Name: Un protocollo efficiente per lanalisi CUT and RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Scopri un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate tramite FACS. Questo metodo consente di studiare la regolazione trascrizionale nel muscolo scheletrico in vivo.

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Ringraziamo Anastasia Bannwarth per l'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo la struttura IGBMC, la coltura cellulare, l'Istituto clinico del topo (ICS, Illkirch, Francia), l'imaging, la microscopia elettronica, la citometria a flusso e la piattaforma GenomEast, membro del consorzio "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).
Questo lavoro dell'Istituto Tematico Interdisciplinare IMCBio, nell'ambito del programma ITI 2021-2028 dell'Università di Strasburgo, del CNRS e dell'Inserm, è stato sostenuto da IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) e dal progetto SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) e EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) nell'ambito del programma francese Investments for the Future. Ulteriori finanziamenti sono stati erogati dall'INSERM, dal CNRS, dall'Unistra, dall'IGBMC, dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), dal programma strategico AFM-Téléthon 24376 (a D.D.), INSERM young researcher grant (to D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, e da un fondo statale francese gestito dall'ANR nell'ambito del programma quadro Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. è stato sostenuto dal Programma CDFA-07-22 dell'Université franco-allemande e Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, e K.G. dall'Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Isolamento di cellule satelliti dai muscoli degli arti di topo e analisi della citometria a flusso

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li>
<li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366(2018).</li>
<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
<li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT%26RUN+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Atlas+2021+update%3A+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq%2C+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+human+islet+isolation+utilizing+recombinant+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase.</a> Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).</li>
<li>Nikolic, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+collagenase+XI+and+liberase+H1+for+the+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets.</a> Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2C12+myoblastoma+cell+differentiation+and+proliferation+is+stimulated+by+androgens+and+associated+with+a+modulation+of+myostatin+and+Pax7+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).</li>
<li>Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+modulation+of+the+nuclear+receptor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).</li>
<li>Billas, I., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+controls+of+nuclear+receptor+function+in+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).</li>
<li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li>
<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Schultz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+satellite+cell+population+in+postnatal+mouse+lumbrical+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle.</a> The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).</li>
<li>Hyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+pancreatic+digestion+with+liberase+versus+collagenase+on+the+yield%2C+function+and+viability+of+neonatal+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets.</a> Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il presente studio riporta un metodo standardizzato, affidabile e di facile esecuzione per l'isolamento e la coltura di cellule satelliti di topo, nonché la valutazione della regolazione trascrizionale mediante il metodo CUT&RUN.
Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la disgregazione muscolare e la digestione delle fibre per garantire un elevato numero di cellule raccolte. Nonostante l'aumento della concentrazione enzimatica, sono state ottenute più cellule viventi ris...

I muscoli striati scheletrici rappresentano in media il 40% del peso totale del corpo umano1. Le fibre muscolari mostrano una notevole capacità di rigenerazione in caso di lesione, che è descritta dalla fusione di miociti di nuova formazione e dalla generazione di nuove miofibre che sostituiscono quelle danneggiate2. Nel 1961, Alexander Mauro riportò una popolazione di cellule mononucleate che definì cellule satelliti3. Queste cellule staminali esprimono il fattore di trascrizione 7 (PAX7) e si trovano tra la lamina basale e il sarcolemma delle fibre muscolari4. È stato riportato che esprimono il cluster di differenziazione 34 (CD34; un marcatore ematopoietico, progenitore endoteliale e delle cellule staminali mesenchimali), l'integrina alfa 7 (ITGA7; un marcatore del muscolo liscio, cardiaco e scheletrico), nonché il recettore delle chemochine C-X-C di tipo 4 (CXCR4; un marcatore linfocitario, ematopoietico e di cellule satelliti)5. In condizioni basali, le cellule satelliti risiedono in un particolare microambiente che le mantiene in uno stato di quiescenza6. In caso di danno muscolare, si attivano, proliferano e vanno incontro a miogenesi7. Tuttavia, contribuendo solo a una frazione minore del numero totale di cellule muscolari, le loro analisi dell'intero genoma sono particolarmente impegnative, specialmente in contesti fisiologici (<1% delle cellule totali).
Sono stati descritti vari metodi per l'isolamento della cromatina dalle cellule satelliti, che coinvolgono l'immunoprecipitazione della cromatina seguita da massicci esperimenti di sequenziamento parallelo (ChIP-seq) o di scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag). Tuttavia, queste due tecniche presentano alcuni limiti significativi che rimangono incontestati. Infatti, ChIP-seq richiede un'elevata quantità di materiale di partenza per generare una quantità sufficiente di cromatina, gran parte della quale viene persa durante la fase di sonicazione. CUT&Tag è più appropriato per un basso numero di cellule, ma genera più siti di clivaggio fuori bersaglio rispetto a ChIP-seq a causa dell'attività della trasposasi Tn5. Inoltre, poiché questo enzima ha un'elevata affinità per le regioni a cromatina aperta, l'approccio CUT&Tag potrebbe essere utilizzato preferenzialmente per analizzare le modificazioni istoniche o i fattori di trascrizione associati a regioni del genoma attivamente trascritte, invece dell'eterocromatinasilenziata 8,9.
Di seguito viene presentato un protocollo dettagliato che consente l'isolamento delle cellule satelliti muscolari degli arti di topo mediante FACS per la scissione sotto i bersagli e il rilascio utilizzando l'analisi della nucleasi (CUT&RUN)10,11. Le varie fasi comportano l'interruzione meccanica del tessuto, l'ordinamento cellulare e l'isolamento dei nuclei. L'efficacia del metodo, per quanto riguarda la preparazione di una sospensione cellulare vitale, è stata dimostrata eseguendo l'analisi CUT&RUN per le modificazioni degli istoni covalenti e i fattori di trascrizione. La qualità delle cellule isolate rende il metodo descritto particolarmente interessante per la preparazione della cromatina che cattura fedelmente lo stato di occupazione genomica nativa ed è probabile che sia adatta per catturare la conformazione cromosomica in combinazione con il sequenziamento ad alto rendimento in loci specifici (4C-seq) o a livelli a livello di genoma (Hi-C).

<table><tbody><tr><td>Microprovetta da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta da 2 mL</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 5 mL</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>anti-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anti-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K27ac</td><td>Motivo attivo</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K4me2</td><td>Motivo attivo</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anti-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anti-TER119</td><td>BD Pharmingen TM</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>Perline</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg; Plus Concanavalin A</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 & micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431752</tr><tr><td>Filtro cellulare 40 &; micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 70 & micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431751</tr><tr><td>Centrifuga 1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Centrifuga 5415 R</td></tr><tr><td>Centrifuga 2</td><td>Eppendorf</td><td>5805000010</td><td>Centrifuga 5804 R</td></tr><tr><td>Sistema di scorrimento a camera</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>Sistema me Nunc&trade; Laboratorio-Tek&commercio; Detergente per vetrini da camera</td></tr><tr><td></td><td>Sigma&nbsp; &nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>Collagenasi, tipo I</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>di dispasi</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD FACSAria& Citometro a flusso a fusione</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Browser del genoma&nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>Glicerolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Idrogel</td><td>Corning® &nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel matrice qualificata hESC</td></tr><tr><td>Software di elaborazione delle immagini</td><td>Image J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>Pellicola di laboratorio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>gallato di propile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Sequencer&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua agitante</td><td>Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo efficiente per l'analisi cut&amp;run di cellule satelliti di topo isolate da facs

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Le analisi dell'intero genoma con popolazioni di piccole cellule sono un vincolo importante per gli studi, in particolare nel campo delle cellule staminali. Questo lavoro descrive un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti dal muscolo dell'arto, un tessuto con un alto contenuto di proteine strutturali. I muscoli degli arti sezionati da topi adulti sono stati interrotti meccanicamente tritando in mezzo integrato con dispasi e collagenasi di tipo I. Al momento della digestione, l'omogenato è stato filtrato attraverso filtri cellulari e le cellule sono state sospese in un tampone FACS. La vitalità è stata determinata con una colorazione di vitalità fissabile e le cellule satelliti immunocolorate sono state isolate mediante FACS. Le cellule sono state lisate con Triton X-100 e i nuclei rilasciati sono stati legati a perle magnetiche di concanavalina A. I complessi nucleo/perla sono stati incubati con anticorpi contro il fattore di trascrizione o le modificazioni istoniche di interesse. Dopo i lavaggi, i complessi nucleo/microperla sono stati incubati con la proteina A-micrococcica nucleasi e la scissione della cromatina è stata iniziata con CaCl2. Dopo l'estrazione del DNA, sono state generate e sequenziate librerie e i profili per il legame del fattore di trascrizione a livello di genoma e le modifiche covalenti degli istoni sono stati ottenuti mediante analisi bioinformatica. I picchi ottenuti per i vari marcatori istonici hanno mostrato che gli eventi di legame erano specifici per le cellule satelliti. Inoltre, l'analisi dei motivi noti ha rivelato che il fattore di trascrizione era legato alla cromatina attraverso il suo elemento di risposta affine. Questo protocollo è quindi adattato per studiare la regolazione genica nelle cellule satelliti dei muscoli degli arti dei topi adulti.

Le cellule satelliti dei muscoli scheletrici del topo sono state isolate combinando i protocolli di Gunther et al. (di seguito Protocollo 1)12 e di Liu et al.23 (di seguito Protocollo 2). Poiché sono state osservate fibre muscolari non digerite dopo la digestione quando si utilizzava la concentrazione di collagenasi e dispasi proposta nel Protocollo 1, la quantità di enzimi è stata aumentata per migliorare la dissociazione delle fibre muscolari, come descritto nei passaggi ...

Di seguito viene presentato un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti di cellule di arto di topo (FACS) attivato dalla fluorescenza, adattato allo studio della regolazione della trascrizione nelle fibre muscolari mediante scissione sotto bersagli e rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN).

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&amp;RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Da oltre 20 anni, il nostro laboratorio si interessa al ruolo fisiopatologico dei recettori nucleari. Per decifrare la loro funzione in vivo, abbiamo ingegnerizzato un modello murino che consente il controllo spaziale e temporale della loro espressione. Parallelamente, abbiamo sviluppato tecniche all'avanguardia per studiare la loro funzione molecolare nei tessuti di topo.Il nostro interesse scientifico ci ha recentemente portato a determinare la segnalazione dei recettori secosteroidi e steroidei in vari tessuti, tra cui il muscolo scheletrico. Recentemente abbiamo dimostrato che il recettore degli androgeni nelle miofibre che differenziano le cellule del muscolo scheletrico è strumentale alle loro funzioni contrattili e metaboliche. I nostri recenti risultati forniscono una comprensione più profonda delle dinamiche fisiopatologiche del muscolo scheletrico che è fondamentale per sviluppare trattamenti efficaci per i disturbi associati ai muscoli.Abbiamo sviluppato questo protocollo per poter eseguire l'analisi del cistroma su cellule staminali muscolari in vivo. Tutti i protocolli precedenti utilizzavano modali in vitro, il che dissocia completamente l'indagine da un contesto di intero organismo. Oltre ad essere a basso costo ed efficiente in termini di tempo, questo protocollo fornisce un ambiente sperimentale efficace per studiare il reclutamento del fattore di trascrizione e il paesaggio della cromatina nelle cellule progenitrici del muscolo scheletrico.La cromatina preparata da questo protocollo ha fornito la prima analisi dell'intero genoma della cistroma AR nelle cellule satelliti e faciliterà i futuri studi sulla regolazione genica. Tra i tanti, il nostro obiettivo futuro sarebbe quello di estendere queste indagini ad altri recettori degli ososteroidi ed esplorare i loro specifici co-regolatori nei vari tipi di cellule coinvolte nel processo di rigenerazione nel muscolo scheletrico.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

L'isolamento e la coltura di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti, una popolazione di cellule staminali muscolari, è essenziale per la comprensione del muscolo biologia delle cellule staminali e rigenerazione, nonché trapianto di cellule staminali per terapie in distrofia muscolare e altre malattie degenerative.

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Il comportamento dei fibroblasti è alla base di uno spettro di entità cliniche, ma rimangono scarsamente caratterizzate, in gran parte a causa della loro intrinseca eterogeneità. La ricerca tradizionale sui fibroblasti si basa sulla manipolazione in vitro, mascherando il comportamento dei fibroblasti in vivo. Descriviamo un protocollo basato su FACS per l'isolamento di fibroblasti cutanei di topo che non richiede colture cellulari.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

CUT&amp;RUN e le sue varianti possono essere utilizzati per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina. Questo protocollo descrive come determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina utilizzando uliCUT&amp;RUN a singola cellula.

Localizzazione del fattore a cella singola sulla cromatina utilizzando la scissione di input ultra-bassa sotto i bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi

L'identificazione precisa delle cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) e delle cellule staminali muscolari (MuSC) è fondamentale per studiare la loro funzione biologica in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo fornisce linee guida per l'isolamento, la purificazione e la coltura di FAP e MuSC da muscoli di topo adulti.

FACS-isolamento e coltura di progenitori fibro-adipogeni e cellule staminali muscolari da muscolo scheletrico di topo imperturbato e ferito

I ricercatori che non conoscono il campo epigenetico troveranno CUT&amp;Tag un'alternativa significativamente più semplice ai saggi ChIP. CUT&amp;Tag ha apportato enormi benefici agli studi epigenetici su popolazioni cellulari rare e primarie, generando dati di alta qualità da pochissime cellule. Questo protocollo descrive l'esecuzione di saggi H3K4me1 CUT&amp;Tag su mioblasti di topo isolati dai muscoli degli arti posteriori di topo.

Utilizzo del test Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) nella ricerca sui mioblasti di topo

Questo protocollo descrive un saggio di giunzione delle estremità extracromosomiche non omologhe (NHEJ) e un saggio di ricombinazione omologa (HR) per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR nelle cellule HEK-293T.

Analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP

Per ottenere periciti corticali cerebrali di topo che soddisfano le esigenze dello scRNA-seq, presentiamo un protocollo FACS ottimizzato in modo critico basato sulla selezione CD13⁺/CD31⁻. I nostri principali perfezionamenti migliorano significativamente la vitalità cellulare e l'integrità dell'RNA, consentendo un profiling trascrittomico affidabile.

Isolamento dei periciti dal tessuto corticale del topo tramite FACS per il sequenziamento a singola cellula

Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per isolare e arricchire mioblasti primari da muscoli scheletrici di topo adulti e neonati attraverso dissociazione tissutale, filtrazione sequenziale, preplaccatura e condizioni di coltura definite, consentendo l'istituzione e il mantenimento di colture mioblastiche derivate da cellule satellitari per applicazioni sperimentali a valle.

Isolamento delle cellule satelliti muscolari scheletrici per studi in vitro sulla miogenesi

Scopri un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate tramite FACS. Questo metodo consente di studiare la regolazione trascrizionale nel muscolo scheletrico in vivo.

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

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