Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

La nostra ricerca mira a sviluppare modelli epatici in vitro rilevanti per l'uomo per i test di efficacia e sicurezza dei farmaci, imitando da vicino i tessuti epatici sani e malati negli studi preclinici. La riproduzione dell'intera complessità del fegato, il raggiungimento di funzionalità a lungo termine, la standardizzazione dei protocolli e la scalabilità della produzione di organoidi per applicazioni ad alto rendimento rimangono una delle principali sfide sperimentali nella ricerca sugli organoidi. Recentemente abbiamo modellato la fibrosi epatica da organoidi epatici sani e stabilito modelli di malattie rare del fegato, tra cui la citrullinemia e il deficit di piruvato carbossilasi, da cellule derivate da pazienti. A differenza di altri metodi, il nostro protocollo eHEPO fornisce organoidi epatici funzionali in modo rapido e su larga scala, supportando la funzionalità a lungo termine e più saggi da una popolazione iniziale coerente.

[Narratore] Per iniziare, aggiungi 6 millilitri di DMEM/F-12 freddo in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere immediatamente 80 microlitri di matrice a membrana basale FOD o BMM al tubo e mescolare bene. Rivestire una piastra a pozzetti trattata con coltura tissutale con la soluzione BMM ed erogare la soluzione per coprire la superficie della piastra a pozzetti. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37° Celsius per almeno un'ora. Prelevare una cellula staminale pluripotente inducibile o una piastra IPSC e aspirare il terreno specifico per IPSC. Sciacquare la piastra con DMEM/F-12 o DPBS e aggiungere 1 millilitro dell'enzima specifico a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Dopo l'incubazione per un minuto, aspirare l'enzima e incubare la piastra a 37° Celsius per cinque-sette minuti. Quindi, aggiungere 1 millilitro di terreno IPSC preriscaldato alla piastra e picchiettare delicatamente il lato per staccare gli aggregati di colonie indifferenziate dalla superficie della piastra. Miscelare delicatamente la sospensione con una pipetta sierologica da 5 millilitri, quindi seminare la sospensione cellulare alla densità desiderata sul pozzetto rivestito di BMM. Incubare le cellule a 37° Celsius per tre-cinque giorni per raggiungere una confluenza del 70%. Sostituire il terreno IPSC con il mezzo endodermico prima di iniziare la differenziazione. Le cellule acquisiscono una forma appuntita dopo la differenziazione, indicando l'interazione cellula-cellula. Sciacquare le cellule dell'endoderma con PBS. Aggiungere 300 microlitri di tripsina. E incubare le cellule per cinque minuti nell'incubatrice. Aggiungere 3 millilitri di DMEM/F-12 freddo alle cellule e pipettare con puntali filtranti da 1.000 microlitri per generare singole cellule. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 300 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, lavare il pellet con 10 millilitri di tampone FACS. Per realizzare una sospensione a cella singola, filtrare le cellule con un filtro a maglie da 100 micrometri e poi con un filtro a maglie da 40 micrometri prima di centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti. Risospendere 15 milioni di cellule con 105 microlitri di tampone FACS e aggiungere 45 microlitri di FcR e 15 microlitri di EpCAM alla sospensione. Incubare le cellule per 10 minuti a 4° Celsius, proteggendo la provetta dalla luce. Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone FACS per lavare la sospensione cellulare. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone FACS e aggiungere 0,5 micromolari per millilitro di DAPI alla sospensione cellulare per quantificare le cellule morte. Dopo la selezione delle cellule, centrifugare le cellule a 300 x g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante. E risospendere da 3.000 a 5.000 cellule in 20 microlitri di BMM. Seminare le cellule aggiungendo una goccia di BMM al centro di ogni piastra a 48 pozzetti e incubare le cellule per due minuti a 37° Celsius fino a quando il BMM non si sarà solidificato. Sovrapporre la gocciolina con il mezzo di espansione. Per dividere la gocciolina dell'organoide, scartare il mezzo organoide e aggiungere 500 microlitri di Ad-DMEM/F-12 freddo al pozzetto. Utilizzare puntali filtranti da 1.000 microlitri per pipettare energicamente le goccioline di BMM. Raccogliere un massimo di 10 goccioline di BMM in provette coniche da 15 millilitri e aggiungere 5 millilitri di Ad-DMEM/F-12 freddo. Metti il tubo sul ghiaccio per tre-cinque minuti. Centrifugare le cellule a 200 x g per cinque minuti a 4° Celsius e scartare il surnatante fino a quando rimane 1 millilitro di surnatante. Pipettare energicamente il pellet cellulare da 30 a 40 volte utilizzando puntali filtranti da 200 microlitri. Dopo la dissociazione meccanica, aggiungere 5 millilitri di Ad-DMEM/F-12 freddo prima di centrifugare le cellule per cinque minuti. Scartare il surnatante. E posiziona la sospensione sul ghiaccio. Semina una gocciolina di BMM da 50 microlitri. E aggiungere 25 nanogrammi per millilitro di BMP7 al mezzo di espansione. Dopo la coltura per tre giorni, sostituire il terreno con il terreno di differenziazione e coltivare le cellule per almeno 14 giorni. È stata eseguita un'analisi di immunocolorazione per convalidare se gli organoidi originati dalle cellule EpCAM+ sono impegnati verso la linea epatica. La presenza di cellule CK19+ e HNF4ɑ+ indica che gli epatoblasti e le cellule progenitrici del dotto biliare sono presenti negli organoidi. Inoltre, gli organoidi che esprimono marcatori del tessuto epiteliale, come le cellule E-CAD+ e le cellule epiteliali cubiche o poliedriche che esprimono ZO-1, indicano la presenza di giunzioni strette tra le cellule. L'immunoistochimica ha rivelato che le cellule E-CAD+ mostravano una struttura epiteloide poligonale, che rifletteva un fenotipo simile a quello degli epatociti. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione degli eHEPO sono mostrate qui. I cerchi bianchi indicano i complessi giunzionali intercellulari. Le frecce nere mostrano la differenziazione della superficie apicale. E la freccia rossa mostra una sezione trasversale di microvilli. L'analisi qPCR ha mostrato che gli organoidi hanno acquisito marcatori ematocitari maturi come ALB, A1AT, CYP3A4 e CYP3A7. L'area colorata di rosa nella colorazione PAS indica la capacità di immagazzinamento del glicogeno degli organoidi. Inoltre, la nostra analisi ha mostrato la capacità degli organoidi di secernere ALB nei terreni di coltura, eliminare l'ammoniaca dai terreni di coltura, l'attività dell'enzima CYP3A4 e la capacità di trasporto degli acidi biliari.