Name: Caratterizzazione comportamentale di un modello murino con sindrome di Angelman (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Scopri test comportamentali riproducibili per caratterizzare un modello murino con sindrome di Angelman. Questo metodo combina intelligenza artificiale e osservazioni in gabbia per studiare disturbi neurogenetici.

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Questa ricerca è stata sostenuta dall'Accademia ceca delle scienze RVO 68378050, LM2018126 Centro ceco per la fenogenomica fornito da MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Upgrade of the Czech Centre for Phenogenomics: developing towards translation research by MEYS and ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II di MEYS e ESIF) e OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (qualità e capacità superiori per i modelli transgenici di MEYS e FESR). Inoltre, questo studio ha ricevuto finanziamenti dall'ONG "Association of Gene Therapy (ASGENT)", dalla Repubblica Ceca (https://asgent.org/) e dal Centro cec LM2023036 o di fenogenomica fornito dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca.

Validazione di un modello murino della sindrome di Angelman mediante test comportamentali

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

I modelli di AS creati in diversi ceppi murini sono comunemente convalidati con test dello stato emotivo, delle funzioni motorie e delle capacità cognitive degli animali per facilitare il confronto con i sintomi umani31,32. Un deficit motorio nei modelli di AS è il risultato più consistente in tutti i laboratori, seguito da uno stato emotivo invariato dei mutanti e dalle difficoltà a costruire i nidi31,32,33</s...

La sindrome di Angelman (AS) è una rara malattia del neurosviluppo. L'origine genetica più comune della SA è una grande delezione della regione 15q11-q13 del cromosoma di origine materna, che si trova in quasi il 74% dei pazienti1. La delezione di questa regione provoca la perdita di UBE3A, il principale gene causativo della SA che codifica per l'ubiquitina ligasi E3. L'allele paterno del gene UBE3A nei neuroni viene silenziato in un processo noto come imprinting. Di conseguenza, l'imprinting paterno del gene consente solo l'espressione materna nel sistema nervoso centrale (SNC)2. Pertanto, la delezione del gene UBE3A dal cromosoma di origine materna porta allo sviluppo dei sintomi della SA. Nell'uomo, la SA si manifesta intorno ai 6 mesi di età, con ritardo dello sviluppo che persiste in tutte le fasi dello sviluppo e provoca gravi sintomi debilitanti nei soggetti affetti 3,4. I sintomi principali del disturbo includono il deficit delle capacità motorie fini e grossolane, tra cui andatura atassica a scatti, grave compromissione del linguaggio e disabilità intellettiva. Circa l'80% dei pazienti con SA soffre anche di disturbi del sonno ed epilessia. Ad oggi, l'unico trattamento disponibile sono i farmaci sintomatici, che riducono le crisi epilettiche e migliorano la qualità del sonno1. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali robusti con fenotipi comportamentali riproducibili insieme a una raffinata analisi della fenotipizzazione sarà essenziale per chiarire i meccanismi fisiopatologici del disturbo e scoprire farmaci e trattamenti efficaci.
La complessità del disturbo umano che colpisce il sistema nervoso centrale richiede che gli organismi modello possiedano un genoma, una fisiologia e un comportamento comparabili. I topi sono popolari come organismi modello a causa del loro breve ciclo riproduttivo, delle piccole dimensioni e della relativa facilità di modifica del DNA. Nel 1984, Paul Willner ha proposto tre criteri di base per la validazione del modello di malattia: il costrutto, il volto e la validità predittiva, che vengono utilizzati per determinare il valore del modello5. Semplicemente, la validità del costrutto riflette i meccanismi biologici responsabili dello sviluppo del disturbo, la validità del volto ne ricapitola i sintomi e la validità predittiva descrive la risposta del modello ai farmaci terapeutici.
Per aderire ai principi di cui sopra, abbiamo scelto l'eziologia genetica più comune, una grande delezione del locus materno 15q11.2-13q che include il gene UBE3A, per creare topi modello AS. Abbiamo usato la tecnica CRISPR/Cas9 per eliminare una regione lunga 76.225 bp che copre l'intero gene UBE3A, comprendendo sia gli elementi codificanti che quelli non codificanti del gene, nei topi provenienti da un background C57BL/6N6. Abbiamo quindi allevato gli animali per ottenere topi eterozigoti UBE3A+/−. Per la validazione facciale del modello, abbiamo utilizzato animali provenienti da incroci di femmine UBE3A+/− e maschi wild-type per ottenere la progenie UBE3A+/- (ceppo denominato C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph e successivamente assegnato come UBE3A mGenedel/+) e compagni di cucciolata di controllo. Abbiamo testato le loro capacità motorie fini e grossolane, l'emotività e l'affetto per ricapitolare i sintomi principali dell'AS. In un precedente articolo, abbiamo anche valutato le funzioni cognitive degli animali, poiché i pazienti con AS soffrono anche di disabilità intellettiva6. Tuttavia, non abbiamo riscontrato disturbi cognitivi nei topiUBE3A mGenedel/+, forse a causa della giovane età degli animali al momento del test7. L'esame successivo degli animali più anziani, di circa 18 settimane, ha rivelato un deficit nella flessibilità comportamentale durante l'apprendimento inverso nel paradigma della preferenza di luogo. Tuttavia, la complessità delle apparecchiature impiegate per questa analisi richiede un modulo metodologico separato e non è incluso in questa sede.
I test comportamentali qui presentati appartengono agli strumenti di fenotipizzazione più comuni nella ricerca genetica, grazie al loro elevato valore predittivo e alla sufficiente validità del costrutto 8,9,10. Abbiamo utilizzato questi test per convalidare un modello murino di SA ricapitolando i sintomi principali della malattia umana in modo riproducibile e indipendente dall'età. L'emotività dell'animale è stata valutata nei test di labirinto elevato e campo aperto. Entrambi questi test si basano sul conflitto approccio-evitamento, in cui gli animali esplorano un nuovo ambiente in cerca di cibo, riparo o opportunità di accoppiamento, evitando contemporaneamente i compartimenti ansiogeni11. Inoltre, il test in campo aperto viene utilizzato per testare l'attività locomotoria di un topo8. Il test della sospensione della coda è ampiamente utilizzato nella ricerca sulla depressione per lo screening di nuovi farmaci antidepressivi o fenotipi simili alla depressione in modelli murini knockout12. Questo test valuta la disperazione che gli animali sviluppano nel tempo in una situazione ineluttabile. L'apprendimento motorio e le caratteristiche dettagliate dell'andatura sono state determinate rispettivamente sul rotarod e nel DigiGait. La resistenza dell'animale sull'asta accelerante caratterizza le sue capacità di equilibrio e coordinazione del movimento, mentre l'analisi dettagliata dei modelli di passo di un topo è una valutazione sensibile delle menomazioni neuromuscolari connesse a molti disturbi neurogenerativi del movimento13,14,15. Il test di triturazione del nido fa parte della metodologia standard per rilevare il comportamento impulsivo nei roditori e, poiché utilizza il comportamento naturale della costruzione dei roditori, indica il benessere dell'animale16,17.
La dimensione dei gruppi sperimentali è stata il risultato di un compromesso per soddisfare le esigenze della regola 3R e l'uso efficiente delle prestazioni di allevamento delle colonie. Tuttavia, per ottenere potere statistico, i gruppi avevano non meno di 10 individui, a causa della creazione di un numero sufficiente di coppie nidificanti. Purtroppo, le prestazioni riproduttive non sempre hanno portato a un numero sufficiente di animali.

<table><tbody><tr><td>Gabbie, ventilate individualmente</td><td>Techniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DigiGait</td><td>Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA</td><td>L'attrezzatura è stata offerta, non è stato fornito alcun numero di catalogo, né è stato possibile trovarlo sul sito web dell'azienda</td><td>Analisi dettagliata dell'andatura del mouse, hardware e software forniti.</td></tr><tr><td>FDA Nestlet squares</td><td>Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, Regno Unito</td><td>Il materiale è stato acquistato dal fornitore Velaz tramite richiesta diretta via e-mail. Velaz non fornisce alcun numero di catalogo.</td><td>Nidi di cotone per test di costruzione del nido. Descrizione del nido: 2-3 g ciascuno, con diametro circa 5 x 5 x 0,5 cm.</td></tr><tr><td></td><td>Altramion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotarod</td><td>TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlino, Germania</td><td>L'attrezzatura è stata offerta, non è stato fornito alcun numero di catalogo, né è stato possibile trovarlo sul sito web dell'azienda</td><td>Rotarod per 5 mouse, hardware e software forniti. Dimensioni del tamburo: Diametro: 30 mm, larghezza per corsia: 50 mm, distanza di caduta 147 mm.</td></tr><tr><td>Test della sospensione della coda</td><td>Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCIA</td><td>Riferimento: BIO-TST5</td><td>Apparecchiatura completamente automatizzata per la valutazione del tempo di immobilità di 3 topi impiccati per la coda, hardware e software forniti</td></tr><tr><td>Nastro medico Transpore</td><td>Medical M, Ltd.</td><td>P-AIRO1291</td><td>Il nastro utilizzato per attaccare un animale al gancio per la coda.</td></tr><tr><td>Visualizzatore - Sistema di tracciamento video</td><td>Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germania</td><td>Sono state presentate offerte per l'attrezzatura con software, non è stato fornito alcun numero di catalogo, né è stato possibile trovare sul sito web dell'azienda</td><td>Software con hardware personalizzato: labirinto, base IR, telecamere sensibili IR. Dimensioni OF su misura: 42 x 42 cm di superficie, 49 cm di altezza parete, zona centrale: 39 cm2. Un EPM su misura è stato sollevato a 50 cm dal pavimento, con un braccio aperto lungo 79 cm. 9 cm di larghezza e braccio chiuso 77 cm di lunghezza, 7,6 cm di larghezza.</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione comportamentale di un modello murino con sindrome di angelman

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

Questo manoscritto descrive una batteria di test comportamentali disponibili per caratterizzare i fenotipi simili alla sindrome di Angelman (AS) in un modello murino consolidato di AS. Utilizziamo il paradigma di apprendimento rotarod, l'analisi dettagliata dell'andatura e il test di costruzione del nido per rilevare e caratterizzare le disabilità motorie degli animali. Testiamo l'emotività animale in campo aperto e nei test a labirinto sopraelevati, nonché l'affetto nel test di sospensione della coda. Quando i topi AS vengono testati nel test in campo aperto, i risultati devono essere interpretati con cautela, poiché le disfunzioni motorie influenzano il comportamento del topo nel labirinto e alterano i punteggi di attività.
La riproducibilità e l'efficacia dei test comportamentali presentati è già stata convalidata in diverse linee murine Uba3a indipendenti con diverse varianti di knockout, stabilendo questa serie di test come un eccellente strumento di validazione nella ricerca sulla SA. I modelli con il costrutto e la validità del volto pertinenti giustificheranno ulteriori indagini per chiarire la fisiopatologia della malattia e garantire lo sviluppo di trattamenti causali.

Sopraelevato più labirinto e test in campo aperto I test EPM e OF utilizzano la naturale tendenza dei roditori ad esplorare nuovi ambienti18,19. L'esplorazione è governata da un conflitto di avvicinamento-evitamento, in cui i roditori scelgono tra l'esplorazione di un nuovo ambiente e l'evitare possibili pericoli. Gli animali esplorano luoghi sconosciuti alla ricerca di riparo, contatto sociale o foraggiamento. Tuttavia, i nuovi luoghi possono...

Questo manoscritto presenta una serie di test comportamentali altamente riproducibili per convalidare un modello murino con sindrome di Angelman.

Caratterizzazione comportamentale di un modello murino con sindrome di Angelman

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...

Il nostro obiettivo è quello di chiarire i ruoli fisiologici dei geni utilizzando i topi come modello sperimentale. Ci concentriamo anche sullo sviluppo di modelli murini di malattie specifiche che gli scienziati possono utilizzare per studiare la causa della malattia e sviluppare trattamenti efficaci. Un esempio di tale attività è il modello murino della sindrome di Angelman.Probabilmente, la nuova tecnologia più promettente con potenziale è l'integrazione dell'intelligenza artificiale basata su tecniche di deep learning nella ricerca sugli animali. Questo approccio può essere utilizzato per monitorare direttamente il comportamento degli animali nella gabbia domestica senza la necessità che lo sperimentatore disturbi gli animali. La sfida più grande negli studi comportamentali attualmente è la riproducibilità.Pertanto, introduciamo una batteria di test che convalidano la sindrome di Angelman del modello in un modo che non dipende dall'età o dalla specie del modello. Utilizziamo test comportamentali consolidati per convalidare il nostro modello AS. Tuttavia, con il nuovo approccio per lo sviluppo del modello che assomiglia molto alla condizione umana con una grande delezione.Utilizzando la tecnologia CRISPR, abbiamo eliminato l'intero gene UBE3A dal genoma del topo. A differenza di altri modelli in cui l'eliminazione è limitata a 3 KB. Stiamo lavorando allo sviluppo di una terapia genetica che potrebbe ripristinare i sintomi in un modello murino.

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Inchworming è un movimento di scavo sincrono altamente ripetitivo visualizzato dal BTBR T + Itpr 3TF / J (BTBR) i topi, quando sono immessi in una gabbia test con biancheria da letto di segatura sufficiente. La procedura è una modifica del protocollo di interazione sociale giovanile e viene qui utilizzato per valutare stereotipie motorie ripetitive relative al disturbo dello spettro autistico.

Inchworming: A Novel Motor stereotipia nel BTBR<em&gt; T<sup&gt; +</sup&gt; Itpr3<sup&gt; Tf</sup</em&gt; / J modello murino di autismo

Qui presentiamo un protocollo per indurre l'anoressia basata sull'attività (ABA) in topi adolescenti femmine. L'ABA è una condizione di iperattività evocata dall'imposizione di restrizioni alimentari ai roditori con accesso a una ruota da corsa. Questo fenomeno viene utilizzato come modello per studiare la neurobiologia alla base dell'anoressia nervosa.

Utilizzando il per attività Anoressia roditore modello per studiare le basi neurobiologiche di Anoressia Nervosa

Topi alloggiati individualmente con una rotella corrente mentre dato accesso limitato al cibo sviluppano riduzioni nel consumo alimentare e aumentano l'attività sulla ruota in esecuzione. Questo fenomeno sperimentale viene chiamato anoressia basato sulle attività. Questo paradigma fornisce uno strumento sperimentale per lo studio della neurobiologia e comportamenti sottostanti gli aspetti dell'anoressia nervosa.

Valutazione basata sulle attività di anoressia in topi

L'analisi dell'impronta è un'alternativa a basso costo ai programmi di analisi dell'andatura digitalizzata per i ricercatori che quantificano le anomalie di movimento nei topi. A causa della sua velocità, semplicità e potenziale longitudinale, è ideale per la fenotipizzazione comportamentale dei modelli murini.

Analisi dell'andatura a basso costo per la fenotipizzazione comportamentale dei modelli murini delle malattie neuromuscolari

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) è associato a un comportamento sociale e comunicativo alterato e all'emergere di comportamenti ripetitivi. Per studiare l'interrelazione tra i geni ASD e i deficit comportamentali nel modello di Drosophila , in questo articolo vengono descritti cinque paradigmi comportamentali per valutare il distanziamento sociale, l'aggressività, il corteggiamento, l'adescamento e il comportamento di assuefazione.

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Behavioral Valutazione del sistema vestibolare invecchiamento mouse

Scopri test comportamentali riproducibili per caratterizzare un modello murino con sindrome di Angelman. Questo metodo combina intelligenza artificiale e osservazioni in gabbia per studiare disturbi neurogenetici.

Caratterizzazione comportamentale di un modello murino con sindrome di Angelman

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