Generazione di topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema combinato di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato
24 marzo 2023
In questo protocollo, descriviamo le procedure tecniche per generare topi knockout specifici per il tessuto adiposo bruno (BAT) sfruttando un sistema combinato di Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA a guida singola (sgRNA) del virus adeno-associato (AAV). I passaggi descritti includono la progettazione degli sgRNA, la preparazione delle particelle AAV-sgRNA e la microiniezione di AAV nei lobi BAT.
Questo protocollo genera topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato. Include una tecnica chirurgica per somministrare in modo sicuro AAV nel grasso bruno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può generare rapidamente knockout tessuto-specifici senza bisogno di allevare topi in modo selettivo.
L'approccio per effettuare knockout o knockdown tessuto-specifici può essere adattato ad altri tessuti se la procedura chirurgica per l'iniezione di AAV viene modificata in base all'organo bersaglio. Per iniziare, somministrare l'analgesico per via sottocutanea al topo UCP1 Cre Cas9 anestetizzato per ridurre al minimo e prevenire il dolore e l'angoscia postoperatori. Quindi radere la pelliccia sulla sua area interscapolare usando un rasoio e sterilizzare l'area chirurgica con almeno tre cicli alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina, seguito da etanolo al 70%.
Usando un bisturi, fai un'incisione di due centimetri nella pelle sopra il tessuto adiposo bruno tra le scapole per esporre il grasso interscapolare. Dopo aver praticato una singola incisione, tagliare i tessuti adiposi al confine tra la regione distale dei tessuti grassi e dei muscoli. Quindi, utilizzando le forbici chirurgiche nella mano dominante, staccare i tessuti grassi senza mezzi termini e verticalmente per esporre il tessuto adiposo bruno mentre pizzicare i tessuti adiposi, incluso il tessuto adiposo bruno, con la mano non dominante.
Utilizzare la vena di Sulzer come punto di riferimento per indicare la posizione precisa del tessuto adiposo bruno. Successivamente, per ogni topo, iniettare lentamente 20 microlitri di virus adeno-associato o AAV in ciascun lobo dei due tessuti adiposi bruni utilizzando un ago affilato di calibro 32 collegato a una siringa di Hamilton da 100 microlitri. Confermare la riuscita dell'iniezione indicata dall'assenza di perdite dal sito iniettato durante la somministrazione di AAV.
Dopo aver assicurato l'omeostasi, riposizionare i tessuti adiposi esposti nella loro posizione normale per suturare il bordo dei tessuti adiposi e del muscolo utilizzando un filo monofilamento assorbibile 5-0. Infine, suturare la pelle aperta con 5-0 rivestiti VICRYL fili intrecciati non tinti. La posizione precisa del tessuto adiposo bruno non può essere identificata senza esporlo, tuttavia, danni da esposizione eccessiva al tessuto.
I potenziali difetti che potrebbero aver portato a iniezioni infruttuose includevano l'iniezione della soluzione AAV nella regione errata, la penetrazione dell'ago attraverso il tessuto e il gonfiamento del tessuto a causa di un volume eccessivo della soluzione AAV. La consegna precisa dell'RNA guida singola AAV al tessuto adiposo bruno è stata fondamentale per il successo del protocollo. La chiave del successo durante l'esposizione del tessuto adiposo bruno è la tecnica chirurgica a forbice, compresa la direzione e la profondità delle forbici e la posizione della siringa di Hamilton.
Questa tecnica ha un carico che genera animali knockout tessuto-specifici per comprendere i regolatori molecolari del metabolismo energetico correlato al grasso bruno.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per generare topi knock-out specifici per il tessuto adiposo bruno (BAT) mediante l'uso combinato delle tecniche Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA guida singolo virale adeno-associato (AAV). Utilizzando questi metodi, i ricercatori possono creare rapidamente knock-out specifici per tessuto senza la necessità di allevamento selettivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Genetica
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
Sfondo
- Il tessuto adiposo bruno è fondamentale per il metabolismo energetico.
- La creazione di knockout specifici per tessuto aiuta a comprendere i processi biologici.
- Questo metodo potrebbe potenzialmente essere adattato per altri tessuti.
Metodi Utilizzati
- Applicazione degli approcci Cre-LoxP e CRISPR-Cas9.
- Modello murino utilizzato: topi UCP1 Cre Cas9.
- Somministrazione di AAV-sgRNA mediante microiniezione chirurgica.
Risultati principali
- Indirizzamento e knockout riusciti del tessuto adiposo bruno.
- Efficacia dimostrata dell'AAV nella modifica genica specifica per tessuto.
- Tecniche chirurgiche fondamentali validate per la somministrazione precisa.
Conclusioni
- Lo studio mostra una tecnica rapida per generare modelli knockout pertinenti al metabolismo del tessuto adiposo bruno.
- Migliora la comprensione dei regolatori molecolari nel metabolismo energetico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La generazione rapida di topi knock-out specifici per il tessuto adiposo bruno (BAT) mediante l'uso combinato delle tecnologie Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA permette un'accelerazione della genomica funzionale nella ricerca metabolica. Questo approccio semplifica la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico per geni coinvolti nella regolazione dell'energia, riducendo i tempi rispetto all'allevamento tradizionale. Il metodo supporta le decisioni di portafoglio fornendo informazioni specifiche per tessuto, fondamentali per la scoperta precoce e la continuità traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della funzione genica nel tessuto adiposo bruno (BAT) per una chiarezza meccanicistica.
- Supporta la riduzione del rischio biologico isolando gli effetti genici in un tessuto rilevante per la malattia.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione degli obiettivi terapeutici per i disturbi metabolici.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce modelli knock-out validati per lo screening fenotipico successivo.
- Standardizza i background genetici per letture quantitative riproducibili.
- Accelera lo sviluppo dei saggi evitando cicli di riproduzione lunghi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici ai meccanismi delle malattie metaboliche umane mediante editing genico specifico per il tessuto adiposo bruno (BAT).
- Permette un avanzamento basato sulla valutazione del rischio chiarificando il contributo del gene al metabolismo energetico.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica nella ricerca metabolica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nelle fasi iniziali di scoperta e di validazione del bersaglio, fornendo un collegamento allo sviluppo di modelli preclinici per portafogli di ricerca metabolica ed endocrina.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nella regolazione dell'energia mediata dal BAT.
- Screening: Fornisce modelli knock-out riproducibili per saggi fenotipici quantitativi.
- Analisi: Permette la misurazione degli effetti specifici dei geni sulle uscite metaboliche in vivo.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei modelli preclinici con la biologia del BAT umano.
- Riutilizzo aziendale: Protocollo adattabile ad altri tessuti modificando la somministrazione di AAV, utile per applicazioni più ampie in R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Ottimizza la generazione di modelli mediante procedure standardizzate e riproducibili.
- Valore strategico: Consente decisioni più rapide di tipo go/no-go e un'allocazione delle risorse efficiente in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei bersagli metabolici ed endocrini con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nell'iniezione microchirurgica e nella localizzazione anatomica del tessuto adiposo bruno (BAT).
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per la produzione di AAV e per l'ingegneria genetica con CRISPR-Cas9.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità.
- È necessaria un'adattamento del protocollo per l'indirizzamento ad altri tessuti o organi.
- Il successo dipende da una somministrazione precisa dell'AAV e dalla riduzione al minimo dei danni ai tessuti.
