Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani
May 5th, 2023
Questo lavoro descrive un protocollo per la stampa 3D incorporata a forma libera di cellule staminali neurali all'interno di compositi di matrice extracellulare ricottura autorigeneranti. Il protocollo consente la modellazione programmabile di costrutti di tessuto neurale umano interconnessi con alta fedeltà.
La stampa 3D integrata all'interno dei compositi SHAPE supera i tradizionali limiti della biofabbricazione per consentire una modellazione accurata di tessuti meccanicamente sensibili all'interno di idrogel che assomigliano all'ambiente extracellulare nativo. SHAPE toolbox si basa sul design modulare dei biomateriali, consentendo facili modifiche nella formulazione del supporto di stampa. Sfrutta anche materiali a basso costo e attrezzature accessibili per un semplice adattamento da parte di altri gruppi di ricerca.
Questo approccio può essere applicato per creare modelli di tessuto neurale umano spazialmente definiti per esaminare lo sviluppo e la comunicazione neuronale nei disturbi neurodegenerativi come il Parkinson. Inizia preparando la soluzione di carbonato di calcio in acqua ultrapura a due milligrammi per millilitro di concentrazione. Mescolare con la soluzione di alginato in un rapporto uguale e mescolare magneticamente a 650 RPM per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi aggiungere l'acido acetico a questa miscela in un rapporto di uno a 500 e mescolare di nuovo durante la notte. Il giorno successivo, frammentare meccanicamente la soluzione di alginato gelatinoso in microparticelle a 15.000 giri / min per 10 minuti usando un omogeneizzatore. Quindi centrifugare per ottenere le microparticelle.
Scartare con cautela il surnatante e risospendere le particelle nel DMEM, contenenti due idrossido di sodio millimolare e streptomicina all'1% di penicillina. Il colore della sospensione dovrebbe tornare al rosso. Incubare la sospensione durante la notte a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, omogeneizzare la sospensione per tre minuti a 15.000 giri / min e centrifugare a 18.500 G per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e osservare il pellet per microparticelle di alginato strettamente imballate. Per generare il composito SHAPE, mescolare il pellet di microparticelle di alginato con collagene diluito e neutralizzato in un rapporto di due a uno e pipettarlo su e giù su ghiaccio.
Trasferire il materiale composito generato in una piastra raffreddata a 24 pozzetti. Prima della stampa, dissociare le cellule staminali neurali umane precedentemente coltivate o hNSC utilizzando una soluzione di tripsina allo 0,025% per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi neutralizzare la tripsina con il terreno di crescita e centrifugare la sospensione cellulare a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet cellulare in due o tre millilitri di terreno di crescita. Utilizzando un ago metallico smussato calibro 21, caricare 100 microlitri di microparticelle di alginato strettamente imballate nella siringa. Quindi caricare la sospensione cellulare preparata in una siringa.
Per la stampa, sostituire l'ago di carico con un ago metallico smussato calibro 27. Utilizzando il software di riferimento, una volta progettata la struttura da stampare, fare clic su genera per la generazione di un codice G. Inserire la siringa caricata con cella in una testina di estrusione volumetrica su una bioprinter basata sull'estrusione e registrare la lunghezza dell'ago facendo clic su avvia il processo di misurazione della lunghezza dell'ago.
Quindi posizionare la piastra da 24 pozzetti caricata con il composito SHAPE sulla stampante e fare clic su SHM per misurare l'altezza della superficie del pozzo vuoto. Selezionare pH 2 seguito dal simbolo della chiave inglese. Quindi, sotto il set di parametri, modificare la portata volumetrica a 3,6 microlitri al secondo e premere Applica parametro, quindi Salva e Fatto.
Caricare il codice G nell'interfaccia utente della stampante facendo clic su un'icona per aprire il codice G. Selezionare l'icona del programma di esecuzione per avviare la procedura di stampa. Subito dopo la stampa, incubare il gel SHAPE a 37 gradi Celsius per 30 minuti per la ricottura.
Quindi aggiungere delicatamente il terreno di crescita al supporto in gel SHAPE ricotto. Per l'immunocolorazione, rimuovere il mezzo in eccesso dal gel e, utilizzando una spatola, trasferire il gel in un contenitore contenente DPBS. Una volta posizionata la piastra nella cappa aspirante, rimuovere il DPBS.
Coprire il gel con una soluzione di formaldeide al 4% e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con DPBS, aggiungere la soluzione bloccante al gel. Scuotere delicatamente la piastra e incubare per sei ore a temperatura ambiente per evitare un legame non specifico.
Una volta rimossa la soluzione bloccante, aggiungere l'anticorpo primario al gel e scuoterlo delicatamente. Incubare la piastra per 48 ore a quattro gradi Celsius. Dopo il lavaggio DPBS, trattare allo stesso modo il gel con la soluzione anticorpale secondaria per 24 ore.
Posizionare il gel colorato con una spatola in una piastra del pozzetto con un fondo di imaging sottile prima dell'imaging. Nel presente studio, l'inchiostro hNSC ha stampato un filamento di cellule con un diametro di circa 200 micrometri. I fili stampati erano ricchi di cellule vitali con morfologia intorno.
Dopo 30 giorni di stampa, le cellule hanno mostrato morfologia neurale con piccoli corpi cellulari e processi lunghi e sottili, che hanno indicato il successo della differenziazione delle hNSC. La colorazione con tubulina beta tre ha permesso la visualizzazione delle reti neurali generate con geometria mantenuta. E durante il processo di differenziazione, le cellule non migravano fuori dai fili stampati.
Il composito SHAPE può essere utilizzato per produrre canali perfusibili stampando inchiostro sacrificale anziché celle. Inoltre, il supporto può includere perline sensibili all'ossigeno per monitorare la tensione dell'ossigeno nelle strutture stampate in 3D nel tempo e nello spazio.
Panoramica
Questo lavoro descrive un protocollo per la stampa 3D embedded di cellule staminali neurali all'interno di compositi auto-riparanti di particelle e matrice extracellulare. Questo metodo consente il patterning programmabile di costrutti di tessuto neurale umano interconnesso con alta fedeltà.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biofabbricazione
- Ingegneria dei tessuti
Sfondo
- I metodi tradizionali di biofabbricazione affrontano limitazioni nella creazione di tessuti meccanicamente sensibili.
- I compositi SHAPE forniscono un ambiente extracellulare nativo per lo sviluppo dei tessuti.
- Il design modulare del biomateriale permette una facile adattazione e cambiamenti di formulazione.
- Materiali a basso costo e attrezzature accessibili facilitano applicazioni di ricerca più ampie.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo per il patterning accurato di modelli di tessuto neurale.
- Esaminare lo sviluppo neuronale e la comunicazione nei disturbi neurodegenerativi.
- Fornire una struttura per altri gruppi di ricerca per replicare e adattare il metodo.
Metodi utilizzati
- Preparazione della soluzione di carbonato di calcio in acqua ultrapura.
- Miscelazione con soluzione di alginato in un rapporto specifico.
- Agitazione magnetica a velocità e temperatura controllate.
- Utilizzo di compositi SHAPE per la stampa 3D embedded.
Risultati principali
- Creazione di successo di modelli di tessuto neurale umano definiti spazialmente.
- Dimostrazione della capacità di patterning dei tessuti con alta fedeltà.
- Potenziali applicazioni nello studio dei disturbi neurodegenerativi.
- Adattabilità del protocollo per vari contesti di ricerca.
Conclusioni
- Il protocollo migliora le capacità della biofabbricazione in neuroscienza.
- Fornisce uno strumento prezioso per investigare le interazioni neuronali.
- La ricerca futura può basarsi su questo metodo per esplorare varie condizioni neurologiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Embedded 3D printing of human neural constructs within SHAPE composites addresses a critical gap in modeling neurodegenerative diseases by providing a tunable, ECM-mimetic environment that supports long-term culture and functional maturation. This approach enables biopharma R&D to generate reproducible, human-relevant neural tissue models for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The modular, low-cost design supports scalable adoption across discovery workflows for Parkinson’s and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in human-derived neural tissue with preserved architecture and viability.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining printed cell localization and differentiation over extended culture periods.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement in spatially defined neural networks relevant to disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized, reproducible support medium for long-term culture and quantitative imaging of neural constructs.
- Scalability: Uses accessible equipment and low-cost materials to enable platform reuse across multiple compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Allows live-cell fluorescence and immunocytochemistry readouts to measure differentiation, axonal outgrowth, and network formation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Generates human neural tissue models applicable to studying neuronal development and communication in neurodegenerative disorders like Parkinson’s.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining construct geometry and enabling functional readouts over weeks.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through observable differentiation and network formation without cell migration from printed strands.
Pipeline & Workflow Integration
The SHAPE composite method integrates into the discovery continuum by enabling early-stage hypothesis testing in human neural models, supporting assay development for compound evaluation, and providing translational readouts that bridge to preclinical assessment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise patterning and long-term culture of human neural stem cells to study differentiation and network formation.
- Screening: Enables standardized, reproducible construct generation for compound exposure and functional readout via imaging and staining.
- Analytics: Delivers quantitative, spatially resolved data through live-cell imaging and immunocytochemistry to compare conditions and assess target modulation.
- Translational Research: Maintains construct integrity and supports axonal outgrowth, providing a disease-relevant system for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Leverages modular design and low-cost materials to allow adaptation across research groups and iterative use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by providing a tunable, ECM-like microenvironment that supports neural differentiation and network formation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through self-healing, annealable support media and accessible fabrication protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing reliance on complex systems and enabling broad adoption across discovery teams.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through observable, long-term neural maturation and network stability in printed constructs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial preparation, particle generation, and sterile tissue culture techniques.
- Depends on access to homogenizers, centrifuges, bioprinters, and standard imaging and immunostaining equipment.
- Necessitates cross-team standardization of SHAPE composite formulation and printing parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or ECM components beyond alginate and collagen.
- Includes practical limitations such as the need for precise particle sizing and annealing timing to maintain support fidelity during printing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Self Healing Annealable Particle: Extracellular Matrix (SHAPE) Composite Preparation
2:40
Human Neural Stem Cell (hNSC) Bioink Preparation and Embedded 3D Printing
6:19
Results: Characterization of 3D Printed Human Neural Construct
7:11
Conclusion
