Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani

La stampa 3D integrata all'interno dei compositi SHAPE supera i tradizionali limiti della biofabbricazione per consentire una modellazione accurata di tessuti meccanicamente sensibili all'interno di idrogel che assomigliano all'ambiente extracellulare nativo. SHAPE toolbox si basa sul design modulare dei biomateriali, consentendo facili modifiche nella formulazione del supporto di stampa. Sfrutta anche materiali a basso costo e attrezzature accessibili per un semplice adattamento da parte di altri gruppi di ricerca.

Questo approccio può essere applicato per creare modelli di tessuto neurale umano spazialmente definiti per esaminare lo sviluppo e la comunicazione neuronale nei disturbi neurodegenerativi come il Parkinson. Inizia preparando la soluzione di carbonato di calcio in acqua ultrapura a due milligrammi per millilitro di concentrazione. Mescolare con la soluzione di alginato in un rapporto uguale e mescolare magneticamente a 650 RPM per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere l'acido acetico a questa miscela in un rapporto di uno a 500 e mescolare di nuovo durante la notte. Il giorno successivo, frammentare meccanicamente la soluzione di alginato gelatinoso in microparticelle a 15.000 giri / min per 10 minuti usando un omogeneizzatore. Quindi centrifugare per ottenere le microparticelle.

Scartare con cautela il surnatante e risospendere le particelle nel DMEM, contenenti due idrossido di sodio millimolare e streptomicina all'1% di penicillina. Il colore della sospensione dovrebbe tornare al rosso. Incubare la sospensione durante la notte a quattro gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, omogeneizzare la sospensione per tre minuti a 15.000 giri / min e centrifugare a 18.500 G per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e osservare il pellet per microparticelle di alginato strettamente imballate. Per generare il composito SHAPE, mescolare il pellet di microparticelle di alginato con collagene diluito e neutralizzato in un rapporto di due a uno e pipettarlo su e giù su ghiaccio.

Trasferire il materiale composito generato in una piastra raffreddata a 24 pozzetti. Prima della stampa, dissociare le cellule staminali neurali umane precedentemente coltivate o hNSC utilizzando una soluzione di tripsina allo 0,025% per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi neutralizzare la tripsina con il terreno di crescita e centrifugare la sospensione cellulare a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet cellulare in due o tre millilitri di terreno di crescita. Utilizzando un ago metallico smussato calibro 21, caricare 100 microlitri di microparticelle di alginato strettamente imballate nella siringa. Quindi caricare la sospensione cellulare preparata in una siringa.

Per la stampa, sostituire l'ago di carico con un ago metallico smussato calibro 27. Utilizzando il software di riferimento, una volta progettata la struttura da stampare, fare clic su genera per la generazione di un codice G. Inserire la siringa caricata con cella in una testina di estrusione volumetrica su una bioprinter basata sull'estrusione e registrare la lunghezza dell'ago facendo clic su avvia il processo di misurazione della lunghezza dell'ago.

Quindi posizionare la piastra da 24 pozzetti caricata con il composito SHAPE sulla stampante e fare clic su SHM per misurare l'altezza della superficie del pozzo vuoto. Selezionare pH 2 seguito dal simbolo della chiave inglese. Quindi, sotto il set di parametri, modificare la portata volumetrica a 3,6 microlitri al secondo e premere Applica parametro, quindi Salva e Fatto.

Caricare il codice G nell'interfaccia utente della stampante facendo clic su un'icona per aprire il codice G. Selezionare l'icona del programma di esecuzione per avviare la procedura di stampa. Subito dopo la stampa, incubare il gel SHAPE a 37 gradi Celsius per 30 minuti per la ricottura.

Quindi aggiungere delicatamente il terreno di crescita al supporto in gel SHAPE ricotto. Per l'immunocolorazione, rimuovere il mezzo in eccesso dal gel e, utilizzando una spatola, trasferire il gel in un contenitore contenente DPBS. Una volta posizionata la piastra nella cappa aspirante, rimuovere il DPBS.

Coprire il gel con una soluzione di formaldeide al 4% e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con DPBS, aggiungere la soluzione bloccante al gel. Scuotere delicatamente la piastra e incubare per sei ore a temperatura ambiente per evitare un legame non specifico.

Una volta rimossa la soluzione bloccante, aggiungere l'anticorpo primario al gel e scuoterlo delicatamente. Incubare la piastra per 48 ore a quattro gradi Celsius. Dopo il lavaggio DPBS, trattare allo stesso modo il gel con la soluzione anticorpale secondaria per 24 ore.

Posizionare il gel colorato con una spatola in una piastra del pozzetto con un fondo di imaging sottile prima dell'imaging. Nel presente studio, l'inchiostro hNSC ha stampato un filamento di cellule con un diametro di circa 200 micrometri. I fili stampati erano ricchi di cellule vitali con morfologia intorno.

Dopo 30 giorni di stampa, le cellule hanno mostrato morfologia neurale con piccoli corpi cellulari e processi lunghi e sottili, che hanno indicato il successo della differenziazione delle hNSC. La colorazione con tubulina beta tre ha permesso la visualizzazione delle reti neurali generate con geometria mantenuta. E durante il processo di differenziazione, le cellule non migravano fuori dai fili stampati.

Il composito SHAPE può essere utilizzato per produrre canali perfusibili stampando inchiostro sacrificale anziché celle. Inoltre, il supporto può includere perline sensibili all'ossigeno per monitorare la tensione dell'ossigeno nelle strutture stampate in 3D nel tempo e nello spazio.