Isolamento, coltura e caratterizzazione di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano
28 luglio 2023
Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per stabilire fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.
L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sui cheloidi. I fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca cheloide. Iniziare utilizzando pinzette sterili per posizionare il tessuto cheloide in un tubo da centrifuga sterile da 50 millilitri contenente da 10 a 25 millilitri di PBS integrato con 1% PSA.
Nel frattempo, aggiungere quattro millilitri di soluzione PSA PBS a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Ora estrarre il tessuto dal tubo e lavare due volte con la soluzione PBS PSA. Utilizzando un paio di pinze sterili, trasferire il tessuto in sequenza da un pozzetto all'altro.
Quindi rimuovere gli strati adiposo ed epidermico con le forbici chirurgiche, lasciando intatto il derma. Utilizzare un paio di forbici per sezionare il derma tagliato in pezzi da tre a cinque millimetri quadrati e trasferire i pezzi al pozzetto successivo con un paio di pinze sterili. Lavare i pezzi in soluzione PBS PSA.
Utilizzando una pinza sterilizzata, posizionare da 10 a 30 pezzi di tessuto dermico distanziati di meno di cinque millimetri in piastre di Petri. Mettere i piatti capovolti in un'incubatrice fino a quando i pezzi si asciugano e si attaccano al piatto. Quindi, aggiungere sette millilitri di DMEM integrato con 10% FBS e 1% PSA e incubare i piatti come prima.
Dopo tre giorni, sostituire metà del surnatante con terreno di coltura completo. Osservare i fibroblasti ogni giorno sotto un ingrandimento microscopico 40X. Rimuovere i pezzi di tessuto nel terreno di coltura quando i fibroblasti raggiungono il 90% di confluenza.
Lavare i fibroblasti in PBS e aggiungere due millilitri di soluzione sterile di tripsina EDTA. Dopo aver incubato le cellule in un incubatore umidificato, picchiettare delicatamente il piatto di coltura e osservarlo al microscopio. Aggiungere due millilitri di mezzo completo per terminare la digestione una volta che la maggior parte delle cellule si sono staccate.
Ora trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri e centrifugare la provetta a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente. Scartare attentamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo completo. Seminare i fibroblasti in un piatto di coltura cellulare di nove centimetri e incubare in un incubatore umidificato.
Per eseguire l'analisi immunofluorescente dopo aver coltivato i fibroblasti su vetrini rotondi e averli incubati in anticorpi primari e secondari, aggiungere 50 microlitri di soluzione DAPI al vetrino per colorare i nuclei cellulari. Posizionare le copertine lavate su vetrini con una pinza. Infine, trasferire i campioni in una scatola scura bagnata per la microscopia fluorescente.
Le escrescenze di fibroblasti del tessuto sono state osservate cinque giorni dopo l'elaborazione. I fibroblasti hanno mostrato alti tassi di proliferazione e hanno raggiunto la confluenza dopo 10 giorni. I fibroblasti avevano corpi cellulari allungati e simili a fusi, che erano allineati in fasci ad alta confluenza.
La colorazione immunofluorescente ha restituito immunofluorescenza rossa positiva dei fibroblasti e immunofluorescenza blu del nucleo cellulare. I test citometrici a flusso hanno mostrato positività CD90 in quasi tutti i fibroblasti. Questo studio ha descritto un metodo ottimizzato e fornito istruzioni chiare per risolvere le sfide esistenti e aumentare le possibilità di successo per l'isolamento e la coltura dei fibroblasti cheloidi.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per l'isolamento di fibroblasti primari da tessuti cheloidei, in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali. L'isolamento e la coltura di questi fibroblasti sono essenziali per far progredire la ricerca sui cheloidi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Cultura cellulare
- Isolamento dei fibroblasti
- Ricerca sui cheloidi
Sfondo
- I cheloidi sono cicatrici anomale che possono essere difficili da studiare.
- I fibroblasti primari sono fondamentali per comprendere la biologia dei cheloidi.
- I protocolli esistenti potrebbero non garantire una viabilità cellulare sufficiente.
- Questo studio mira a migliorare il processo di isolamento.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per isolare fibroblasti da tessuti cheloidei.
- Fornire una fonte stabile di fibroblasti per la ricerca di laboratorio.
- Migliorare la comprensione della formazione e del trattamento dei cheloidi.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di pinze sterili e provette da centrifuga per la manipolazione dei tessuti.
- Lavaggio del tessuto cheloide con PBS integrato con 1% PSA.
- Trasferimento sequenziale del tessuto tra pozzetti in una piastra a sei pozzetti.
- Stabilimento delle condizioni di coltura per la crescita dei fibroblasti.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di fibroblasti vitali da tessuti cheloidei.
- Il protocollo fornisce una fonte abbondante di cellule per la ricerca.
- I fibroblasti hanno mantenuto stabilità e vitalità nel tempo.
- Ha facilitato ulteriori studi sulla biologia dei cheloidi.
Conclusioni
- Il protocollo ottimizzato è efficace per l'isolamento dei fibroblasti.
- Fornisce una base per future ricerche sui cheloidi.
- Migliora il potenziale per progressi terapeutici nel trattamento dei cheloidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento e la coltura affidabili di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloideo rispondono a un'esigenza fondamentale di modelli cellulari pertinenti alla malattia nella scoperta precoce di farmaci. Questo protocollo consente un accesso costante a popolazioni pure e validate di fibroblasti, sostenendo studi meccanicistici e la validazione di bersagli per le patologie fibrotiche della pelle. L'approccio migliora la fiducia predittiva e la continuità traslazionale nei test di ipotesi terapeutiche nei progetti di ricerca sui cheloidi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette l'analisi dei percorsi mediati dai fibroblasti coinvolti nella patogenesi dei cheloidi.
- Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo cellule primarie validate funzionalmente.
- Facilita studi meccanicistici per chiarire il ruolo di specifici bersagli nelle malattie fibrotiche.
- Migliora l'affidabilità predittiva per le decisioni di triage precoce del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una fonte riproducibile di fibroblasti primari per la standardizzazione dei saggi.
- Permette lo sviluppo di saggi quantitativi basati su cellule per la valutazione di composti.
- Supporta la riproducibilità e la scalabilità nei flussi di lavoro di screening.
- Riduce la variabilità minimizzando contaminazioni e mescolanze con cellule non fibroblastiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli in vitro a tipi cellulari umani pertinenti alla malattia per studi traslazionali.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica nella ricerca sui cheloidi.
- Supporta l'avanzamento di candidati antifibrotici con valutazione del rischio.
- Fornisce una piattaforma per la scoperta e la validazione di biomarcatori quando supportata da studi successivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo colloca l'isolamento dei fibroblasti primari da cheloide all'interfaccia tra scoperta precoce e ricerca preclinica, consentendo una valida conferma del bersaglio e lo sviluppo di saggi per percorsi terapeutici rivolti alle malattie fibrotiche della pelle.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi coinvolti nella patogenesi dei cheloidi.
- Screening: Fornisce sistemi cellulari validati e riproducibili per lo sviluppo di saggi quantitativi.
- Analisi: Permette la caratterizzazione basata su immunofluorescenza e citometria a flusso per confermare l'identità cellulare.
- Ricerca traslazionale: Mette a disposizione modelli cellulari pertinenti alla malattia per la valutazione preclinica di potenziali terapie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato adattabile tra diversi gruppi di ricerca e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sui cheloidi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro con cellule primarie.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento/cessazione e l'efficienza del capitale nei programmi precoci.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di asset antifibrotici con adeguamento ai rischi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione sterile dei tessuti e nelle tecniche di coltura cellulare primaria.
- Necessita dell'accesso a strutture per la coltura cellulare, immunofluorescenza e strumentazione per la citometria a flusso.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule riproducibili.
- Potrebbe richiedere adattamenti per altre fonti di tessuto fibrotico o dermico.
- Le limitazioni potenziali includono la variabilità tra donatori e la disponibilità del tessuto.
