Name: Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri le pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza come DNA hairpin e complessi SNARE. Questo metodo a 1,2 kHz permette di studiare eventi meccanobiologici in tempo reale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 e NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. è stato sostenuto dalla sovvenzione NRF (2021R1C1C2009717).

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

In questo lavoro, abbiamo introdotto una configurazione di spettroscopia di forza a singola molecola in grado di osservare i cambiamenti strutturali delle biomolecole ad alta precisione spaziotemporale. La telecamera CMOS ad alta velocità utilizzata acquisisce 1.200 fotogrammi s-1 con risoluzione 1.280 x 1.024, consentendo il tracciamento delle perline a 1,2 kHz. Tuttavia, la velocità delle misurazioni è attualmente limitata dal software di tracciamento delle perline, quindi il ROI è in genere ridotto ad aree ...

Le cellule percepiscono attivamente e rispondono agli stimoli meccanici. In tal modo, molte biomolecole mostrano proprietà dipendenti dalla forza che consentono cambiamenti strutturali dinamici. Esempi ben apprezzati includono canali ionici meccanosensibili ed elementi citoscheletrici che forniscono alle cellule informazioni meccaniche chiave dall'ambiente circostante.
Inoltre, le molecole che mostrano una natura portante unica possono anche essere considerate meccanosensibili in un senso più ampio. Ad esempio, la formazione locale e la fusione di duplex di acidi nucleici, così come strutture di ordine superiore come i G-quadruplex, svolgono ruoli cruciali nella replicazione, nella trascrizione, nella ricombinazione e, più recentemente, nell'editing del genoma. Inoltre, alcune proteine neuronali coinvolte nelle comunicazioni sinaptiche svolgono le loro funzioni generando forze fisiche che superano i livelli delle tipiche interazioni intermolecolari. Indipendentemente dall'esempio studiato, lo studio della nanomeccanica delle biomolecole coinvolte con elevata precisione spaziotemporale si rivelerà molto utile per rivelare i meccanismi molecolari dei processi meccanobiologici associati 1,2,3.
I metodi di spettroscopia di forza a singola molecola sono serviti come potenti strumenti per esaminare le proprietà meccaniche delle biomolecole 2,4,5,6. Possono monitorare i cambiamenti strutturali negli acidi nucleici e nelle proteine in concomitanza con l'applicazione della forza, esaminando così le proprietà dipendenti dalla forza. Due configurazioni ben note sono le pinzette ottiche e le pinzette magnetiche (MT), che impiegano perline di dimensioni micron per manipolare le molecole 5,6,7,8. In queste piattaforme, il polistirene (per le pinzette ottiche) o le perle magnetiche (per le MT) sono legati alle molecole bersaglio (ad esempio, acidi nucleici e proteine) tramite "maniglie" molecolari, tipicamente costituite da brevi frammenti di DNA a doppio filamento (dsDNA). Le perle vengono quindi spostate per esercitare forza e visualizzate per tracciare le loro posizioni che riportano i cambiamenti strutturali nelle molecole bersaglio. Le pinzette ottiche e magnetiche sono in gran parte intercambiabili nelle loro applicazioni, ma esistono importanti differenze nei loro approcci al controllo della forza. Le pinzette ottiche sono strumenti intrinsecamente posizionati che intrappolano le perline in posizione, a causa delle quali la forza applicata fluttua quando un costrutto bersaglio subisce cambiamenti di forma; L'aumento dell'estensione, ad esempio dall'apertura, allenta il cavo e riduce la tensione e viceversa. Sebbene il feedback attivo possa essere implementato per controllare la forza nelle pinzette ottiche, gli MT al contrario funzionano naturalmente come un dispositivo di morsetto, sfruttando le forze magnetiche stabili e a campo lontano da magneti permanenti, che possono anche resistere alle perturbazioni ambientali.
Nonostante la loro lunga storia e il design semplice, le MT sono rimaste indietro rispetto alle pinzette ottiche nelle loro applicazioni a misurazioni ad alta precisione, in gran parte a causa delle sfide tecniche nel tracciamento rapido delle perline. Recentemente, tuttavia, diversi gruppi hanno condotto congiuntamente un miglioramento multiforme sia dell'hardware che del software per gli strumenti MT 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . In questo lavoro, presentiamo un esempio di tale configurazione in esecuzione a 1,2 kHz e descriviamo come usarla per eseguire misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza. Come sistemi modello, utilizziamo forcine di DNA e complessi SNARE neuronali ed esaminiamo i loro rapidi cambiamenti strutturali nel regime di Piconewton. Le forcine per capelli in DNA mostrano semplici transizioni a due stati in un intervallo di forza ben definito20,21, e quindi servono come modelli giocattolo per verificare le prestazioni di una configurazione pinzetta. Poiché le proteine SNARE si assemblano in un complesso sensibile alla forza che guida la fusione di membrana22, sono state anche ampiamente studiate mediante spettroscopia di forza a singola molecola 14,23,24,25. Vengono presentati approcci standard per l'analisi dei dati e l'estrazione di informazioni utili sulla termodinamica e sulla cinetica. Speriamo che questo articolo possa facilitare l'adozione di MT ad alta precisione negli studi meccanobiologici e motivare i lettori a esplorare i propri sistemi di interesse sensibili alla forza.

pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Le pinzette magnetiche a singola molecola (MT) sono servite come potenti strumenti per interrogare con forza le biomolecole, come gli acidi nucleici e le proteine, e sono quindi pronte per essere utili nel campo della meccanobiologia. Poiché il metodo si basa comunemente sul tracciamento basato su immagini delle sfere magnetiche, il limite di velocità nella registrazione e nell'analisi delle immagini, così come le fluttuazioni termiche delle perle, ha a lungo ostacolato la sua applicazione nell'osservazione di piccoli e veloci cambiamenti strutturali nelle molecole bersaglio. Questo articolo descrive metodi dettagliati per la costruzione e il funzionamento di una configurazione MT ad alta risoluzione in grado di risolvere dinamiche su scala nanometrica e millisecondi delle biomolecole e dei loro complessi. Come esempi applicativi, vengono dimostrati esperimenti con forcine di DNA e complessi SNARE (meccanismo di fusione a membrana), concentrandosi su come i loro stati transitori e transizioni possono essere rilevati in presenza di forze su scala piconewton. Ci aspettiamo che le MT ad alta velocità continueranno a consentire misurazioni nanomeccaniche ad alta precisione su molecole che rilevano, trasmettono e generano forze nelle cellule, e quindi approfondiscono la nostra comprensione a livello molecolare della meccanobiologia.

Calibrazione della forza I risultati dei due metodi di misurazione della forza (varianza dello spostamento laterale delle perle e analisi dello spettro di potenza) differivano di 0-2 pN (Figura 2G). Secondo i risultati della Figura 2F, possiamo raggiungere in modo affidabile fino a 30 pN con magneti al neodimio regolari.
Transizioni a due stati di una forcina di DNA da 8 bp Per prima cosa abbiam...

Qui, descriviamo una configurazione di pinzette magnetiche ad alta velocità che esegue misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza alla velocità massima di 1,2 kHz. Presentiamo la sua applicazione a forcine di DNA e complessi SNARE come sistemi modello, ma sarà applicabile anche ad altre molecole coinvolte in eventi meccanobiologici.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Le biomolecole subiscono piccoli e rapidi cambiamenti strutturali spesso in risposta alla forza. Le pinzette magnetiche ad alta risoluzione possono esplorare queste dinamiche sotto forze fisiologicamente rilevanti. Poiché il metodo effettua misurazioni su scala nanometrica con precisione al millisecondo, è possibile monitorare i sottili cambiamenti negli acidi nucleici e nelle proteine in tempo reale.Malfunzionamenti nelle proteine di primo cuscinetto e meccanosensibili possono potenzialmente portare a disturbi cardiovascolari e muscoloscheletrici. Le pinzette magnetiche possono fornire informazioni sui meccanismi di funzionamento di queste proteine. Il set deve essere opportunamente allineato e calibrato per ottenere buone risoluzioni.Inoltre, è necessario prestare attenzione durante la preparazione e l'identificazione dei costrutti molecolari per le misurazioni. Inizia installando un microscopio invertito su un tavolo ottico antivibrante. Quindi, installare una fotocamera CMOS ad alta velocità e un frame grabber.Montare verticalmente uno stadio lineare motorizzato con una lunghezza di corsa superiore a 20 millimetri su uno stadio XY manuale per costruire uno stadio di traslazione

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In questo articolo si descrivono l'uso di una pinzetta magnetici per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica a livello di singola molecola in modo altamente parallelizzabile.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

Abbiamo misurato il rilascio della tensione in un assone, parzialmente lesionati con un dissettore laser per la misurazione simultanea della spettroscopia di forza eseguita su una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell'assone. Il protocollo sperimentale sviluppato valuta l'assone adesione al substrato cultura.

Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione

Pinzette magnetiche, una potente tecnica di manipolazione singola molecola, possono essere adattati per le misure dirette della torsione (utilizzando una configurazione denominata liberamente orbitante pinzette magnetiche) e coppia (utilizzando una configurazione definita pinzette coppia magnetica) in macromolecole biologiche. Linee guida per l'esecuzione di tali misure sono espresse, comprese le applicazioni allo studio del DNA e associati filamenti nucleo-proteine.

Pinzetta magnetici per la misurazione di Twist and Torque

Una piattaforma di singola molecola magnetico pinzette per manipolare G-quadruplex è segnalata, che permette per lo studio della stabilità di G4 e regolamento di varie proteine.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

La microscopia a forza magnetica (MFM) impiega una sonda di microscopia a forza atomica magnetizzata verticalmente per misurare la topografia del campione e l'intensità del campo magnetico locale con risoluzione su scala nanometrica. L'ottimizzazione della risoluzione spaziale e della sensibilità MFM richiede il bilanciamento dell'altezza di sollevamento decrescente con l'aumento dell'ampiezza dell'azionamento (oscillazione) e trae vantaggio dal funzionamento in un vano portaoggetti in...

Ottimizzazione della risoluzione e della sensibilità al microscopio a forza magnetica per visualizzare domini magnetici su scala nanometrica

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di pinzette magnetiche a singola molecola per studiare le interazioni tra le proteine telomeriche leganti il DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e i lunghi telomeri estratti da cellule umane. Descrive le fasi preparatorie per i telomeri e i fattori di legame ripetuto telomerico, l'esecuzione di esperimenti su singole molecole e i metodi di raccolta e analisi dei dati.

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l'utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ​​ordinate e disordinate.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Qui descriviamo un protocollo semplice per produrre rapidamente centinaia di agar media di crescita del nematode, piastre di coltura 96 pozzetti con un numero consistente di Caenorhhabditis elegans per pozzetto. Queste culture sono utili per lo screening fenotipico di interi organismi. Qui ci concentriamo sull'utilizzo di queste culture ai prodotti chimici schermo per effetti di pro-longevità.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Qui presentiamo un protocollo della intero-cellula elettrochimici esperimenti per studiare il contributo del trasporto di protoni per il tasso di trasporto dell'elettrone extracellulare attraverso il membrana esterna citocromi complessi di Shewanella oneidensis MR-1.

Elettrochimico rilevamento di deuterio isotopo effetto cinetico su extracellulare di trasporto dell'elettrone nella Shewanella oneidensis MR-1

Scopri le pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza come DNA hairpin e complessi SNARE. Questo metodo a 1,2 kHz permette di studiare eventi meccanobiologici in tempo reale.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

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