Name: Isolamento, coltura e caratterizzazione di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per isolare e coltivare fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano. Questo metodo fornisce una fonte stabile e vitale di cellule per studiare la biologia dei cheloidi e sviluppare nuove terapie.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 81903189 e 82073418) e della Science and Technology Foundation di Guangzhou (numero di sovvenzione 202102020025).

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del Dermatology Hospital, Southern Medical University (2020081). Il consenso informato del paziente è stato ottenuto prima che i tessuti fossero raccolti dagli individui.
1. Preparazione
NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in ambiente sterile sotto un armadio di sicurezza biologica.
<ol><li>Preparare un terreno di coltura completo aggiungendo il 10% di siero bovino fetale (FBS) e la soluzione di penicillina-streptomicina-amfotericina B (PSA) all'alto contenuto di glucosio del terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM).</li>
	<li>Preparare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con PSA aggiungendo l'1% di PSA in 1x PBS. Prepara PBS con FBS aggiungendo l'1% di FBS a 1x PBS.</li>
	<li>Preparare diverse forbici sterilizzate, pinze e bisturi in autoclave.</li>
</ol>2. Ottenere i tessuti rimossi
<ol><li>Ottenere tessuti da pazienti cheloidi attraverso la chirurgia. Raccogliere i tessuti cheloidi freschi in un sacchetto di imballaggio sterile o in una provetta da centrifuga sterile e trasferirli in un armadio di sicurezza biologica in laboratorio il prima possibile. NOTA: In questo protocollo, la dimensione del tessuto cheloide acquisito era di circa ~ 20 x 20 x 10 mm3 e la dimensione può variare a seconda dell'intervento chirurgico.</li>
</ol>3. Isolamento
<ol><li>Estrarre il tessuto cheloide con una pinzetta sterile e metterlo in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml contenente 10-25 ml di PBS con PSA all'1% per 10 minuti. Quindi, preparare una piastra a 6 pozzetti e aggiungere 4 ml di PBS integrato con PSA all'1% a ciascun pozzetto. Estrarre il tessuto con una pinzetta sterilizzata e lavarlo due volte con PBS integrato con PSA all'1%. Utilizzando una pinza sterile, trasferire il tessuto in sequenza da un pozzetto all'altro.</li>
	<li>Rimuovere gli strati adiposi dell'epidermide usando forbici chirurgiche o un bisturi chirurgico e lasciare intatto lo strato del derma. Tagliare e sezionare lo strato del derma in 3-5 mm2 pezzi con le forbici, trasferire questi pezzi con una pinza sterile al pozzetto successivo e lavarli nuovamente in PBS con una soluzione di PSA all'1%.</li>
</ol>4. Cultura
<ol><li>Posizionare i pezzi di tessuto del derma in piastre di Petri usando una pinza sterilizzata; Assicurarsi che il numero di pezzi sia compreso tra 10 e 30 e che la distanza tra ogni pezzo sia >5 mm. Mettere le piastre di Petri capovolte in un'incubatrice al 5% di CO2 a 37 °C per 30-60 minuti fino a quando i pezzi di tessuto si asciugano un po 'e si attaccano alla capsula di Petri. Quindi, aggiungere DMEM integrato con FBS al 10% e PSA all'1% e posizionare con cura le piastre di Petri in un incubatore al 5% di CO2 a 37 ° C. NOTA: I fibroblasti sono una popolazione cellulare morfologicamente e funzionalmente eterogenea. Considerando questa complessità, le fasi di isolamento e cultura dovrebbero essere eseguite con cura; selezionare uniformemente i pezzi di tessuto dermico cheloide e mescolare bene questi pezzi prima di metterli nella capsula di Petri.</li>
	<li>Dopo 3 giorni, sostituire metà del surnatante con un terreno di coltura completo. Cambia il terreno di coltura ogni 2-3 giorni. Osservare i fibroblasti al microscopio con un ingrandimento 40x ogni giorno. NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti delicatamente. Non spostare la capsula di Petri per 2 giorni dopo l'isolamento, poiché i pezzi di tessuto richiedono tempo per aderire alle piastre di Petri.</li>
	<li>Quando i fibroblasti che crescono intorno ai pezzi di tessuto raggiungono circa il 90% di confluenza, rimuovere i pezzi di tessuto e il terreno di coltura. Lavare i fibroblasti con 1x PBS sterile e aggiungere 2 ml di soluzione sterile 1x tripsina-EDTA alle piastre. Incubare le cellule per circa ~3-5 minuti a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 . Picchiettare delicatamente il piatto di coltura e osservarlo al microscopio. Quando la maggior parte delle cellule si stacca dalla piastra, aggiungere 2 ml di mezzo completo per terminare il processo di digestione.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare la provetta a 300 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare attentamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo completo. Seminare i fibroblasti in un piatto di coltura cellulare di 9 cm e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .</li>
</ol>5. Manutenzione e conservazione
<ol><li>Circa 3-4 giorni dopo, quando i fibroblasti sono cresciuti fino all'80% di confluenza, ripetere i passaggi 4,2-4,4 e far passare i fibroblasti con un rapporto di 1:3. Utilizzare i fibroblasti di passaggio per ulteriori esperimenti. NOTA: La coltura di fibroblasti deve essere interrotta dopo 10 passaggi, perché le cellule possono iniziare a mostrare caratteristiche modificate rispetto alle cellule originali.</li>
	<li>Crioconservare le cellule passate di P1-P3 in azoto liquido per un ulteriore utilizzo.<ol><li>Ripetere i passaggi 4.2-4.3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da centrifuga da 15 mL e centrifugare la provetta per 3 minuti a 300 × g. Scartare il surnatante con attenzione, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di congelamento cellulare contenente il 90% di FBS e il 10% di DMSO e trasferire la sospensione nei criotubi cellulari.</li>
		<li>Spostare le celle in una scatola congelata, quindi mettere la scatola congelata in un congelatore a -80 °C. Dopo 1 giorno, trasferire le cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Identificazione dei fibroblasti mediante colorazione con immunofluorescenza
<ol><li>Posizionare i vetrini rotondi in una piastra a 24 pozzetti e coltivare i fibroblasti passaggi ad una concentrazione di 1 × 104 cellule / pozzetto. Quando i fibroblasti raggiungono il 60% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% per fissare i fibroblasti per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare 3 volte con PBS per 1 minuto ogni volta. NOTA: Contare il numero di cellule utilizzando un vetrino emocitometrico al microscopio o un contatore automatico delle cellule.</li>
	<li>Rimuovere il PBS, incubare con Triton X-100 allo 0,5% per 20 minuti per la permeabilizzazione delle membrane cellulari, quindi lavare 3 volte con PBS per 1 minuto ogni volta. Aggiungere PBS con albumina sierica bovina allo 0,5% e immergere per 30 minuti. Quindi, rimuoverlo e aggiungere l'anticorpo PDGFR-α/vimentina diluito nel diluente anticorpale a 1:1.000. Incubare per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario, lavare le cellule 3 volte con PBS per 3 minuti e aggiungere l'anticorpo secondario Alexa Fluor-555 capra anti-coniglio IgG diluito con diluente anticorpale a 1:200 per immergere per 1 ora.</li>
	<li>Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare le cellule 3 volte con PBS. Estrarre i vetrini rotondi con una pinza, metterli su vetrini e aggiungere 50 μL di soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) da 5 μg/mL per colorare i nuclei cellulari. Conservare i campioni in una scatola umida e buia e osservarli al microscopio a fluorescenza confocale laser. NOTA: Aggiungere un gruppo di controllo negativo senza un anticorpo primario ma con un anticorpo secondario per escludere la colorazione non specifica.</li>
</ol>7. Identificazione di fibroblasti mediante citometria a flusso
<ol><li>Raccogliere il pellet cellulare in una provetta sterile da centrifuga da 1,5 ml e risospendere con 50 μL di PBS contenente FBS all'1%. Incubare con anti-CD90 per 30 minuti al buio e aggiungere un controllo isotipo anti-IgG al gruppo di controllo. Quindi, aggiungere 200 μL di PBS contenente l'1% di FBS e centrifugare la provetta per 10 minuti a 300 × g a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di PBS contenente l'1% di FBS. Risospendere e filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare (70 mesh). Aggiungere una soluzione madre da 5 μg/mL di DAPI a 1:100 al filtrato, quindi acquisire i risultati mediante citometria a flusso. Impostare lo scatter in avanti (FSC) come ascissa e lo scatter laterale (SSC) come ordinata e cerchiare la popolazione cellulare principale. Selezionare la popolazione cellulare e impostare la ficoeritrina come ascissa e il conteggio come ordinata per l'analisi.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
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<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).</li>
<li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li>
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<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.

Ottenere fibroblasti primari dai tessuti cheloidi è una base fondamentale per ulteriori ricerche. Fino ad ora, ci sono stati due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianti11,12,13,14. Tuttavia, entrambi i metodi tradizionali hanno limiti, come la suscettibilità alla contaminazione, la miscelazione con altri tipi di cellule, un lungo periodo di coltura ...

Il cheloide, una malattia fibroproliferativa, si manifesta come la crescita continua di placche che spesso invadono la pelle normale circostante senza autolimitazione e causano vari gradi di prurito, dolore e oneri estetici e psicologici per i pazienti1. I fibroblasti, le cellule primarie coinvolte nei cheloidi, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo di questa malattia attraverso un'eccessiva proliferazione, la produzione ridondante di matrice extracellulare e collageni disorganizzati 2,3. Tuttavia, la patogenesi sottostante rimane poco chiara e manca ancora un metodo terapeutico efficace per il cheloide; Pertanto, vi è un urgente bisogno di ulteriori ricerche 4,5.
Poiché non esiste un modello animale ideale per la ricerca sui cheloidi in vivo 6,7, la costruzione di un modello in vitro mediante l'acquisizione di fibroblasti primari da tessuti cheloidi può offrire fattibilità e affidabilità per la ricerca cheloide 2,6. Le cellule primarie sono quelle derivate direttamente da tessuti viventi ed è generalmente riconosciuto che queste cellule possono assomigliare più da vicino allo stato fisiologico e al background genetico di più individui rispetto alle linee cellulari 8,9. La coltura delle cellule primarie fornisce un potente mezzo per studiare la crescita e il metabolismo delle cellule, così come altri fenotipi cellulari.
Allo stato attuale, ci sono due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianto. Tuttavia, sono stati identificati diversi ostacoli all'ottenimento di fibroblasti primari, come il rischio di contaminazione da parte di vari batteri o funghi, la miscelazione con altri tipi di cellule che non sono facilmente rimosse, il lungo periodo del ciclo di coltura, le successive modifiche alle caratteristiche cellulari rispetto alle cellule originali e così via9. Pertanto, lo sviluppo di un processo fattibile ed efficace per ottenere fibroblasti primari è la base per ulteriori studi e applicazioni. Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per l'estrazione di fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga sterile da 1,5 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga sterile da 15 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4% di poliformaldeide</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>Fissazione cellulare</td></tr><tr><td>50 mL provetta da centrifuga sterile</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>Metti tessuto cheloide</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 capra anti-coniglio IgG&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Alexa&nbsp; Fluor&nbsp; 555&nbsp;</td><td>Secondo anticorpo per il saggio di colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Anti umano CD90</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>Identifica la purezza dei fibroblasti</td></tr><tr><td>Diluente anticorpale</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di sicurezza biologica&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 serie A2</td><td>Cellule di isolamento e coltura</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>aladdina</td><td>B265993</td><td>Blocco per il test di colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Incubatore ad anidride carbonica</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>Utilizzo per la coltura di cellule</td></tr><tr><td>Criotubi cellulari</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>Conservare le cellule in</td></tr><tr><td>una macchina centrifuga</td> a bassa temperatura <td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>Scartare il surnatante&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>Colorare il nucleo cellulare</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>Utilizzo per la conservazione delle cellule</td></tr><tr><td>Terreno di aquila modificato di Dulbco</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Soluzione di terreno di coltura</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD</td><td>BD FACSCelesta</td><td>Osservazione l'identità delle cellule</td></tr><tr><td>congelate scatola</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale laser</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>Osservazione del saggio di colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>PDGFR-&alfa; anticorpo</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>Primo anticorpo per il saggio di colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina-Am</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>Aggiungere la soluzione del terreno di coltura per evitare la contaminazione</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>Fibroblasti di coltura</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Soluzione del terreno di coltura</td></tr><tr><td>Coniglio (DAIE) mAB IgG XR (R) Controllo dell'isotuge (PE)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>5742S</td><td>Come controllo per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto rotondo</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>Fori nella membrana cellulare</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Utilizzato per il passaggio delle cellule</td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>Primo anticorpo per il saggio di colorazione in immunofluorescenza</td></tr></tbody></table>

isolamento, coltura e caratterizzazione di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

I fibroblasti, il principale tipo di cellula nel tessuto cheloide, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo dei cheloidi. L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sulla funzione biologica e sui meccanismi molecolari dei cheloidi, nonché nuove strategie terapeutiche per il loro trattamento. Il metodo tradizionale per ottenere fibroblasti primari ha dei limiti, come il cattivo stato cellulare, la miscelazione con altri tipi di cellule e la suscettibilità alla contaminazione. Questo documento descrive un protocollo ottimizzato e facilmente riproducibile che potrebbe ridurre l'insorgenza di possibili problemi quando si ottengono fibroblasti. In questo protocollo, i fibroblasti possono essere osservati 5 giorni dopo l'isolamento e raggiungere quasi l'80% di confluenza dopo 10 giorni di coltura. Quindi, i fibroblasti vengono fatti passare e verificati utilizzando anticorpi PDGFRα e vimentina per saggi di immunofluorescenza e anticorpi CD90 per citometria a flusso. In conclusione, i fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca sui cheloidi.

La sequenza temporale del protocollo è riassunta nella Figura 1A. Alcune immagini rappresentative del processo di isolamento sono mostrate nella Figura 2; l'epidermide e gli strati adiposi sono stati accuratamente rimossi e lo strato del derma è stato separato in piccoli frammenti di 3-4 mm2, che sono stati inoculati nelle piastre di Petri.
Come mostrato nella Figura 3A, diverse escrescenze...

Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per stabilire fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sui cheloidi. I fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca cheloide. Iniziare utilizzando pinzette sterili per posizionare il tessuto cheloide in un tubo da centrifuga sterile da 50 millilitri contenente da 10 a 25 millilitri di PBS integrato con 1% PSA.Nel frattempo, aggiungere quattro millilitri di soluzione PSA PBS a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Ora estrarre il tessuto dal tubo e lavare due volte con la soluzione PBS PSA. Utilizzando un paio di pinze sterili, trasferire il tessuto in sequenza da un pozzetto all'altro.Quindi rimuovere gli strati adiposo ed epidermico con le forbici chirurgiche, lasciando intatto il derma. Utilizzare un paio di forbici per sezionare il derma tagliato in pezzi da tre a cinque millimetri quadrati e trasferire i pezzi al pozzetto successivo con un paio di pinze sterili. Lavare i pezzi in soluzione PBS PSA.Utilizzando una pinza sterilizzata, posizionare da 10 a 30 pezzi di tessuto dermico distanziati di meno di cinque millimetri in piastre di Petri. Mettere i piatti capovolti in un'incubatrice fino a quando i pezzi si asciugano e si attaccano al piatto. Quindi, aggiungere sette millilitri di DMEM integrato con 10% FBS e 1% PSA e incubare i piatti come prima.Dopo tre giorni, sostituire metà del surnatante con terreno di coltura completo. Osservare i fibroblasti ogni giorno sotto un ingrandimento microscopico 40X. Rimuovere i pezzi di tessuto nel terreno di coltura quando i fibroblasti raggiungono il 90% di confluenza.Lavare i fibroblasti in PBS e aggiungere due millilitri di soluzione sterile di tripsina EDTA. Dopo aver incubato le cellule in un incubatore umidificato, picchiettare delicatamente il piatto di coltura e osservarlo al microscopio. Aggiungere due millilitri di mezzo completo per terminare la digestione una volta che la maggior parte delle cellule si sono staccate.Ora trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri e centrifugare la provetta a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente. Scartare attentamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo completo. Seminare i fibroblasti in un piatto di coltura cellulare di nove centimetri e incubare in un incubatore umidificato.Per eseguire l'analisi immunofluorescente dopo aver coltivato i fibroblasti su vetrini rotondi e averli incubati in anticorpi primari e secondari, aggiungere 50 microlitri di soluzione DAPI al vetrino per colorare i nuclei cellulari. Posizionare le copertine lavate su vetrini con una pinza. Infine, trasferire i campioni in una scatola scura bagnata per la microscopia fluorescente.Le escrescenze di fibroblasti del tessuto sono state osservate cinque giorni dopo l'elaborazione. I fibroblasti hanno mostrato alti tassi di proliferazione e hanno raggiunto la confluenza dopo 10 giorni. I fibroblasti avevano corpi cellulari allungati e simili a fusi, che erano allineati in fasci ad alta confluenza.La colorazione immunofluorescente ha restituito immunofluorescenza rossa positiva dei fibroblasti e immunofluorescenza blu del nucleo cellulare. I test citometrici a flusso hanno mostrato positività CD90 in quasi tutti i fibroblasti. Questo studio ha descritto un metodo ottimizzato e fornito istruzioni chiare per risolvere le sfide esistenti e aumentare le possibilità di successo per l'isolamento e la coltura dei fibroblasti cheloidi.

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Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

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Pelle Punch Biopsia Espianto Cultura per la derivazione di fibroblasti umani primari

Questo video dimostra un protocollo per isolare e coltivare cellule di Schwann da tessuti dermici umani. Il derma umano contiene vari tipi di cellule, tra cui fibroblasti e cellule di Schwann. Dopo l'isolamento, le cellule vengono trattate con un agente antimitotico per eliminare i fibroblasti proliferanti, ottenendo una coltura pura di cellule di Schwann.

Isolamento e coltura di cellule primarie di Schwann da un derma umano

Riportiamo un metodo per isolare precursori pelle-derivato multipotenti (SKP) cellule naïve da colture primarie di fibroblasti umani. Abbiamo dimostrato che queste SKPs derivati ​​da colture di fibroblasti Share proprietà delle cellule staminali a quelle derivate direttamente da biopsie cutanee umane. Queste cellule esprimono il marcatore cresta neurale, nestin, oltre ai marcatori multipotenti quali OCT4 e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

Il comportamento dei fibroblasti è alla base di uno spettro di entità cliniche, ma rimangono scarsamente caratterizzate, in gran parte a causa della loro intrinseca eterogeneità. La ricerca tradizionale sui fibroblasti si basa sulla manipolazione in vitro, mascherando il comportamento dei fibroblasti in vivo. Descriviamo un protocollo basato su FACS per l'isolamento di fibroblasti cutanei di topo che non richiede colture cellulari.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Questo manoscritto descrive un protocollo basato su FACS per l'isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana. Si aggira in vitro cultura che era inevitabile con il protocollo di isolamento comunemente usato attraverso le colture espianti. I sottogruppi di fibroblasti emananti sono funzionalmente distinti e mostrano l'espressione genica differenziale e la localizzazione all'interno del derma.

Isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

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Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

Questo documento descrive un metodo basato su colture di espianto per l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche umane primarie e specifiche per il paziente e fibroblasti dermici. Inoltre, viene presentato un nuovo metodo per misurare la contrazione cellulare e la successiva analisi, che può essere utilizzato per studiare le differenze specifiche del paziente in queste cellule.

Isolamento delle cellule muscolari lisce aortiche primarie specifiche del paziente e misurazioni semiquantitative di contrazione in tempo reale in vitro

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Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

Scopri un protocollo ottimizzato per isolare e coltivare fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano. Questo metodo fornisce una fonte stabile e vitale di cellule per studiare la biologia dei cheloidi e sviluppare nuove terapie.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano

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