Name: Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Scopri il protocollo per generare organoidi epatici endodermici funzionali in sole due settimane. Questo metodo consente espansione a lungo termine mantenendo differenziazione e funzionalità per studi sul fegato.

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<ol><li>Huch, M., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Marsee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+definition+and+nomenclature+of+hepatic%2C+pancreatic%2C+and+biliary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+reproducible+production+of+liver+buds+entirely+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+organoids+for+the+analysis+of+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases.</a> JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).</li>
<li>Ramli, M. N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Akbari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+culture+of+endoderm-derived+hepatic+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Meisenheimer, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proluciferin+acetals+as+bioluminogenic+substrates+for+cytochrome+P450+activity+and+probes+for+CYP3A+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition.</a> Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).</li>
<li>Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADME+evaluation%3A+dialing+in+CYP+selectivity+with+luminogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminogenic+cytochrome+P450+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Luminogenic cytochrome P450 assays.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+liver+medicine+using+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation liver medicine using organoid models.</a> Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+organization+in+hepatocyte+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological organization in hepatocyte organoid cultures.</a> American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).</li>
<li>Shinozawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+drug-induced+liver+injury+screen+using+human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids.</a> Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatobiliary+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>37 gradi C bagnomaria</td><td>N&uuml; ve</td><td>210.NB9</td><td></td></tr><tr><td>37 gradi C, 5 % CO2 incubatore</td><td>Memmert</td><td>INCO 153</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m e 40 &micro; m Filtro cellulare</td><td>Falcone</td><td>352350/ 352340</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td>Sigma</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>A1AT</td><td>Abcam</td><td>ab166610</td><td>Diluizione: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>A-83.01 (inibitore del TGF-beta)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Isolab</td><td>9,01,026</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino adesivo per microscopio</td><td>Legame istologico</td><td>C981040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 avanzato</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>AFP</td><td>Abcam</td><td>AB3980</td><td>Diluizione: 1/25 (IHC)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>EMS</td><td>10200</td><td></td></tr><tr><td>CAMICE</td><td>Abcam</td><td>ab10241</td><td>Diluizione: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Alexa Farina 488 (Mouse)</td><td>Invitrogen</td><td>Codice: A11001</td><td>Diluizione: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Farina 488 (Coniglio)</td><td>Invitrogen</td><td>A110034</td><td>Diluizione: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Farina 594 (Mouse)</td><td>Invitrogen</td><td>Codice: A11005</td><td>Diluizione: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Farina Alexa 594 (Coniglio)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Codice A11037</td><td>Diluizione: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio dell'ammoniaca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK-310</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-202936</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27 50x</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Stampo di base</td><td>Sakura</td><td>4216</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Biosicurezza, CLASSE II, ARMADIO DI SICUREZZA</td><td>Termo</td><td>SICURO 2020</td><td></td></tr><tr><td>Pipette calibrate</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Colilglilamido-fluoresceina</td><td>Corning</td><td>451041</td><td></td></tr><tr><td>tampone citrato pH 6.0</td><td>Bio-ottica</td><td>15-M103</td><td></td></tr><tr><td>CK-18</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-51582</td><td>Diluizione: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>CK-19</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6278</td><td>Diluizione: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>Pannello LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Guanti criogenici per la manipolazione e protezione degli occhi</td><td>Criokit</td><td>5274</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Provette crioviali</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>LIMANDA</td><td>Roche</td><td>11718096001</td><td></td></tr><tr><td>REPARTO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5942</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8426</td><td>Diluizione: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico</td><td>Zeiss</td><td>Sigma500</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA</td><td>Fortis scienze della vita bethyl</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 Kit di inclusione</td><td>EMS</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>eosina y %1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>Diluizione: 1/11 (FACS)</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1,00,98,32,511</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26010066</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina (FSK)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per il congelamento (Mr. Frosty)</td><td>Termo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento</td><td>Gibco</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in vetro Pasteur</td><td>Isolab</td><td>084.01.001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldeide %25, grado EM</td><td>EMS</td><td>16210-1L</td><td></td></tr><tr><td>HRP anti-topo di capra</td><td>Thermo Fisher</td><td>62-6520</td><td>Diluizione: 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Capra Anti-Coniglio HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>Diluizione: 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Gibco</td><td>162-10-072</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>Millipore</td><td>HX86017674</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4&alfa;</td><td>Abcam</td><td>ab55223</td><td>Diluizione: 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>Ghiaccio e ghiaccio secco</td><td>casereccio</td><td>casereccio</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice (65 &deg; C)</td><td>N&uuml; ve</td><td>EN 400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Leu15 Gastrin I umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Luminometro</td><td>Berthold Tech</td><td>LB 960</td><td></td></tr><tr><td>Master mix&nbsp;</td><td>Biosistemi Applicati</td><td>43676659</td><td></td></tr><tr><td>Matrice Matrigel, qualificata hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Matrice Matrigel, priva di rosso fenolo</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Axygen</td><td>321-02-501</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>AXIO VERT A1</td><td></td></tr><tr><td>Lama per microtomo</td><td>Piuma</td><td>S35, C35</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>SC-05850</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura per sospensioni a più pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,21,500</td><td></td></tr><tr><td>Integratore N2 100x</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Codice: A9165</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponata neutra %10</td><td>Tekkim</td><td>TK.60161.05001</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>OTTOBRE</td><td>Tessuto-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Kit di saggi P450-Glo&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V9001</td><td></td></tr><tr><td>Pap-pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Tekkim</td><td>TK.200661.01002</td><td></td></tr><tr><td>Kit per macchie PAS</td><td>Abcam</td><td>ab150680</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosfotoungustico</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di aiuto</td><td>Axygen</td><td>Motopet-1</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre varioskan flash&nbsp;</td><td>Termo</td><td>5250040</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di propilene, grado EM</td><td>EMS</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Biosistemi Applicati</td><td>7500 Veloce&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Activina A umana ricombinante</td><td>R& D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>BMP7 umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>120-03</td><td></td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FGF10 umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF19 umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>HGF umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della chinasi Rho, Y-27632 dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 1,5 mL priva di RNasi/DNasi</td><td>Axygen</td><td>31108101</td><td></td></tr><tr><td>Puntali filtranti privi di RNasi/DNasi</td><td>Sarstedt</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo</td><td>Leica</td><td>Visualizzazione del materiale RM 2245</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Fluido condizionato con Rspo1</td><td>Casereccio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schema diapositiva</td><td>Bio-ottica</td><td>15-MEQ001</td><td></td></tr><tr><td>Sorenson' s tampone fosfato</td><td>EMS</td><td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>Filatore</td><td>Termo</td><td>IL MIO GIRO 6</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili</td><td>Falcone</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Vestaglia per tessuti</td><td>Leica</td><td>3802240</td><td></td></tr><tr><td>Taglierina</td><td>Leica</td><td>EM TRIM2</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Termo Scientifico</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Vortice</td><td>Termo</td><td>88880018</td><td></td></tr><tr><td>Proteina di fusione Wnt surrogato-Fc</td><td>Immunopreciso</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>16446</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td>Diluizione: 1/400 (IF)</td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Generation of Functional Endodermal Hepatic Organoids

In primo luogo, le cellule dei fibroblasti umani o le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state coltivate e convertite in iPSC tramite riprogrammazione episomiale. Il siero knockout fresco è stato essenziale per ottenere iPSC sane. Quindi, le iPSC sono state seminate nelle piastre di coltura rivestite di BMM con confluenza del 50%-60%. Avere colonie di iPSC di piccole/medie dimensioni ha migliorato l'efficienza di differenziazione. Quindi, le iPSC sono state differenziate in endoderma definiti...

Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Organoid technology has allowed us to generate a variety of human organ-like mini structures, such as for the liver, brain, and intestine, in vitro. The ...

La nostra ricerca mira a sviluppare modelli epatici in vitro rilevanti per l'uomo per i test di efficacia e sicurezza dei farmaci, imitando da vicino i tessuti epatici sani e malati negli studi preclinici. La riproduzione dell'intera complessità del fegato, il raggiungimento di funzionalità a lungo termine, la standardizzazione dei protocolli e la scalabilità della produzione di organoidi per applicazioni ad alto rendimento rimangono una delle principali sfide sperimentali nella ricerca sugli organoidi. Recentemente abbiamo modellato la fibrosi epatica da organoidi epatici sani e stabilito modelli di malattie rare del fegato, tra cui la citrullinemia e il deficit di piruvato carbossilasi, da cellule derivate da pazienti. A differenza di altri metodi, il nostro protocollo eHEPO fornisce organoidi epatici funzionali in modo rapido e su larga scala, supportando la funzionalità a lungo termine e più saggi da una popolazione iniziale coerente.[Narratore] Per iniziare, aggiungi 6 millilitri di DMEM/F-12 freddo in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere immediatamente 80 microlitri di matrice a membrana basale FOD o BMM al tubo e mescolare bene. Rivestire una piastra a pozzetti trattata con coltura tissutale con la soluzione BMM ed erogare la soluzione per coprire la superficie della piastra a pozzetti. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37° Celsius per almeno un'ora. Prelevare una cellula staminale pluripotente inducibile o una piastra IPSC e aspirare il terreno specifico per IPSC. Sciacquare la piastra con DMEM/F-12 o DPBS e aggiungere 1 millilitro dell'enzima specifico a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Dopo l'incubazione per un minuto, aspirare l'enzima e incubare la piastra a 37° Celsius per cinque-sette minuti. Quindi, aggiungere 1 millilitro di terreno IPSC preriscaldato alla piastra e picchiettare delicatamente il lato per staccare gli aggregati di colonie indifferenziate dalla superficie della piastra. Miscelare delicatamente la sospensione con una pipetta sierologica da 5 millilitri, quindi seminare la sospensione cellulare alla densità desiderata sul pozzetto rivestito di BMM. Incubare le cellule a 37° Celsius per tre-cinque giorni per raggiungere una confluenza del 70%. Sostituire il terreno IPSC con il mezzo endodermico prima di iniziare la differenziazione. Le cellule acquisiscono una forma appuntita dopo la differenziazione, indicando l'interazione cellula-cellula. Sciacquare le cellule dell'endoderma con PBS. Aggiungere 300 microlitri di tripsina. E incubare le cellule per cinque minuti nell'incubatrice. Aggiungere 3 millilitri di DMEM/F-12 freddo alle cellule e pipettare con puntali filtranti da 1.000 microlitri per generare singole cellule. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 300 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, lavare il pellet con 10 millilitri di tampone FACS. Per realizzare una sospensione a cella singola, filtrare le cellule con un filtro a maglie da 100 micrometri e poi con un filtro a maglie da 40 micrometri prima di centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti. Risospendere 15 milioni di cellule con 105 microlitri di tampone FACS e aggiungere 45 microlitri di FcR e 15 microlitri di EpCAM alla sospensione. Incubare le cellule per 10 minuti a 4° Celsius, proteggendo la provetta dalla luce. Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone FACS per lavare la sospensione cellulare. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone FACS e aggiungere 0,5 micromolari per millilitro di DAPI alla sospensione cellulare per quantificare le cellule morte. Dopo la selezione delle cellule, centrifugare le cellule a 300 x g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante. E risospendere da 3.000 a 5.000 cellule in 20 microlitri di BMM. Seminare le cellule aggiungendo una goccia di BMM al centro di ogni piastra a 48 pozzetti e incubare le cellule per due minuti a 37° Celsius fino a quando il BMM non si sarà solidificato. Sovrapporre la gocciolina con il mezzo di espansione. Per dividere la gocciolina dell'organoide, scartare il mezzo organoide e aggiungere 500 microlitri di Ad-DMEM/F-12 freddo al pozzetto. Utilizzare puntali filtranti da 1.000 microlitri per pipettare energicamente le goccioline di BMM. Raccogliere un massimo di 10 goccioline di BMM in provette coniche da 15 millilitri e aggiungere 5 millilitri di Ad-DMEM/F-12 freddo. Metti il tubo sul ghiaccio per tre-cinque minuti. Centrifugare le cellule a 200 x g per cinque minuti a 4° Celsius e scartare il surnatante fino a quando rimane 1 millilitro di surnatante. Pipettare energicamente il pellet cellulare da 30 a 40 volte utilizzando puntali filtranti da 200 microlitri. Dopo la dissociazione meccanica, aggiungere 5 millilitri di Ad-DMEM/F-12 freddo prima di centrifugare le cellule per cinque minuti. Scartare il surnatante. E posiziona la sospensione sul ghiaccio. Semina una gocciolina di BMM da 50 microlitri. E aggiungere 25 nanogrammi per millilitro di BMP7 al mezzo di espansione. Dopo la coltura per tre giorni, sostituire il terreno con il terreno di differenziazione e coltivare le cellule per almeno 14 giorni. È stata eseguita un'analisi di immunocolorazione per convalidare se gli organoidi originati dalle cellule EpCAM+ sono impegnati verso la linea epatica. La presenza di cellule CK19+ e HNF4ɑ+ indica che gli epatoblasti e le cellule progenitrici del dotto biliare sono presenti negli organoidi. Inoltre, gli organoidi che esprimono marcatori del tessuto epiteliale, come le cellule E-CAD+ e le cellule epiteliali cubiche o poliedriche che esprimono ZO-1, indicano la presenza di giunzioni strette tra le cellule. L'immunoistochimica ha rivelato che le cellule E-CAD+ mostravano una struttura epiteloide poligonale, che rifletteva un fenotipo simile a quello degli epatociti. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione degli eHEPO sono mostrate qui. I cerchi bianchi indicano i complessi giunzionali intercellulari. Le frecce nere mostrano la differenziazione della superficie apicale. E la freccia rossa mostra una sezione trasversale di microvilli. L'analisi qPCR ha mostrato che gli organoidi hanno acquisito marcatori ematocitari maturi come ALB, A1AT, CYP3A4 e CYP3A7. L'area colorata di rosa nella colorazione PAS indica la capacità di immagazzinamento del glicogeno degli organoidi. Inoltre, la nostra analisi ha mostrato la capacità degli organoidi di secernere ALB nei terreni di coltura, eliminare l'ammoniaca dai terreni di coltura, l'attività dell'enzima CYP3A4 e la capacità di trasporto degli acidi biliari.

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