione nei topi o la crioconservazione a lungo termine. Come al microscopio, vengono presentate immagini raffiguranti schizont di P.berghei maturo e immaturo in emocolture di topo parassitate.Come le immagini al microscopio di una testa di zanzara con le ghiandole salivari ancora intatte durante la dissezione, e la ghiandola salivare sezionata sotto ingrandimenti più bassi e più alti. La generazione del segnale di fluorescenza verde nel PB, GFP 11 ha infettato HEPA GFP da uno a 10 cellule ospiti ha indicato la lisi del vacuolo parassitoforo. È importante rimuovere con cautela lo strato del chaisson senza interrompere l'interfaccia del gradiente.Inoltre, ci vuole un po' di pratica per rimuovere in modo affidabile le ghiandole salivari insieme alla testa durante l'isolamento alla luce delle spore. Dopo l'isolamento, gli sporozoiti transgenici possono essere crioconservati o utilizzati freschi per studi di infezione in vivo o in vitro.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Zanzare anofele stephensi sono vettori per la malaria che abitano l'India e tutta l'Asia. Questo video mostra la tecnica per l'esecuzione di microiniezioni di questa specie con transgeni che conferiscono resistenza alla malaria alla zanzara. Gran parte della metodologia ha dimostrato in questo video è applicabile alle tecniche di microiniezione di altre specie di zanzare.

Iniezione di An. Gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare

Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici...

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

In questo video, descriviamo la nucleofection, una procedura di trasfezione basata sull'elettroporazione per fornire DNA plasmidico codificante una proteina reporter fluorescente nella forma sporozoite del parassita Eimeria del pollo.

Nucleofection of Parameter Forms: un metodo di trasfezione basato sull'elettroporazione per fornire plasmidi codificanti proteine fluorescenti nel nucleo di sporozoite

Questo video dimostra la generazione di un modello murino sperimentale di malaria cerebrale. Gli sporozoiti isolati da zanzare femmine infette da Plasmodium berghei vengono iniettati nelle vene della coda di un topo trattenuto, causando l'interruzione della barriera emato-encefalica e l'infiammazione cerebrale, causando la malaria cerebrale. Questo modello murino infetto offre uno strumento prezioso per studiare in vivo la patologia microvascolare associata alla malaria cerebrale.

Generazione di un modello murino di malaria cerebrale sperimentale utilizzando sporozoiti derivati da zanzare ospiti

Questo video mostra un test per l'immunizzazione di un modello murino con sporozoiti vivi attenuati. Gli sporozoiti di Plasmodium attenuati dalle radiazioni vengono iniettati nel lato dorsale dell'orecchio del topo. Dopo le iniezioni in più punti su entrambe le orecchie, il topo può riprendersi.

Immunizzazione intradermica con sporozoiti vivi attenuati in un modello murino

Descriviamo qui un protocollo per isolare le cellule mieloidi dalla pelle di topo e drenare i linfonodi dopo l'iniezione intradermica di sporozoiti di Plasmodium. La citometria a flusso delle cellule raccolte fornisce un test affidabile per caratterizzare la risposta infiammatoria della pelle e drenante dei linfonodi al parassita.

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

Descriviamo un modello murino di malaria cerebrale sperimentale e mostriamo come la patologia infiammatoria e microvascolare possa essere monitorata in vivo utilizzando la risonanza magnetica.

Tracciamento in vivo di sviluppo dell&#39;edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l&#39;utilizzo di immagini a risonanza magnetica

A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori con i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Qui, abbiamo standardizzato alcune delle tecniche più importanti utilizzate nell'analisi fenotipica di specie di malaria roditore selvatico e transgenico.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Descriviamo un metodo per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in Plasmodium falciparum utilizzando CRISPR/Cas9 editing genomico.

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

La genetica chimica prevede la sostituzione di un residuo gatekeeper con un amminoacido contenente una catena laterale diversa nel locus bersaglio. Qui, abbiamo generato un parassita mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 e identificato le vie compensatorie adottate dal parassita nel background mutante.

Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

Lo sviluppo sessuale del Plasmodium avviene nell'intestino medio della zanzara. Prendere di mira le fasi sessuali del parassita è una strategia promettente per bloccare la trasmissione. Abbiamo sviluppato Ookluc, un P. berghei transgenico che esprime nanoluciferasi dopo la formazione dello zigote, consentendo lo screening ad alto rendimento di composti che bloccano la trasmissione. Questo articolo descrive in dettaglio i metodi per lo screening utilizzando Ookluc.

Ookluc: una linea di Plasmodium berghei per l'identificazione di composti che bloccano la trasmissione

Scopri la metodologia per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei per studiare la biologia della malaria. Questo protocollo aiuta i ricercatori a sviluppare nuovi strumenti contro l'infezione.

Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

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