Name: Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Scopri l'analisi proteomica di sferoidi 3D utilizzando LC-MS e bioreattori per caratterizzare la funzione biologica delle colture cellulari epatiche HepG2/C3A e THLE-3. Questo metodo consente la produzione simultanea di centinaia di replicati.

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Il laboratorio Sidoli ringrazia la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), l'AFAR (premio Sagol Network GerOmics), Deerfield (premio Xseed), Relay Therapeutics, Merck e l'Ufficio del Direttore NIH (1S10OD030286-01).

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Helle Sedighi Frandsen lavora come ricercatrice presso CelVivo ApS, l'azienda produttrice del sistema ClinoStar. Karoline Mikkelsen è una dottoranda industriale impiegata presso CelVivo ApS e sta svolgendo il suo dottorato di ricerca presso la SDU, Odense, Danimarca. Tutti gli altri autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Comprendere la biologia alla base delle strutture cellulari tridimensionali (3D) è estremamente importante per una conoscenza più completa delle loro funzionalità. C'è un crescente interesse nell'utilizzo di modelli 3D per lo studio di biologia complessa e l'esecuzione di screening della tossicità. Quando si coltivano cellule in 3D è necessario considerare molti fattori, tra cui la valutazione fenotipica del sistema modello. Un fenotipo è definito come un gruppo di caratteristiche osservabili di uno specifico organismo, come la morfologia, il comportamento, le proprietà fisiologiche e biochimiche20.
In questo protocollo, dimostriamo come gli esperimenti di proteomica possono essere condotti da pochi sferoidi e possono essere utilizzati per monitorare il fenotipo tipico del fegato. La spettrometria di massa è diventata un metodo ampiamente applicato per la caratterizzazione cellulare 3D, consentendo l'indagine di una varietà di questioni biologiche 12,16,21,22. Per un'analisi completa del proteoma, si consiglia di utilizzare almeno 20 μg di materiale di partenza proteico, da cui 1 μg viene iniettato nello spettrometro di massa. È importante ricordare che l'aggiunta di meno campione potrebbe portare a una perdita di sensibilità e l'aggiunta di più peggiorerebbe gradualmente la qualità della cromatografia e alla fine porterebbe al blocco della colonna. In questo studio, abbiamo dimostrato che gli sferoidi HepG2/C3A e THLE-3 sono arricchiti con importanti proteine provenienti dalla glicolisi e dal ciclo TCA, che sono vie epatiche specifiche e sono fondamentali per il mantenimento dei livelli di glucosio nel sangue e per la produzione di energia23,24. In realtà, l'analisi di spettrometria di massa fornisce non solo informazioni a livello proteico, ma permette anche di studiare le modificazioni post-traduzionali delle proteine, come mostrato in precedenza dal nostro gruppo16.
Un altro aspetto da considerare negli studi fenotipici 3D è il numero e la dimensione degli sferoidi. Oltre a rendere gli esperimenti più riproducibili, contare il numero di sferoidi e determinarne le dimensioni è essenziale per determinare quando dividere la coltura in più bioreattori, poiché il numero di strutture 3D all'interno di un recipiente può influire sulle dimensioni degli sferoidi e sui livelli di attività metabolica. Tuttavia, è importante sottolineare che il numero e le dimensioni degli sferoidi dipendono dalla linea cellulare, dal numero iniziale di cellule, dal processo di scissione e dal tempo di raccolta. I dettagli della coltura di sferoidi HepG2/C3A, come il numero di cellule per sferoidi, il contenuto proteico e le dimensioni in funzione dell'età, sono stati forniti da Fey, Korzeniowska e Wrzesinski25. Per un'analisi accurata e di successo utilizzando il metodo semi-automatico qui descritto, il passo più critico è una buona immagine degli sferoidi. Per semplicità, la foto può essere scattata con un telefono o un tablet, ma la sua risoluzione dovrebbe essere mantenuta il più alta possibile. Poiché le immagini sono rapide da acquisire, consentono esperimenti di screening su larga scala per visualizzare specifiche caratteristiche fenotipiche o indagare le risposte al trattamento farmacologico. Pertanto, a causa del crescente numero di saggi basati su cellule, negli ultimi 10 anni è stato sviluppato un certo numero di software open-source per l'analisi delle immagini26. In questo protocollo, descriviamo un sistema semi-automatizzato che utilizza il software FIJI18 per contare e misurare le dimensioni degli sferoidi. Abbiamo presentato degli script (semplici comandi di programmazione) per definire una sequenza di operazioni algoritmiche che possono essere applicate ad una collezione di immagini, rendendo l'analisi un processo facile e veloce. Tuttavia, a seconda delle caratteristiche dello sferoide, è necessario utilizzare una misurazione manuale. Ad esempio, se gli sferoidi sono troppo traslucidi, l'alfabeto FIJI sarà impreciso. A proposito, uno dei criteri più importanti per il funzionamento di questo metodo è la compattezza degli sferoidi. Questa caratteristica contribuirà a un contrasto di colore più elevato tra gli sferoidi e lo sfondo, necessario affinché il metodo sia accurato.
In sintesi, oltre a presentare una metodologia per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità, è stato descritto anche un sistema semi-automatizzato accoppiato alla caratterizzazione fenotipica tramite acquisizione di immagini e proteomica. Ci aspettiamo che questo toolbox per l'analisi delle cellule 3D diventi più robusto con un software di analisi delle immagini completamente automatizzato e spettrometri di massa di nuova generazione.

È stato dimostrato che le colture cellulari in vitro sono necessarie e preziose per stabilire le conoscenze fondamentali della biologia. Gran parte della comprensione scientifica in biologia e cancro in particolare è venuta dal sistema di coltura 2D, cioè cellule che crescono in un monostrato. Sebbene la coltura 2D sia stata il sistema di coltura cellulare dominante, presenta molti svantaggi che possono potenzialmente soffocare ulteriori progressi biologici. Ad esempio, le colture 2D mancano di interazioni cellula-cellula importanti per la segnalazione e la proliferazione cellulare1. Ad oggi, i sistemi di coltura 3D hanno dimostrato di modellare meglio la differenziazione, la risposta ai farmaci, l'invasione tumorale e la biologia 2,3,4,5. La modellazione 3D dei tumori maligni è particolarmente importante a causa dell'aumento dell'invecchiamento della popolazione e della mortalità per cancro. Il carcinoma epatocellulare (HCC) è una delle principali cause di mortalità correlata al cancro in tutto il mondo e spesso ha una prognosi abissale6. L'HCC è noto per avere un basso tasso di guarigione, una scarsa risposta ai farmaci e un alto tasso di recidiva 6,7,8. Sono stati sviluppati diversi modelli 3D per il fegato normale e l'HCC che imitano la fisiologia del tessuto epatico normale e maligno in vivo 9,10.
Alcuni degli attuali sistemi 3D includono sovrapposizioni liquide, bioreattori, idrogel, scaffold e strutture stampate in 3D. Gli sferoidi generati nei bioreattori offrono vantaggi unici in particolare perché imitano la distribuzione tumorale dell'esposizione ai nutrienti, dello scambio gassoso e della proliferazione/quiescenza cellulare11. I bioreattori sono particolarmente adatti per i modelli di cancro grazie alla loro facilità d'uso, all'ampia scalabilità, alla diffusione dei nutrienti e all'accessibilità11. Inoltre, i bioreattori possono consentire esperimenti ad alto rendimento, una maggiore riproducibilità e una riduzione dell'errore umano. Il bioreattore utilizzato in questo studio è unico perché simula un sistema di gravità ridotta, che riduce al minimo le forze di taglio dirompenti applicate nei tipici bioreattori, consentendo una migliore riproducibilità12. La gravità omnidirezionale e la riduzione delle forze di taglio consentono alle cellule di svilupparsi in modo più fisiologico. Come prova, le cellule HepG2/C3A cresciute con questa metodologia sviluppano organelli sferici che producono livelli in vivo di ATP, adenilato chinasi, urea e colesterolo13,14. Inoltre, i trattamenti farmacologici in questo sistema 3D sono più avanzati e automatizzati rispetto alle colture 2D. Nelle colture 2D, i trattamenti farmacologici devono spesso avere un breve decorso temporale a causa della necessità di tripsinizzare e mantenere la salute delle cellule. Tuttavia, nel nostro caso, possiamo eseguire trattamenti farmacologici a lungo termine degli sferoidi senza la necessità di interrompere la struttura e la fisiologia delle cellule. Pertanto, è necessario un passaggio dalle colture 2D a quelle 3D per modellare meglio i fenomeni biologici in vivo e l'ulteriore sviluppo scientifico.
Questo articolo presenta una metodologia per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità (Figura 1 e Figura 2) e mostra un sistema semi-automatizzato per caratterizzare fenotipicamente strutture 3D (Figura 3). A livello di immagine, forniamo informazioni sul conteggio e la misurazione dell'area degli sferoidi (Figura 3). Utilizzando metodi di spettrometria di massa, mostriamo come la proteomica può essere utilizzata per valutare specifiche funzioni biologiche (Figura 4). Raccogliendo e analizzando questi dati, speriamo di migliorare la comprensione della biologia alla base dei sistemi di coltura cellulare 3D.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481754</td><td>Punta Luer lock, graduate a 12 mL</td></tr><tr><td>1000 &; Puntali per pipette a L a foro largo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L puntali per pipette a foro largo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>piastra filtrante Orochem a 96 pozzetti</td><td>Orochem&nbsp;</td><td>OF1100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C</td><td></td></tr><tr><td>Collettore per vuoto a 96 pozzetti</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule epiteliali bronchiali (BEGM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Bioreattore per colture cellulari 3D</td></tr><tr><td>Incubatore ClinoStar Incubatore</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>CO2 per colture cellulari 3D</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Elplasia Piastra di attacco ultra-bassa a fondo tondo a 24 pozzetti contenente micropozzetti</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Corning</td><td>354052</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore HERAcell vios 160i</td><td>Thermo</td><td>51033557</td><td>CO2 per colture cellulari 2D</td></tr><tr><td>Acetonitrile di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Resin 30 &; m</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Spettrometro di massa Lumos Tribrid</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Spettrometro di massa ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Microscopio PAULA</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Victor X2 lettore di micropiastre multietichetta</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta pH</td><td>Hydrion</td><td>93</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoetanolamina</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosforico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistola pipettatrice</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Resina Reprosil-Pur</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.003</td><td>120 & Aring; dimensione dei pori, fase C18-AQ, 3 &mu; Dimensione del microscotto</td></tr><tr><td>M SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificata di grado sequenziale</td><td>Promega</td><td>V511A</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore sottovuoto SpeedVac (piastre a 96 pozzetti)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Cappuccio sterile</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>S-trap</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa (18 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14817100</td><td>3" di lunghezza, 0,05" di diametro</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA)</td><td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FSGPD10</tr></tbody></table>

analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3d funzionali

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Presentiamo un protocollo che descrive le proprietà e i vantaggi dell'utilizzo di un incubatore clinostatico autonomo per la coltivazione, il trattamento e il monitoraggio di colture cellulari 3D. Il clinostato imita un ambiente in cui le cellule possono assemblarsi come sferoidi altamente riproducibili con basse forze di taglio e diffusione attiva dei nutrienti. Dimostriamo che sia gli epatociti tumorali che quelli non tumorali (linee cellulari HepG2/C3A e THLE-3) richiedono 3 settimane di crescita prima di raggiungere funzionalità paragonabili alle cellule epatiche. Questo protocollo evidenzia la convenienza di utilizzare incubatori per cellule 3D con telecamere che monitorano la crescita cellulare, in quanto è possibile scattare istantanee per contare e misurare gli sferoidi durante il trattamento. Descriviamo il confronto tra le linee cellulari THLE-3 e HepG2/C3A, mostrando come le linee cellulari non cancerose possono essere coltivate e immortalizzate nelle cellule tumorali. Dimostriamo e illustriamo come gli esperimenti di proteomica possano essere condotti da pochi sferoidi, che possono essere raccolti senza perturbare la segnalazione cellulare, cioè senza bisogno di tripsinizzazione. Mostriamo che l'analisi proteomica può essere utilizzata per monitorare il fenotipo tipico del metabolismo della catena respiratoria e la produzione di proteine coinvolte nella detossificazione dei metalli e descriviamo un sistema semi-automatizzato per contare e misurare l'area dello sferoide. Nel complesso, il protocollo presenta una cassetta degli attrezzi che comprende una caratterizzazione fenotipica tramite acquisizione di immagini e una pipeline proteomica per sperimentare su modelli di colture cellulari 3D.

In questo protocollo, descriviamo le proprietà di un innovativo incubatore cellulare 3D senza stress, un sistema progettato specificamente per la coltura di sferoidi 3D (Figura 2). Abbiamo ottimizzato il protocollo per la coltura 3D di linee cellulari THLE-3 e HepG2/C3A. Il protocollo qui descritto è semplice da usare e consente la riproducibilità e la coltura economica di &gt; 100 sferoidi per bioreattore. Una volta nel bioreattore, gli sferoidi vengono trattati in modo simile alle cellule mantenute in coltura 2D. Le condizioni di crescita ottimali si ottengono scambiando il terreno due o tre volte alla settimana (Figura 2B) e regolando la velocità di rotazione in base alla crescita e alle dimensioni degli sferoidi (Figura 2C). Questo sistema, in cui gli sferoidi 3D vengono coltivati in bioreattori rotanti (Figura 2E,F), fornisce un ambiente di crescita ottimale per le strutture 3D esponendo lo sferoide a una quantità uguale e molto bassa di forza di taglio.
Abbiamo precedentemente mostrato come gli sferoidi possono essere utilizzati per l'analisi della modificazione della cromatina16. Qui dimostriamo in dettaglio come ottenere sferoidi epatici e come possono essere condotti esperimenti di proteomica per l'analisi dell'intero proteoma (Figura 1). In breve, il protocollo è stato avviato utilizzando cellule piatte THLE-3 o HepG2/C3A fino a quando la coltura non ha raggiunto l'80% di confluenza. Per coltivare le cellule come sferoidi, circa 2.000 cellule sono state placcate in una piastra a bassissimo attacco contenente micropozzetti per consentire loro di auto-aggregarsi, quindi gli sferoidi formati sono stati trasferiti in un bioreattore (Figura 1A). Sebbene siano funzionalmente attivi dopo 3 settimane di coltura, come dimostrato in precedenza17, mostriamo i risultati degli sferoidi raccolti dopo 36 giorni di coltura per questo protocollo. Dopo la raccolta, gli sferoidi sono stati centrifugati e sia il pellet che il surnatante sono stati conservati per l'analisi. La vitalità cellulare è stata valutata dal surnatante per la quantificazione dell'adenilato chinasi rilasciata dalle cellule danneggiate, come descritto in precedenza17. Le proteine cellulari sono state estratte dal pellet cellulare e l'intero proteoma è stato analizzato mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione (Figura 1B).
Questo protocollo dimostra anche un metodo semi-automatico per il conteggio degli sferoidi (Figura 3A) utilizzando il programma di elaborazione delle immagini pubbliche FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Per l'analisi deve essere scattata un'immagine di buona qualità dello sferoide e devono essere considerati alcuni parametri come menzionato nel paragrafo 5. Quindi, dopo aver preparato l'immagine per l'analisi, viene utilizzato uno script macro (File supplementare 1) per contare gli sferoidi. La macro funziona creando prima una cartella chiamata FIJI Spheroids counting, all'interno della cartella in cui si trovano le immagini degli sferoidi. In questa cartella vengono salvate tutte le informazioni dell'analisi; questo include un'immagine degli sferoidi che sono stati contati, con un numero ID su ogni sferoide. Include anche un file Excel chiamato conteggio degli sferoidi. Questo file contiene l'area dei pixel e il numero ID per ogni sferoide che è stato conteggiato. I dati corrispondenti a un'immagine analizzata vengono presentati in ogni scheda del file. La scheda è etichettata in base al nome dell'immagine analizzata. Poiché le dimensioni degli sferoidi possono essere compromesse da molti fattori, tra cui il numero di strutture all'interno di un vaso e il trattamento farmacologico, è anche importante monitorare la loro superficie (planimetria). Lo script macro qui presentato (File supplementare 2) funziona misurando le aree nere, che corrispondono agli sferoidi nell'immagine (Figura 3B). L'output viene raccolto in un file chiamato planimetry.xlsx, che contiene l'area, il perimetro e il diametro misurati di ogni sferoide. C'è anche una misura chiamata Feret, utilizzata per calcolare il diametro. Feret è il diametro più lungo possibile, mentre minFeret è il più corto. Il diametro è la media di questi due. All'interno della cartella di output, oltre al file planimetry.xlsx, c'è anche un'immagine degli sferoidi che sono stati misurati.
Prima di procedere all'analisi del proteoma, è stata valutata la vitalità degli sferoidi nel corso del tempo di coltura. I livelli di AK aumentano fino al giorno 17, raggiungendo circa il 7% della morte cellulare, e poi la morte diminuisce a livelli inferiori al 5% (Figura 4A), che è in accordo con il lavoro precedentemente pubblicato17. Questo protocollo mostra anche l'analisi completa del proteoma per il monitoraggio del fenotipo cellulare. In primo luogo, sono stati confrontati i proteomi delle cellule piatte e degli sferoidi THLE-3 e HepG2/C3A. Analizzando il primo componente principale (PC1), è evidente che esiste una rigorosa separazione dei campioni di sferoidi dalle colture cellulari piatte e sembra che la correlazione del tipo di cellula (THLE-3 e HepG2/C3A) non sia rilevante (Figura 4B). Sebbene gli sferoidi THLE-3 e HepG2/C3A non si raggruppino insieme, condividono profili simili coerenti con la funzionalità epatica. Dimostriamo in questo protocollo l'esempio delle metallotioneine, che hanno un ruolo nella disintossicazione dei metalli effettuata dal fegato. Nell'analisi proteomica sono state identificate 2 isoforme sovraespresse negli sferoidi rispetto alle cellule piatte (MT1E e MT1X) (Figura 4C). Mostriamo anche l'arricchimento dell'ontologia genica (GO) di entrambe le linee cellulari cresciute come sferoidi. Il processo metabolico dei carboidrati, che comprende il ciclo dell'acido tricarbossilico (ciclo TCA), la catena di trasporto degli elettroni (respirazione cellulare) e il metabolismo del piruvato, è un termine frequente ed è arricchito sia negli sferoidi HepG2/C3A che THLE-3 (Figura 4D,E). La disintossicazione cellulare, gli acidi grassi e il metabolismo del colesterolo sono altre funzioni arricchite in entrambi gli sferoidi. Insieme, queste funzioni sono note per essere cruciali per la funzionalità epatica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro per la coltura di sferoidi e la preparazione del campione . (A) Approccio sperimentale di colture cellulari 3D. Le colture cellulari piatte alla confluenza desiderata sono state tripsinizzate e seminate su una piastra a 24 pozzetti a bassissimo attacco contenente micropozzetti, dove le cellule si auto-assemblano in sferoidi. Dopo 24 ore, gli sferoidi sono stati trasferiti in un bioreattore e coltivati fino a quando non sono pronti per l'analisi. (B) Dopo la raccolta, gli sferoidi sono stati pellettati e sia il pellet che il surnatante di coltura sono stati conservati fino alla lavorazione. Gli istoni16e le proteine non istoniche sono stati estratti, digeriti in peptidi e analizzati mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione. I file grezzi ottenuti dalla spettrometria di massa sono stati confrontati con il database umano e i dati sono stati ulteriormente elaborati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Figura 2: Sistema di coltura cellulare 3D . (A) Parti del bioreattore. Il bioreattore è composto da una camera di scambio gassoso e umidificazione contenente perle d'acqua e da una camera cellulare apribile con due tappi per lo scambio di terreni e la raccolta degli sferoidi. (B) Scambio di terreni per bioreattori. Il bioreattore viene riempito con 10 mL di terreno di coltura utilizzando una siringa con un ago. (C) L'app di controllo del sistema. La velocità di rotazione, il livello di CO2, la temperatura, il registro degli allarmi e altre funzionalità possono essere controllate utilizzando l'unità di controllo. (D) Posizionamento del bioreattore nell'incubatore 3D. Ogni bioreattore ha un motore associato che può far girare lentamente il bioreattore. (E) Bioreattore in movimento con la velocità (giri/min) controllata da una compressa (C). La velocità (giri/min) viene regolata in base alle dimensioni degli sferoidi. (F) Bioreattori all'interno dell'incubatore 3D. L'incubatore 3D può ospitare fino a 6 bioreattori controllati individualmente. Foto per gentile concessione di Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Figura 3: Caratterizzazione fenotipica degli sferoidi tramite acquisizione di immagini . (A) Conta semiautomatica degli sferoidi. Dopo aver scattato istantanee degli sferoidi nel bioreattore, l'immagine viene preparata per l'analisi nelle FIJI. Ogni sferoide viene contato e per ciascuno di essi viene fornito un numero ID. Viene utilizzata una macro e vengono visualizzati i risultati che mostrano l'ID per lo sferoide conteggiato, l'etichetta (nome dell'immagine analizzata) e l'area (il numero di pixel contati nello sferoide). (B) Determinazione planimetrica dell'area sferoidale. Utilizzando una macro, vengono determinati l'area, il perimetro e il diametro di uno sferoide specifico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Figura 4: Analisi del proteoma degli sferoidi epatici . (A) La vitalità degli sferoidi è stata calcolata in base al rilascio di adenilato chinasi (AK) sul surnatante della coltura. I risultati sono la media di punti dati duplicati ± SD. (B) L'analisi delle componenti principali (PCA) è stata eseguita per confrontare il proteoma di cellule piatte e sferoidi THLE-3 e HepG2/C3A. (C) Abbondanza relativa di metallotioneine, che sono proteine espresse dal fegato umano. I dati sono rappresentati come medie ± SEM. (D) Le reti funzionalmente raggruppate mostrano l'arricchimento di GO per gli sferoidi HepG2/C3A e (E) gli sferoidi THLE-3, dove viene mostrata solo l'etichetta del termine più significativo per gruppo. La rete è stata costruita utilizzando ClueGo19. La dimensione del nodo rappresenta il significato dell'arricchimento del termine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Script macro per il conteggio degli sferoidi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 2: Macro per la determinazione planimetrica degli sferoidi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Presentiamo un protocollo per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità e la loro caratterizzazione fenotipica utilizzando l'acquisizione di immagini e la proteomica.

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Questo protocollo dimostra come far crescere sferoidi altamente riproducibili e mostra come possono essere condotti esperimenti proteomici per caratterizzare la funzione biologica delle strutture 3D. La nostra coltura 3D può produrre simultaneamente centinaia di repliche biologiche nello stesso bioreattore e l'approccio LC-MS può misurare l'abbondanza di migliaia di proteine in un singolo esperimento. A dimostrare la procedura sarà Stephanie Stransky, una postdoc del laboratorio.Per iniziare, prendi la sospensione di cellule HepG2/C3A e THLE-3. Contare il numero di cellule e diluire la sospensione cellulare in un terreno di coltura completo per ottenere 1 milione di cellule in un volume massimo di 1,5 millilitri. Lavare i pozzetti di una piastra inferiore rotonda a 24 pozzetti con 0,5 millilitri di terreno di coltura e centrifugare a 3.000 g per cinque minuti.Trasferire la sospensione cellulare nella piastra e centrifugarla per tre minuti a 120 g. Quindi, incubare la piastra per avviare la formazione di sferoidi. Successivamente, equilibrare il bioreattore 24 ore prima di trasferire gli sferoidi riempiendo la camera di umidità con 25 millilitri di acqua sterile e la camera cellulare con nove millilitri di terreno di coltura utilizzando una siringa da 10 millilitri con un ago lungo.Quindi, posizionare il bioreattore in un incubatore 3D per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Pipettare delicatamente gli sferoidi su e giù utilizzando punte con foro largo un millilitro per staccarli dalla piastra di attacco ultra-bassa e trasferirli in un piatto di coltura tissutale. Per catturare eventuali sferoidi rimanenti, lavare la piastra con 0,5 millilitri di terreno di coltura preriscaldato e trasferirli nel piatto di coltura.Utilizzando un microscopio ottico, valutare le dimensioni, la compattezza e la rotondità degli sferoidi per selezionare quelli adeguatamente formati. Trasferire lo sferoide selezionato nel bioreattore equilibrante riempito con cinque millilitri di terreno di coltura fresco. Quindi, riempi l'intero bioreattore con nuovi terreni di crescita.Posizionare il bioreattore nell'incubatore 3D e regolare la velocità di rotazione utilizzando l'unità di controllo. Sostituisci 10 millilitri di terreno di coltura vecchio con 10 millilitri di terreno fresco ogni due o tre giorni. Modificare la velocità di rotazione ogni volta dopo aver sostituito il supporto.Coltiva gli sferoidi per 15 giorni e dividili tra due bioreattori freschi. Apri l'app 3D installata sul tablet, seleziona il bioreattore e acquisisci l'immagine. In alternativa, posizionare uno sfondo nero dietro il bioreattore e assicurarsi che la luce non venga riflessa sulla camera cellulare.Cattura l'immagine il più vicino possibile al bioreattore. Quindi, raccogliere gli sferoidi rimuovendo cinque millilitri di terreno dal bioreattore utilizzando una siringa attaccata a un lungo ago attraverso la porta superiore. Assicurarsi che gli sferoidi scendano verso il basso al centro del bioreattore.Ora, apri la porta anteriore e raccogli gli sferoidi usando una punta larga un millilitro. Trasferire questi sferoidi in provette da microcentrifuga, centrifugare a 500 g per cinque minuti e smaltire il terreno. Lavare lo sferoide aggiungendo 200 microlitri di HBSS per rimuovere l'FBS.Successivamente, eseguire la centrifugazione a 500 g per cinque minuti e scartare il surnatante. Quindi, immergere rapidamente il pellet sferoidale in azoto liquido per congelarlo e conservare questo pellet congelato a meno 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione. Per lisare le cellule, prelevare una provetta di sferoidi raccolti e risospenderli in 25 microlitri di SDS al 5%.Omogeneizzare il pellet pipettando su e giù. Successivamente, sciogliere un microgrammo di campioni e 10 microlitri di acido tricloroacetico allo 0,1%. Dopo aver estratto la proteina e pulito i campioni, impostare il metodo di acquisizione MS per generare gli spettri MS/MS dai segnali peptidici identificati.Quindi, trasferire la piastra nell'autocampionatore per cromatografia liquida da nanolitri. Impostare la scansione MS completa su un rapporto massa-carica compreso tra 300 e 1, 100 nell'Orbitrap. Regolare la risoluzione a 120000 e impostare l'obiettivo di controllo automatico del guadagno su 125.Quindi, impostare MS/MS nell'Orbitrap con una finestra di isolamento sequenziale di 50 rapporto massa/carica. Puntare il target di controllo automatico del guadagno a 400 e impostare un'energia di dissociazione collisionale di energia più elevata di 30. Secondo l'analisi di vitalità degli sferoidi, i livelli di adenilato chinasi aumentano fino al giorno 17, con conseguente morte cellulare di circa il 7%.Successivamente, il tasso di mortalità scende al di sotto del 5%Inoltre, un'analisi del primo componente principale rivela una chiara distinzione tra campioni di sferoidi e colture cellulari piatte. L'analisi proteomica ha indicato che gli sferoidi THLE-3 e HepG2/C3A hanno profili simili che riflettono la funzionalità epatica. Inoltre, gli sferoidi hanno mostrato una sovraespressione di due isoforme di metallotioneine rispetto alle cellule piatte.Le reti funzionalmente raggruppate hanno mostrato l'arricchimento dell'ontologia genica per il processo metabolico dei carboidrati nelle sfere HepG2/C3A e THLE-3. Per evitare fuoriuscite di terreno di coltura, non aprire o chiudere la porta anteriore quando la camera cellulare è completamente piena di liquido. La preparazione e l'analisi del campione descritte in questo protocollo possono essere utilizzate per esplorare il proteoma della coltura cellulare utilizzando metodi 2D e 3D, nonché campioni di tessuto.

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